בידול של הקו הסלולרי SH-SY5Y האדם נוירובלסטומה

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

היכולת להשתמש במערכות מודל במבחנה שיפרה מאוד בתחומי נוירוביולוגיה מדעי המוח. תאים בתרבית לספק פלטפורמה יעילה לאפיין פונקציונליות חלבון מנגנונים מולקולרי תופעות ספציפיות בסיסיות, להבין את הפתולוגיה של מחלות וזיהומים, וכדי לבצע הערכות בדיקות סמים ראשוניות. בנוירוביולוגיה, הסוגים העיקריים של מודלי תרבית תאים כוללים תרבויות עצביות עיקריות נגזרו חולדות ועכברים, שורות תאי נוירובלסטומה כגון תאי העכברוש B35 ^5, בתאים עכבר נוירו-2A ^6, ותאי PC12 עכברוש ^7. למרות השימוש של שורות תאים כאלה התקדמה בתחום מזה, אך קיימים מספר גורמים מבלבלים הקשורים בטיפול הלא-אנושי תאים ורקמות. אלה כולל מינים ספציפי הבנת הבדלים בתהליכי חילוף חומרים, פנוטיפים של ביטוי מחלה, בפתוגנזה בהשוואה לבני אדם. כמו כן, חשוב לציין כימחדש הבדלים משמעותיים בין עכבר ביטוי גנים אנושיים ואיתות גורם שעתוק, המדגישות את המגבלות של מודלים מכרסמים ואת החשיבות של הבנה אשר מסלולים שמורה בין מכרסמים ובני אדם ^8-11. אחרים המועסקים השימוש של שורות תאים עצביים האנושי כולל N-Tera-2 (NT2) בקו האנושי teratocarcinoma התא בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרה (iPSCs). שורות תאים אלה מספקים מודל טוב במבחנת מערכות אדם. עם זאת, התמיינות של תאי NT2 עם חומצה רטינואית (RA) תוצאות בדור של אוכלוסייה המעורבת של נוירונים, האסטרוציטים, ותאי גלייה רדיאלי ^12, דבר מחייב צעד טיהור נוסף כדי להשיג אוכלוסיות טהורות של נוירונים. בנוסף, תאי NT2 להפגין קריוטיפ משתנה מאוד ^13, עם יותר מ -60 כרומוזומים 72% של תאים. iPSCs להפגין השתנות בידול בין שורות תאים שונות, ונבדלים זה מזה יעיל בידול ^14. לכן רצוי שיהיה מודל תאים עצבי אדם עקבי לשחזור כדי להשלים חלופות אלה.

SH-SY5Y תאים דמויי neuroblast הם subclone של הקו הסלולרי נוירובלסטומה הורית SK-N-SH. שורת תא ההורים נוצרה בשנת 1970 מתוך ביופסית מח עצם המכיל את שני neuroblast דמוי תאים דמויים אפיתל ^15. יש תאי SH-SY5Y קריוטיפ יציב המורכב של 47 כרומוזומים, והוא יכול להיות מובחן ממצב neuroblast הדמוי אל הנוירונים שמהם מתפתחים שורה באמצעות מגוון רחב של מנגנונים שונים כולל שימוש RA, אסטרים phorbol, ו neurotrophins הספציפי כגון מוח נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF). ראיות לפני עולה כי שימוש בשיטות שונות ניתן לבחור עבור תת נוירונים ספציפיים כגון אדרנרגיים, כולינרגית, ו נוירונים דופאמינרגיים ^16,17. ההיבט השני הזה גורם לתאי SH-SY5Y שימושי עבור מספר רב של ניסויים לנוירוביולוגיה.

