SH-SY5Y İnsan Nöroblastom Hücre Hattı Farklılaşma

Özet

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Özet

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Giriş

Vitro model sistemlerinde kullanma yeteneği büyük ölçüde nörobiyoloji ve nörolojik bilimler alanlarını artırmıştır. kültürde Hücreler hastalık ve enfeksiyon patolojisi anlamak ve ön uyuşturucu testi değerlendirmeleri gerçekleştirmek için, protein işlevsellik ve moleküler mekanizmalar yatan spesifik olayları karakterize etmek verimli bir platform sağlar. Nörobiyolojisinde, hücre kültürü modelleri arasında en önemli tipleri, örneğin, sıçan B35 hücreleri ^5, Neuro-2A, fare hücreleri ⁶ ve sıçan PC12 hücrelerinin ^{7 gibi} sıçan ve fareler ve nöroblastom hücre çizgilerinden türetilen primer nöron kültürleri içerir. Bu hücre çizgilerinin kullanımı önemli ölçüde alanı gelişmiş olmasına rağmen, insan olmayan hücreler ve doku tutulması ile ilgili çok sayıda karıştırıcı faktörler vardır. insanlara kıyasla bu anlayış türe özgü metabolik süreçlerde farklılıkları, hastalık tezahürü ve patogenezi fenotipleri içerir. Dikkat etmek de önemlidirkemirgen modellerinin sınırlamaları ve yollar kemirgenler ve insanlarda ^8-11 arasında korunmuştur anlayış önemini vurgulayarak fare ve insan gen ifadesi ve transkripsiyon faktörü sinyalizasyon arasında önemli farklılıklar, yeniden bulunmaktadır. Diğer N-tera-2 (NT2), insan teratokarsinoma hücre hattı ve uyarılabilir pluripotent kök hücreler (iPSCs) dahil olmak üzere insan nöronal hücre çizgilerinin kullanımı kullanmışlardır. Bu hücre hatları in vitro insan sistemler için iyi modeller sunar. Bununla birlikte, retinoik asit (RA) nöronları, astrositler oluşan karışık bir popülasyonda oluşmasına neden ve ek saflaştırma adımı gerektiren radyal glial ^hücreleri 12 ile NT2 hücre farklılaşması nöronların saf popülasyonları elde edildi. Buna ek olarak, NT2 hücre hücrelerin% 72 daha büyük 60 kromozomlu bir çok değişken karyotipe ¹³ göstermektedir. iPSCs farklı hücre hatları arasında farklılaşmasında değişkenlik göstermektedir ve farklılaşma etkinliğinde değişiklik gösterebilir ^14. Alternatiflerin güzelleştirmek için tutarlı ve tekrarlanabilir bir insan nöron hücresi modeli olması arzu edilen bir durumdur.

SH-SY5Y neuroblast benzeri hücreler, ebeveyn nöroblastoma hücre çizgisi SK-N-SH bir alt klon vardır. Parenteral hücre hatları neuroblast benzeri ve epitel benzeri hücreler ¹⁵ hem de içeren bir kemik iliği biyopsisinden 1970 üretilmiştir. SH-SY5Y hücreleri 47 kromozom içeren stabil karyotipe sahiptir ve farklı RA kullanımı dahil olmak üzere, mekanizma, forbol esterler ve beyin-türevi gibi belirli nörotrofinlerin çeşitli aracılığıyla, olgun insanlara özgü nöronlar bir neuroblast benzeri durumundan ayırt edilebilir nörotrofik faktör (BDNF). Önceki kanıtlar, farklı yöntemlerin kullanılması gibi adrenerjik, kolinerjik ve dopaminerjik nöronlar ^16,17 gibi belirli nöron alt tipleri için seçebileceğiniz düşündürmektedir. Bu ikinci yönü Nörobiyoloji deneyler bir çok yararlı SH-SY5Y hücreleri sağlar.

