Differenzierung der SH-SY5Y humanen Neuroblastom-Zelllinie

Zusammenfassung

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Zusammenfassung

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Einleitung

Die Fähigkeit, in vitro Modellsysteme zu verwenden, hat sich stark verbessert den Bereichen Neurobiologie und Neurowissenschaften. Zellen in Kultur bieten eine effiziente Plattform Proteinfunktionalität und molekularen Mechanismen der spezifischen Phänomene zu verstehen, die Pathologie der Krankheit und Infektion zu charakterisieren, und die vorläufigen Testarzneimittelprüfungen durchzuführen. In der Neurobiologie umfassen die wichtigsten Arten von Zellkulturmodellen abgeleitet primären neuronalen Kulturen von Ratten und Mäusen, und Neuroblastom-Zelllinien, wie Ratte B35-Zellen ^5, Neuro-2A Mauszellen ⁶ und Ratten-PC12-Zellen ^7. Obwohl die Verwendung solcher Zelllinien signifikant die Feld fortgeschritten ist, gibt es mehrere Störfaktoren, die mit Umgang mit nicht-menschlichen Zellen und Gewebe. Dazu gehören Verständnis speziesspezifische Unterschiede in Stoffwechselprozessen, Phänotypen von Krankheitsmanifestation und Pathogenese bei Anwendung im Menschen verglichen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass dieRe gibt erhebliche Unterschiede zwischen Maus und Mensch Genexpression und Transkriptionsfaktor-Signalisierung, Hervorhebung der Einschränkungen von Tiermodellen und die Bedeutung des Verstehens, die Wege zwischen Nagern und Menschen ^11.08 konserviert sind. Andere haben die Verwendung von humanen neuronalen Zelllinien, einschließlich der N-Tera-2 (NT2) menschlichen Teratokarzinom Zelllinie und induzierbare pluripotente Stammzellen (iPS) eingesetzt. Diese Zelllinien sorgen für gute Modelle für die in vitro menschliche Systeme. Jedoch Differenzierung von NT2-Zellen mit Retinsäure (RA) führt zur Erzeugung eines gemischten Population von Neuronen, Astrozyten und radialer Gliazellen ^12, einen zusätzlichen Reinigungsschritt notwendig, um reine Populationen von Neuronen erhalten. Zusätzlich zeigen NT2 Zellen eine sehr variable Karyotyp ^13, wobei mehr als 60-Chromosomen in 72% der Zellen. iPS-Zellen zeigen Variabilität bei der Differenzierung zwischen verschiedenen Zelllinien und variieren in der Differenzierung Effizienz ^14. Es ist daher wünschenswert, eine konsistente und reproduzierbare humanen neuronalen Zellmodell zu haben diese Alternativen ergänzen.

SH-SY5Y Neuroblasten-ähnlichen Zellen sind ein Subklon des Eltern Neuroblastom-Zelllinie SK-N-SH. Die Elternzelllinie wurde im Jahr 1970 von einer Knochenmarkbiopsie erzeugt, die ¹⁵ beide Neuroblast artig und Epithel-ähnlichen Zellen enthält. SH-SY5Y-Zellen haben einen stabilen Karyotyp, bestehend aus 47-Chromosomen, und kann von einer Neuroblasten artigen Zustand zu reifen menschlichen Nervenzellen durch eine Vielzahl verschiedener Mechanismen, einschließlich der Verwendung von RA, Phorbolester, und spezifische Neurotrophine wie Gehirn stamm unterscheiden neurotrophic factor (BDNF). Vor deutet darauf hin, dass die Verwendung verschiedener Methoden zur spezifischen Neuronen Subtypen wie adrenergen auswählen, cholinergen und dopaminergen Neuronen ^16,17. Dieser letztere Aspekt macht SH-SY5Y-Zellen, die für eine Vielzahl von neurobiologischen Experimenten.