ontent "> מספר מחקרים הראו ההבדלים חשובים בין תאי SH-SY5Y במדינות המובחנות בדיל שלהם. כאשר תאי SH-SY5Y הם מובחנים, הם מתרבים במהירות להיראות בלתי מקוטב, עם מעט מאוד, תהליכים קצרים. הם לרוב גדלים בגושים ולהביע סמנים המעידים על נוירונים בשלה ^18,19. כאשר בדיל, תאים אלה להאריך ארוכים, מסועפים תהליכים, ירידה בהתרבות, ובמקרים מסוימים לקטב ^2,18. תאי SH-SY5Y בדיל באופן מלא כבר הוכיחו בעבר להביע מגוון של סמנים שונים של נוירונים בוגרים לרבות גידול הקשורים החלבון (GAP-43), גרעינים עצביים (NeuN), synaptophysin (SYN), הסינפטי שלפוחית ​​חלבון II (SV2), נוירון אנולאז ספציפי (NSE) ו microtubule הקשורים החלבון (MAP) ^2,16,17,20, ואת חוסר ביטוי של סמנים גליה כגון חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) ^4. ב תמיכה נוספת שהבדילו SH-SY5Y תאים represeNT אוכלוסייה עצבית הומוגנית, הסרת BDNF התוצאה הסלולר אפופטוזיס ^4. הדבר מצביע על כך ששיעור ההישרדות של תאי SH-SY5Y בדיל תלוי בגורמים תזונתיים, בדומה להבשיל נוירונים.

השימוש בתאי SH-SY5Y גדל מאז subclone הוקם בשנת 1978 ^3. כמה דוגמאות של השימוש שלהם כוללות חוקרת מחלת פרקינסון ^17, מחלת אלצהיימר ^21, ו בפתוגנזה של זיהום ויראלי כולל poliovirus ^22, enterovirus 71 (EV71) ^23,24 אבעבועות רוח, שלבקת חוגרת, וירוס (VZV) ^1, ציטומגלווירוס אדם ^25, ו נגיף הרפס סימפלקס (HSV) ^2,26. חשוב לציין כי מספר מחקרים באמצעות תאי SH-SY5Y השתמשו בתאים אלה בצורתם המובחנת, במיוחד בתחום neurovirology ^27-36. ההבדל הפנוטיפ הנצפה של מובחן לעומת תאי SH-SY5Y בדיל מעלה את שאלת wheיס את התקדמות הזיהום נצפה יהיה שונה נוירונים בדיל בוגרים. לדוגמה, תאים SH-SY5Y הבדיל יש יעילות גבוהה יותר של ספיגת HSV-1 לעומת תאים שלא עברו התמיינות, SH-SY5Y מתרבים, אשר יכול להיות בגלל חוסר הקולטנים אשר נקלטות HSV ולווסת הכניסה על תאים SH-SY5Y מובחן ^2. לכן זה קריטי כי בעת תכנון ניסוי התמקד בבדיקת נוירונים במבחנה, תאים SH-SY5Y צריך להיות מובחן על מנת לקבל את התוצאות המדויקות ביותר עבור תרגום השוואה למודלים in vivo.

פיתוח שיטה אמינה לייצר תרביות נוירונים אדם הוא הכרחי כדי לאפשר לחוקרים לבצע ניסויי translational במדויק מודל מערכת עצבים אנושי. הפרוטוקול המובא כאן הוא הליך תוחם מומלצים נגזר שיטות קודמות ^1-4 להעשיר נוירונים אדם נחלקיםבאמצעות חומצה רטינואית.

Protocol

1. שיקולים כלליים

1. ראה טבלה של חומרים / ציוד כדי לקבל רשימה של ריאגנטים הצורך. ביצוע כל הצעדים בתנאים aseptic קפדנית.
2. השתמש בסרום שור עובר חום המומת (hiFBS) עבור כל הכנות מדיה הכוללת FBS. כדי לחמם-להשבית, לחמם aliquot 50 מ"ל של FBS ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, היפוך כל 10 דקות (ראה גם לוח 1).
   הערה: כאשר FBS משמש ללא-איון חום, את הפנוטיפ דמוי אפיתל מתקדמת מהר יותר לאורך בתרביות תאים SH-SY5Y.
3. לפני השימוש, לאפשר התקשורת לחמם לאזן באינקובטור כדי ליצור איזון pH תקין לפני כל צעד. לדוגמה, 50 מ"ל של התקשורת לוקח כשעה כדי לאזן באופן מלא (pH 7, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2).
   הערה: פרוטוקול זה משתמש הליך פיצול שני שלבים הדורש תאים מובחנים חלקית SH-SY5Y להיות trypsinized מחדש מצופה. זהו מלחיץתהליך התאים שברירי במיוחד אלה. לכן, חשוב כדי לדגור התאים טריפסין עבור כמות מינימלית של זמן. זה יאפשר עבור ההמראה המועדפת של נוירונים, עזב דמוי תאי אפיתל עדיין מחובר המנה.
4. בצע טחינה דקה של תאים מובחנים לאט עם pipet פלסטיק 10 מ"ל עם קצה נגד התחתון של צינור חרוטי המכיל את התאים. בצע טחינה דקה במהירות איטית, מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים.