ontent "> Çeşitli çalışmalar onların farklılaşmamış ve farklılaştırılmış devletlerde SH-SY5Y hücreleri arasındaki önemli farklılıklar kaydetti. Zaman SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış, onlar hızla çoğalır ve çok az, kısa süreçleri, polarize olmayan gözükmektedir. Bunlar genellikle büyümek farklılaştırılmış olgunlaşmamış nöronların ^18,19 göstergesidir kümeleri ve ekspres belirteçleri., bu hücrelerin uzun kollara ayrılmış işlemleri, çoğalma azalma uzanır, ve bazı durumlarda ^2,18 polarize. farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, daha önce bir ifade gösterilmiştir büyüme-ilişkili protein (GAP-43), nöronal çekirdekleri (Neun), sinaptofizin (SYN), sinaptik vezikül proteini II (SV2), nöron spesifik enolaz (NSE) ve mikrotübül ilişkili protein (MAP) dahil olgun nöronlar farklı belirteçlerin çeşitli ^2,16,17,20, ve glial fibriller asidik protein (GFAP) ^{4 olarak} glial markerlerin ifadesi için geçerli değildir. SH-SY5Y hücreleri huk ayırt fazla desteklemeknt homojen bir nöronal nüfus, BDNF kaldırılması hücresel apoptoz ⁴ sonuçlanır. Bu farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin hayatta kalma nöronlar olgun benzer trofik faktöre bağlı olduğunu göstermektedir.

Subclone 1978 ³ yılında kurulmuştur beri SH-SY5Y hücrelerinin kullanımı artmıştır. Kullanımlarına bazı örnekler Parkinson hastalığı ^17, Alzheimer hastalığı ²¹ ve poliovirüsün ²² enterovirüs 71 (EV71) gibi viral enfeksiyon patogenezi ^23,24 soruşturma dahil , varicella-zoster virüsü (VZV), ^1, insan sitomegalovirüs ^25, ve herpes simpleks virüsü (HSV) ^2,26. Özellikle neurovirology ^27-36 alanında, SH-SY5Y hücreleri farklılaşmamış formunda bu hücreleri kullandık kullanarak bu çeşitli çalışmalar dikkat etmek önemlidir. ayırt SH-SY5Y hücrelerinin karşılık farklılaşmamış gözlenen fenotipin fark whe sorusunu gündeme getirmektedirTher enfeksiyon gözlenen ilerleme olgun farklılaştırılmış nöronlar farklı olurdu. Örneğin, farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri, HSV bağlanan ve farklılaşmamış SH-SY5Y hücrelerinin ² giriş modüle yüzeyi reseptörlerinin olmaması olabilir farklılaşmamış, prolifere olan SH-SY5Y hücrelerinin karşı, HSV-1 alımı, daha yüksek bir verimliliğe sahiptir. In vitro nöronları test odaklı bir deney tasarımı, SH-SY5Y hücreleri in vivo modeller için çeviri ve karşılaştırma için en doğru sonuçlar elde etmek için farklılaştırılması gerektiğini bu nedenle önemlidir.

insan nöronal kültürlerin üretmek için güvenilir bir yöntem geliştirme araştırmacılar doğru insan sinir sistemini modellemek öteleme deneyler gerçekleştirmek için izin zorunludur. Burada sunulan protokol farklılaşmış insan nöronlar için zenginleştirmek için önceki yöntemlerden ^1-4 türetilen en iyi uygulamaları delineates bir işlemdirretinoik asit.