ontent "> Mehrere Studien haben wichtige Unterschiede zwischen SH-SY5Y-Zellen in ihrem undifferenzierten und differenzierten Zuständen festgestellt. Wenn SH-SY5Y-Zellen sind undifferenziert, sie vermehren sich und treten schnell unpolarisierten zu sein, mit sehr wenigen, kurzen Prozessen. Sie wachsen häufig in Klumpen und express Marker indikativ für unreife Neuronen ^18,19. Wenn differenziert, erstrecken sich diese Zellen lang, verzweigt Prozesse, Verminderung der Zellproliferation, und in einigen Fällen polarisieren ^2,18. ausdifferenzierten SH-SY5Y-Zellen zuvor gezeigt wurde, ein auszudrücken Vielzahl von verschiedenen Markern von reifen Nervenzellen, einschließlich des Wachstums-assoziierten Protein (GAP-43), neuronale Zellkerne (NeuN), Synaptophysin (SYN), synaptischen Vesikel Protein II (SV2), Neuron spezifische Enolase (NSE) und Mikrotubuli-assoziierten Protein (MAP) ^{2,16,17,20 und 4} die Expression von glial Marker wie glial fibrillary acidic protein (GFAP) fehlt. In weiteren Unterstützung, die SH-SY5Y-Zellen differenziert represent eine homogene neuronalen Population, die Entfernung von BDNF führt zu zellulären Apoptose ^4. Dies deutet darauf hin, dass das Überleben von differenzierten SH-SY5Y-Zellen auf trophischen Faktoren abhängig ist, ähnlich Neuronen zu reifen.

Verwendung von SH-SY5Y-Zellen erhöht ist, seit der Subklon 1978 ³ hergestellt wurde. Einige Beispiele für deren Verwendung umfassen Untersuchung Parkinson-Krankheit ^17, Alzheimer-Krankheit ^{21 und die} Pathogenese von viralen Infektionen einschließlich Poliovirus ^22, Enterovirus 71 (EV71) ^23,24 , Varicella-Zoster-Virus ^{(VZV) 1,} humanen Cytomegalovirus ^{25 und} Herpes simplex-Virus (HSV) ^2,26. Es ist wichtig, dass mehrere Studien unter Verwendung von SH-SY5Y-Zellen, diese Zellen in ihrem undifferenzierten Form verwendet zu beachten, vor allem im Bereich der neurovirology ^27-36. Der Unterschied in der beobachteten Phänotyp von undifferenzierten gegenüber differenzierten SH-SY5Y-Zellen wirft die Frage auf whether die beobachtete Fortschreiten der Infektion würde in reifen differenzierten Neuronen unterschiedlich sein. Beispielsweise unterscheiden SH-SY5Y-Zellen haben einen höheren Wirkungsgrad von HSV-1 Aufnahme gegen die undifferenzierten, SH-SY5Y-Zellen vermehren, was zu einem Mangel an Oberflächenrezeptoren zurückzuführen sein kann, die HSV binden und modulieren Eintrag der undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen ^2. Es ist daher wichtig, dass, wenn ein Experiment zum Testen Neuronen in vitro fokussiert Gestaltung, SH-SY5Y-Zellen, um differenziert werden die genauesten Ergebnisse für die Übersetzung und Vergleich zu in vivo-Modelle zu erhalten.

Die Entwicklung einer zuverlässigen Methode humanen neuronalen Kulturen zu erzeugen ist zwingend notwendig Forscher zu ermöglichen Translationsexperimente durchzuführen, die genau den menschlichen Nervensystems modellieren. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein Verfahren, das beste Verfahren der vorangegangenen Methoden ^4.1 zu bereichern für den menschlichen Neuronen abgrenzt, die differenziert werdenVerwendung von Retinsäure.