2. מעבר של תרבויות תחזוקה SH-SY5Y

1. תרבויות תחזוקת פיצול כאשר התאים הגיעו 70-80% confluency, ואל תעלה על 10 עד 15 קטעים. תרבויות בדרך כלל צריכות להיות passaged כל 3-5 ימים (תרבויות בהנחה אינן מדוללות יותר פי 5 במהלך הפיצול).
2. עד היום תאים קטע מתוך בקבוק T-75, לשאוב את התקשורת, ולאחר מכן לשטוף עם כ 10 מ"ל 1x PBS.
   הערה: איננו ממליצים לפצל את פו תרבויות תחזוקה SH-SY5Yrther מ -1: 5 במהלך passaging כיוון שהדבר עלול לגרום לתאים למות בשל confluency נמוכה.
3. לשאוב PBS, ולאחר מכן להוסיף 2.5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA (1x).
4. מדגירים דקות חממה 2-3 ולהטות בעדינות כדי לשחרר תאים מפני השטח של הבקבוק.
5. הוסף 10 מיליליטר תקשורת צמיחת יסוד (ראה טבלה 2) ו triturate 1-2 פעמים.
6. ספין למטה במשך 2 דקות XG ב 1000, תקשורת לשאוב, ואז resuspend גלולה ב 5 מיליליטר מדיה צמיחה בסיסית.
7. לדלל תאים 1: 3 ל -1: 5 בנפח כולל של 20 מ"ל עבור ציפוי נורמלי בקבוק T-75, או לספור צלחת לבידול (סעיף 5).

3. תאים מקפיאים SH-SY5Y

1. להקפיא קטעים מוקדמים של תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y בתקשורת צמיחה בסיסית בתוספת 5% (v / v) DMSO.
2. בתחילה, להקפיא aliquots ב -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.
   הערה: לצורך הפניה, ומחוברות (75-85%) בקבוק T-75 תניב חמש1 מ"ל aliquots של תאים SH-SY5Y להקפאה. כל אחד aliquots אלה יכילו מקום בין 2-5 מיליון תאים בסך הכל.

4. הפשרה והתרבות המובחנת SH-SY5Y תאי נוירובלסטומה

1. כן תקשורת צמיחה בסיסית.
2. במהירות להפשיר תאים קפואים בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס (כ 2 דקות).
3. תאים Resuspend ב 9 מ"ל מדיה צמיחה בסיסי בתוך שפופרת חרוטי 15 מ"ל, ואז צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 1000 x ז.
4. לשאוב supernatant תוך הקפדה שלא להפריע את תאי pelleted, ותאי resuspend בעדינות 10 מיליליטר תקשורת צמיחה בסיסית.
5. תאי פלייט על בקבוק T-25 או 60 מ"מ ² צלחת.
6. למחרת, להחליף תקשורת להסיר תאים מתים.

5. יום 0: תאי ציפוי לבידול

1. ראה איור 1 עבור לוח זמני בידול.
2. לשטוף תאים שלא עברו התמיינות עם 1x PBS, לשאוב, ולאחר מכן trypsinize באמצעות 1-2 מ"ל חימם1x 0.05% טריפסין- EDTA.
3. כאשר התאים נמצא טריפסין, דגירה במשך כ 3 דקות באינקובטור.
4. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל התקשורת צמיחה בסיסי, יש לשטוף את הצדדים של הבקבוק או צלחת, בעדינות triturate 1-3 פעמים. העבר תוכן אל צינור חרוטי 15 מ"ל.
5. צנטריפוגה במשך 2 דקות XG ב 1000, ואת לשאוב התקשורת תוך הקפדה שלא להפריע את הכדור.
6. Resuspend גלולה ב 5 מיליליטר מדיה צמיחה בסיסית triturate 1-3 פעמים.
7. ספירת תאים באמצעות hemocytometer, ואז לדלל באמצעות התקשורת צמיחה בסיסי מקסימלי של 50,000 תאים / מ"ל.
8. פלייט 2 מ"ל של תאים לכל 35 מ"מ ² צלחת עבור סכום כולל של 100,000 תאים לכל צלחת ומניחים בחזרה לתוך החממה.