Protokol

1. Genel Hususlar

1. Gerekli reaktiflerin listesi için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. sıkı aseptik koşullarda tüm adımları uygulayın.
2. FBS içeren tüm ortam preparasyonlar için ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (hiFBS) kullanın. Isı ile inaktive edilmesi için, her 10 dakikada bir ters çevrilerek 30 dakika için 56 ° C'de FBS, 50 ml'lik bir şişe sıcak (ayrıca Tablo 1 e bakınız).
   Not: FBS ısı inaktive edilmeden kullanıldığında, epitel benzeri fenotip SH-SY5Y hücrelerinin kültürleri içinde daha hızlı bir şekilde ilerler.
3. Kullanımdan önce, ortam ısınmaya bırakılmış ve her adımda önce uygun bir pH dengesini oluşturmak için bir kuluçka makinesi içinde dengelenmeye gelmeye bırakın. Örnek olarak, ortam, 50 ml tam dengelenmeye yaklaşık bir saat sürer (pH 7, 37 ° C,% 5 _CO2).
   Not: Bu protokol, tripsinize edilmiş ve yeniden kaplanacak kısmen farklılaşmış SH-SY5Y hücreleri gerektiren iki aşamalı bir ayırma prosedürü kullanılır. Bu stresliBu son derece kırılgan hücreler için süreç. Nedenle, en az zaman miktarı için tripsin hücreleri inkübe etmek önemlidir. Bu hala çanak bağlı epitel benzeri hücreleri bırakarak nöronların tercihli bir hareket başlangıcı sağlayacaktır.
4. yavaş yavaş hücreleri içeren konik tüp alt karşı ucu ile 10 ml plastik pipet ile farklılaşmış hücrelerin öğütme gerçekleştirin. yukarı ve aşağı hayır, yavaş hızda daha fazla beş kez öğütme gerçekleştirin.

SH-SY5Y Bakım Kültürlerin 2. Passage

1. Hücreler% 70-80 birikime ulaşmış ve 10 ila 15 pasajlar aşmamaktadır bölünmüş bakım kültürleri. Kültürler, tipik olarak (varsayarak kültürler bölme sırasında 5 kat daha seyreltildi değildir) her 3-5 günde geçirilmiş olması gerekir.
2. T-75 balonuna geçişin hücreleri, ardından PBS 1X yaklaşık 10 ml ile yıkayın, ortam aspire.
   Not: SH-SY5Y bakım kültürleri fu yarma önermiyoruz1'den rther: 5 Pasajlanması sırasında bu hücreler düşük confluency nedeniyle ölmesine neden olabilir, çünkü.
3. PBS aspire ve daha sonra 2.5 ml% 0.05 tripsin-EDTA (1 x) ekleyin.
4. inkübatör 2-3 dakika içinde inkübe ve balonun yüzeyindeki hücrelerin serbest bırakmak için yavaşça ucu.
5. 10 ml temel büyüme ortamında ekleyin (bakınız Tablo 2) ve 1-2 kez Karışım.
6. 1000 xg'de 2 dakika aşağı Spin, aspirat medya, daha sonra 5 ml Temel Büyüme Medya pelletini.
7. T-75 balonuna normal kaplama için 20 ml'lik bir toplam hacim içinde 5 veya farklılaşması (Bölüm 5) saymak ve plaka: 1 ila 3: 1 hücreleri ile seyreltilir.

3. Dondurucu SH-SY5Y hücreleri

1. % 5 (h / h) DMSO ile desteklenmiş temel büyüme ortamında SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin erken pasajlar dondurun.
2. Başlangıçta, 24 saat süre ile, -80 ° C'de alikot sonra dondurularak uzun süreli depolama için sıvı azot transfer.
   Not: Başvuru için konfluent (% 75-85), T-75 şişesi beş verecektirdondurma için SH-SY5Y hücrelerinin 1 ml'lik eş payları. Bu alikotları her biri toplam bir yerde 2-5 milyon hücre içermelidir.

4. Çözülme ve Kültür ayrım yapılmamış SH-SY5Y Nöroblastom Hücreleri

1. Temel Büyüme Medya hazırlayın.
2. Hızla bir 37 ° C su banyosu (yaklaşık 2 dakika) donmuş hücrelerini eritin.
3. 15 ml konik bir tüp içinde 9 ml temel büyüme ortamında yeniden süspanse hücreleri ve daha sonra 1,000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüjlenir.
4. Süpernatant aspire 10 ml Temel Büyüme Medya pelet hücreleri, ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri rahatsız etmemek için dikkatli olurken.
5. T-25 balonuna veya 60 mm ² tabağa plaka hücreleri.
6. Ertesi gün, ölü hücreleri çıkarmak için ortamı değiştirin.