Protokoll

1. Allgemeine Überlegungen

1. Siehe Tabelle der Werkstoffe / Ausrüstung für eine Liste der notwendigen Reagenzien. Führen Sie alle Schritte unter strengen aseptischen Bedingungen.
2. Verwenden hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (hiFBS) für alle Medien Zubereitungen, die FBS enthalten. Zu erwärmen-Inaktivierung bei 56 ° C für 30 min ein 50 ml Aliquot von FBS erwärmen, alle 10 min invertierenden (siehe auch Tabelle 1).
   Hinweis: Wenn FBS ohne Hitzeinaktivierung verwendet wird, die epithelial-ähnlichen Phänotyp schneller ganzen Kulturen von SH-SY5Y-Zellen fortschreitet.
3. Vor dem Gebrauch, um die Medien in einem Inkubator zu wärmen und Gleichgewicht vor jedem Schritt eine richtige pH-Gleichgewicht zu schaffen. Beispielsweise 50 ml Medium dauert etwa eine Stunde vollständig äquilibrieren (pH 7, 37 ° C, 5% CO _2).
   Hinweis: Dieses Protokoll verwendet ein zweistufiges Verfahren, das teilweise Aufspaltung differenzierten SH-SY5Y-Zellen benötigt werden mit Trypsin behandelt und erneut plattiert. Dies ist eine stressigeVerfahren für diese außerordentlich zerbrechlich Zellen. Daher ist es wichtig, die Zellen in Trypsin für eine minimale Zeitdauer inkubiert. Dies wird für die bevorzugte Abheben von Neuronen, so dass epithelial-ähnlichen Zellen noch an der Schale befestigt ermöglichen.
4. Führen Verreiben von differenzierten Zellen langsam mit einer 10 ml Kunststoffpipette mit der Spitze gegen den Boden des konischen Rohrs mit den Zellen. Führen Verreiben mit einer langsamen Geschwindigkeit, nach oben und unten nicht mehr als das Fünffache.

2. Durchgang von SH-SY5Y Wartung Kulturen

1. Split Wartung Kulturen, wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreicht haben, und nicht mehr als 10 bis 15 Passagen. Kulturen müssen in der Regel alle 3-5 Tage passagiert werden (vorausgesetzt, Kulturen werden nicht mehr als 5-fach beim Spalten verwässert).
2. Um Durchgang Zellen aus einem T-75-Kolben, absaugen Medien ab, dann mit ca. 10 ml 1x PBS spülen.
   Hinweis: Wir empfehlen nicht, die SH-SY5Y Wartung Kulturen fu Aufspaltungeitere als 1: 5 während der Passagierung da dies die Zellen verursachen aufgrund der niedrigen Konfluenz zu sterben.
3. Absaugen PBS, und fügen Sie 2,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA (1x).
4. Inkubieren in Inkubator 2-3 min und Spitze sanft Zellen von der Oberfläche des Kolbens freizugeben.
5. In 10 ml Basiswachstumsmedien (siehe Tabelle 2) und verreiben 1-2 mal.
6. Spin down für 2 min bei 1000 · g, absaugen Medien, dann Pellet in 5 ml Basiswachstumsmedien.
7. Verdünnen Zellen von 1: 3 bis 1: 5 in einem Gesamtvolumen von 20 ml für normale Beschichtung in T-75-Kolben, oder zählen und Platte für Differenzierung (Kapitel 5).

3. Einfrieren SH-SY5Y-Zellen

1. Einfrieren frühen Passagen von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen in Basic Wachstumsmedien, ergänzt mit 5% (v / v) DMSO.
2. Zunächst einfrieren Aliquots bei -80 ° C für 24 Stunden, dann Transfer zum flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung.
   Hinweis: Als Referenz wurde ein konfluenter (75-85%) T-75-Kolben wird fünf Ausbeute1 ml Aliquots von SH-SY5Y-Zellen zum Einfrieren. Jeder dieser Teilmengen sollten überall 2-5 Millionen Zellen insgesamt enthalten.

4. auftauen und Kultur Undifferenzierte SH-SY5Y Neuroblastomzellen

1. Bereiten Grundwachstumsmedien.
2. Auftauen schnell gefrorenen Zellen in einem 37 ° C Wasserbad (ca. 2 min).
3. Die Zellen in 9 ml Grundwachstumsmedien in einem 15 ml konischen Röhrchen, und dann 2 min bei 1.000 x g zentrifugiert.
4. Saugen Sie den Überstand, während man aufpassen, nicht die pelletierten Zellen zu stören, und sanft resuspendieren Zellen in 10 ml Basiswachstumsmedien.
5. Platte Zellen auf einem T-25-Kolben oder 60 mm ² Gericht.
6. Am nächsten Tag ersetzen Medien toten Zellen zu entfernen.

5. Tag 0: Plating Cells für Differenzierung

1. Siehe Abbildung 1 für die Differenzierung Zeitplan.
2. Spülen undifferenzierten Zellen mit 1x PBS, absaugen und dann trypsinize mit 1-2 ml erwärmt1x 0,05% Trypsin-EDTA.
3. Wenn Zellen in Trypsin sind, für ca. 3 min in einem Inkubator inkubiert.
4. Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 10 ml Basiswachstumsmedien, spülen Sie die Seiten der Flasche oder Schale, und verreiben sanft 1-3 mal. Übertragen Inhalt in einen 15 ml konischen Röhrchen.
5. Zentrifuge für 2 min bei 1000 · g, und die Medien anzusaugen, während man aufpassen, nicht das Pellet zu stören.
6. Pellet in 5 ml Basiswachstumsmedien und verreiben 1-3 mal.
7. Zählen von Zellen eine Zählkammer, verdünnte dann Grundwachstumsmedien zu 50.000 Zellen / ml verwendet wird.
8. Plate 2 ml Zellen pro ^{35 mm 2} Gericht für eine Gesamtmenge von 100.000 Zellen pro Schale und legen Sie wieder in Inkubator.

6. Tag 1: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1)

1. Aliquoten 50 ml Differenzierung Medien # 1 (siehe Tabelle 2) und in einem 37 ° C Wasserbad inkubiert.
2. Wenn Medien erwärmt wird, damit sie in einem Inkubator ins Gleichgewicht (37° C, _{5% CO 2)} für mindestens eine Stunde eine richtige pH-Gleichgewicht vor der Verwendung herzustellen.
3. In Retinsäure (RA) (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
   Anmerkung: Retinsäure ist lichtempfindlich und sollten in dunklen Flaschen bei 4 ° C gelagert werden
4. absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
5. 2 ml Differenzierung Medien # 1 mit RA pro ^{35 mm 2} Gericht und zurück zum Inkubator.

7. Tag 3: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1)

1. Wiederholen Sie Abschnitt 6 (Schritte 1-5)

8. Tag 5: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1)

1. Wiederholen Sie Abschnitt 6 (Schritte 1-5)

9. Tag 7: Split Cells 1: 1

1. In RA erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Differenzierung Medien # 1 unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
2. absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
3. In 200 ulerwärmt 0,05% Trypsin EDTA 1x pro ^{35 mm 2} Schüssel und warm in Inkubator etwa 2-3 min oder bis die Zellen von der Platte abgehoben sichtbar sind, wie unter einem Mikroskop beobachtet.
4. Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 2 ml Differenzierung Medien # 1 mit RA pro ^{35 mm 2} Gericht und mit den Medien verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Dann übertragen Inhalt auf eine 50 ml konischen Röhrchen.
   Hinweis: Während der Trypsinierung Schritte, nicht trypsinize nicht zu viele Gerichte auf einmal. Dies hilft neuronalen Kulturen zu gewährleisten, nicht zu lange in Trypsin inkubiert, die cytotoxisch sein können.
5. Kombinieren Sie Inhalte von bis zu 10 Gerichte in der 50 ml konischen Röhrchen und sanft verreiben langsam nach oben und unten nicht mehr als fünf Mal mit einem 10-ml-Plastikpipette.
6. Aliquoten 2 ml Zellsuspension in frischem ^{35 mm 2} Geschirr und zurück zum Inkubator.

10. Tag 8: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 2)

1. In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und Medien sofort ins Gleichgewicht gebracht, bevor Medien zu Gerichten hinzuzufügen.
2. absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
3. Langsam 2 ml Differenzierung Medien # 2 (siehe Tabelle 2) mit RA pro ^{35 mm 2} Schüssel und Rückkehr zum Inkubator. Nicht in die Neuronen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden, da sie schnell austrocknen kann.

11. Tag 9: Bereiten extrazellulären Matrix (ECM) beschichteten Schalen

1. Tauwetter ein Fläschchen von ECM-Lösung auf Eis und verdünnen 1: 100 in kaltes DMEM.
2. Dispense 2 ml Mischung in jedem ^{35 mm 2} Schüssel und sicherzustellen, dass das gesamte Boden der Schale bedeckt ist.
3. In einem Inkubator (37 ° C, 5% _{CO 2)} für 1 h oder über Nacht.
4. Saugen Sie Mischung und lassen für etwa 1 Stunde in einer Haube an der Luft trocknen. Bei einer Raumtemperatur für bis zu 2 Monate.