5. Gün: 0 Farklılaşma için Kaplama Hücreler

1. Farklılaşma programı için Bkz: Şekil 1.
2. 1x PBS, aspirat ile farklılaşmamış hücreler durulayın ve sonra 1-2 ml ısındı kullanarak trypsinize1x% 0.05 Tripsin-EDTA.
3. Hücreler tripsin içinde olduğunda, bir kuluçka makinesi içinde, yaklaşık 3 dakika boyunca inkübe edin.
4. , 10 ml Temel Büyüme Medya ekleyerek tripsin Quench şişeye ya da yemeğin kenarlarını durulayın ve nazikçe 1-3 kez çiğnemek. 15 ml konik tüp içeriği aktarın.
5. pelet rahatsız etmemek için dikkatli olurken 1,000 xg'de 2 dakika süreyle santrifüj ve medya aspire.
6. Süspanse 5 ml Temel Büyüme Medya pelet ve 1-3 kez çiğnemek.
7. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak, sonra / ml 50,000 hücrelere Temel Büyüme Medya kullanarak sulandırmak.
8. Plaka 2 çanak başına 100,000 hücre toplam 35 ^mm2 çanak başına hücre ml tekrar inkübatör içine yerleştirin.

6. Gün 1: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1)

1. Farklılaşma Ortam # 1 kısım 50 mi (bakınız Tablo 2) ve 37 ° C su banyosu içinde inkübe edilir.
2. Ortam ısıtıldı olduğunda, (bir kuluçka makinesi içinde dengelenmeye 37 sağlar° _C,% 5 CO2), en azından bir saat için, kullanımdan önce uygun bir pH dengesini kurmak.
3. Retinoik Asit (RA) ekleyin hemen yemekleri medya eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1).
   Not: Retinoik asit ışığa duyarlı ve 4 ° C'de koyu renkli şişelerde muhafaza edilmelidir
4. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
5. 35 mm ² tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 1. ekleyin ve inkübatör dönmek.

7. Gün 3: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1)

1. Tekrarlama Bölüm 6 (1-5 adımlar)

8. Gün 5: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 1)

1. Tekrarlama Bölüm 6 (1-5 adımlar)

9. Gün 7: Hücreleri Böl 1: 1

1. RA ısındı ekle ve hemen yemekleri medyayı eklemeden önce Farklılaşma Medya 1. dengelenmiş.
2. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
3. 200 ul ekle35 mm ² tabak başına% 0.05 1x tripsin EDTA ısındı ve yaklaşık 2-3 dakika ya da hücrelere kadar gözle görülür bir mikroskop altında gözlenen olarak plaka kaldırılır inkübatör sıcak.
4. 35 mm ² tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 1. ekleyerek tripsin Quench ve plaka kapalı nöronal hücrelerin kalan durulama ortam kullanın. Daha sonra, 50 ml konik tüp içeriğini aktarın.
   Not: trypsinization aşamaları sırasında, aynı anda çok sayıda yemekleri trypsinize yok. Bu sitotoksik olabilir, nöronal kültürler için çok uzun tripsin inkübe değildir sağlamaya yardımcı olur.
5. 50 ml konik tüp içinde 10 kadar yemekler birleştirin ve yavaşça yukarı ve en fazla beş kez aşağı 10 ml plastik pipet ile yavaş yavaş çiğnemek.
6. Kısım 2 ml hücre taze 35 mm ² kaplarına süspansiyon ve inkübatör dönmek.

10. 8. Gün: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 2)

1. RA ekleyin (bkz Tablo 1) ısıtılır ve hemen yemekleri medyayı eklemeden önce medyayı dengelenmiş için.
2. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
3. Yavaşça 2 ml farklılaşma medya # 2 (bakınız Tablo 2) ekleyin 35 mm ² çanak ve inkübatör dönüş başına RA. izin verme nöronlar, hızlı bir şekilde kuru gibi uzun bir süre boyunca havaya maruz.

11. Gün 9: Ekstrasellüler Matrix (ECM) hazırlayın Kaplı Yemekleri

1. buz üzerinde ECM çözümün bir şişe çözülme ve 1 sulandırmak: 100 soğuk DMEM içine.
2. Her 35 mm ² çanak içine karışımı 2 ml dağıtın ve yemeğin tüm baz kaplı olduğundan emin olun.
3. Bir inkübatör içerisinde yer (37 ° _C,% 5 CO2), 1 saat veya gece boyunca.
4. Aspire karışımı ve başlıkta yaklaşık olarak 1 saat süre ile kurumaya bırakın. en fazla 2 ay boyunca oda sıcaklığında saklayınız.