12. Tag 10: Transfer Zellen aufECM-beschichtete Platten 1: 1

1. In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
2. vorsichtig absaugen aus Medien und entsorgen.
3. Zugabe von 200 & mgr; l Trypsin zu jedem erwärmt ^{35 mm 2} Schüssel und erlauben etwa 1-2 min bei Raumtemperatur inkubiert oder bis Neuronen werden sichtbar aus der Schale gehoben, wie unter einem Mikroskop beobachtet.
   Hinweis: Führen Sie diese Trypsinierung Schritt bei Raumtemperatur, um nicht zu über brüten Neuronen mit Trypsin und Schäden verursachen. Neuronen Freisetzung aus Platten viel schneller als epithelial-ähnlichen Zellen in diesem Stadium.
4. Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 2 ml Differenzierung Medien # 2 pro ^{35 mm 2} Gericht und die Medien nutzen verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Dann übertragen Inhalt auf eine 50 ml konischen Röhrchen.
5. Kombinieren Sie Inhalte von bis zu 10 Gerichte in der 50 ml konischen Röhrchen und sanft verreiben langsam nach oben und unten nicht mehr als fünf mal mitein 10-ml-Plastikpipette.
6. Dispense 2 ml Zellsuspension in ECM-beschichtete ^{35 mm 2} Geschirr und zurück zum Inkubator.

13. Tag 11: Änderung Medien (Differenzierung Medien # 3)

1. In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten.
2. absaugen sanft alten Medien und entsorgen.
3. Langsam 2 ml Differenzierung Medien # 3 (siehe Tabelle 2) mit RA pro ^{35 mm 2} Gericht und zurück zum Inkubator. Nicht in die Neuronen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden.

14. Tag 14: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 3)

1. Wiederholen Sie Abschnitt 13 (Schritte 1-3)

15. Tag 17: Letzte Medienwechsel (Differenzierung Medien # 3)

1. Wiederholen Sie Abschnitt 13 (Schritte 1-3)

16. Tag 18: Neuronale Kulturen gebrauchsfertig

1. Ändern Medien an die frische Differentiation Medien # 3 mit RA alle 3 Tage Neuron Gesundheit zu erhalten.
   Hinweis: Die Zellen in Neurone differenziert werden sollte, und weisen einen neuronalen Phänotyp. Kulturen typischerweise stabil für bis zu 14 Tage nach der terminalen Differenzierung jedoch Dauer Neuron Lebensfähigkeit hängt von Passagezahl der undifferenzierten Zellen zu Beginn der Differenzierung. Höhere Durchgang Zahlen ergeben differenzierten Neuronen mit einer kürzeren Lebensdauer.

Ergebnisse

Derzeit gibt es viele Fälle auf dem Gebiet der Neurobiologie und neurovirology wo undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen als Funktionsmuster für den menschlichen Neuronen verwendet werden ^27-36, und wichtiger ist, kann undifferenzierten Zellen Phänotypen fehlt wie eine optimale Virusaufnahme ^2, die notwendig für eine genaue Interpretation. Es ist wichtig, dass, wenn SH-SY5Y-Zellen oder andere in vitro neuronale System werden die Zellen in geeigneter Weise in Neurone differenziert, um Daten z...

Diskussion

Das obige Protokoll bietet eine einfache und reproduzierbare Methode homogene und lebensfähigen humanen neuronalen Kulturen zu erzeugen. Dieses Protokoll nutzt Techniken und Praktiken, die mehrere zuvor veröffentlichten Methoden ^4.1 und Ziele integrieren, um die besten Praktiken der einzelnen zu beschreiben. Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen beruht auf allmähliche Serumentzug; die Zugabe von Retinsäure, neurotrophen Faktoren und extrazellulären Matrixproteinen; und Serien Spaltung für differenzierte re...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	-
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	-
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	-
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	-
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	-