12. Gün 10: Aktarım Hücreler üzerineECM ile kaplı levhalar 1: 1

1. RA ekle hemen yemekleri medyayı eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1).
2. Yavaşça medya aspire ve atın.
3. Her 35 ^mm2 çanak tripsin ısıtıldı 200 ul ilave edin ve yaklaşık 1-2 dakika boyunca ya da nöronlar gözle mikroskop altında görüldüğü gibi, çanak kaldırılıncaya kadar oda sıcaklığında inkübe edin.
   Not: tripsin ile nöronların aşırı-inkübe ve hasara neden olmamak için oda sıcaklığında bu trypsinization adımı yürütün. Nöronlar bu aşamada epitel benzeri hücreler çok daha hızlı plakaları bırakın.
4. 35 mm ² tabak başına 2 ml Farklılaşma Medya 2. ekleyerek tripsin gidermek ve plaka kapalı nöronal hücrelerin kalan durulama ortam kullanın. Daha sonra, 50 ml konik tüp içeriğini aktarın.
5. 50 ml konik tüp içinde 10 kadar yemekler birleştirin ve yavaşça yukarı ve sahip en fazla beş kez aşağı yavaşça çiğnemek10 ml'lik plastik pipet.
6. ECM-kaplı 35 ^mm 2 yemekleri içine 2 ml hücre süspansiyonu koyun ve inkübatör dönmek.

13. Gün 11: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 3)

1. RA ekle hemen yemekleri medyayı eklemeden önce ısındı ve dengelenmiş medya (Tablo 1).
2. Yavaşça eski medya aspire ve atın.
3. Yavaşça 35 mm ² tabak başına RA 2 ml Farklılaşma Medya 3. (bakınız Tablo 2) ekleyin ve inkübatör dönmek. izin verme nöronlar uzun bir süre boyunca havaya maruz.

14. Gün 14: Değişim Medya (Farklılaşma Medya # 3)

1. Tekrarlama Bölüm 13 (1-3 arasındaki adımları)

15. Gün 17: Son Medya Değişimi (Farklılaşma Medya # 3)

1. Tekrarlama Bölüm 13 (1-3 arasındaki adımları)

16. Gün 18: Kullanıma Hazır Nöronal Kültürleri

1. Taze Diff bir ortam3 günde RA, farklılık yaratmak Medya 3. nöron sağlığını korumak için.
   Hücreler nöronlar içine ayırt edilmelidir ve nöronal fenotip sergilerler Not:. Kültürler, terminal farklılaşma, aşağıdaki sonra 14 gün boyunca, tipik olarak stabil, nöron canlılığının Ancak süresi farklılaşma başlangıcında farklılaşmamış hücreler geçiş sayısına bağlıdır. Daha yüksek geçiş sayıları kısa kullanım ömrü ile farklı nöronların verim.

Sonuçlar

Şu anda, bu tür olan optimum viral alımı ² olarak farklılaşmamış SH-SY5Y hücreleri önemlisi, farklılaşmamış hücreler olmayabilir insan nöronlar ^27-36 ve fenotipleri için fonksiyonel bir model olarak kullanılmakta olan nörobiyoloji ve neurovirology alanında birçok örnekleri vardır doğru yorumlanması için gerekli. In vitro nöronal sistem SH-SY5Y hücreleri kullanılarak ya da başka bir zaman, hücreler uygun bir şekilde, in vivo nöron meydana olabilir n...

Tartışmalar

Yukarıdaki protokol homojen ve uygun bir insan nöronal kültürler meydana getirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu protokol teknikleri ve her birinin en iyi uygulamaları tanımlamak için birkaç daha önce yayınlanmış yöntemler ^1-4 ve amaçlarını entegre uygulamaları kullanır. SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşması kademeli serum yoksunluğu dayanır; retinoik asit, nörotrofik faktörler ve hücre dışı matris proteinlerinin eklenmesi; ve seri yarma farklılaşmış olgu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	-
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	-
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	-
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	-
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	-