6. יום 1: מדיה שינוי (# 1 מדיה בידול)

1. Aliquot 50 מ"ל של בידול מדיה # 1 (ראה טבלה 2) דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
2. כאשר התקשורת היא חיממה, ולאפשר לו לאזן באינקובטור (37מעלות צלזיוס, 5% CO ₂₎ לפחות שעה אחת כדי ליצור איזון pH נאותה לפני השימוש.
3. הוספת החומצה הרטינואית (ע"ר) (ראו טבלה 1) כדי חימם ומדיה equilibrated מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
   הערה: חומצה רטינואית אור רגיש צריך להיות מאוחסן בקבוקי בחושך ב 4 ° C
4. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
5. הוסף 2 מ"ל בידול מדיה # 1 עם RA לכל 35 מ"מ ² צלחת ולחזור חממה.

7. יום 3: מדיה שינוי (# 1 מדיה בידול)

1. סעיף 6 חזור (שלבים 1-5)

8. יום 5: מדיה שינוי (# 1 מדיה בידול)

1. סעיף 6 חזור (שלבים 1-5)

9. יום 7: תאי פיצול 1: 1

1. להוסיף RA כדי התחמם equilibrated בידול מדיה # 1 מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
2. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
3. הוסף 200 μl1x טריפסין EDTA 0.05% לכל צלחת 35 מ"מ ² וחמים החממה חיממו כ 2-3 דקות או עד התאים הם הרימו בעליל מהצלחת כפי שנצפה תחת מיקרוסקופ.
4. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 2 מדיה בידול מ"ל # 1 עם RA לכל 35 מ"מ ² צלחת ו להשתמש בתקשורת כדי לשטוף הנותרים תאים עצביים מצלחת. ואז להעביר תכנים אל צינור חרוטי 50 מ"ל.
   הערה: במהלך trypsinization צעדים, לא trypsinize יותר מדי מנות בבת אחת. פעולה זו מסייעת להבטיח תרביות נוירונים אינם וטופחו טריפסין במשך זמן רב מדי, אשר יכול להיות ציטוטוקסיות.
5. שלב תוכן ממרחק של עד 10 מנות בצינור חרוטי 50 מ"ל בעדינות triturate באיטיות מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים עם pipet פלסטיק 10 מ"ל.
6. Aliquot ההשעיה תא 2 מ"ל לתוך מנות טריות 35 מ"מ ² ולחזור חממה.

10. יום 8: מדיה שינוי (# 2 מדיה בידול)

1. להוסיף RA (ראה טבלה 1) כדי התחממה equilibrated תקשורת מייד לפני הוספת תקשורת מנות.
2. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
3. לאט לאט להוסיף 2 מ"ל בידול מדיה # 2 (ראה טבלה 2) עם RA לכל צלחת 35 מ"מ ² ולחזור חממה. אל תאפשר נוירונים להיות חשופים לאוויר במשך תקופה ארוכה של זמן כפי שהם יכולים להתייבש מהר.

11. יום 9: כן מטריקס (ECM) צלחות מצופות

1. להפשיר בקבוקון אחד של פתרון ECM על קרח לדלל 1: 100 לתוך DMEM קר.
2. לוותר על 2 מ"ל של התערובת לתוך כל מנה 35 מ"מ ² ולהבטיח את הבסיס כולו של המנה מכוסה.
3. מקום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂₎ עבור שעה 1 או לילה.
4. תערובת לשאוב ולאפשר לאוויר יבש עבור כ 1 hr במנדף. אחסן בטמפרטורת החדר עד 2 חודשים.

12. יום 10: העברת תאים עלצלחות ECM מצופות 1: 1

1. להוסיף RA (ראו טבלה 1) כדי חימם ומדיה equilibrated מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
2. בעדינות לשאוב את התקשורת וזורקת.
3. הוסף 200 μl חימם טריפסין על כל מנה 35 מ"מ ² ולאפשר כדי לדגור בטמפרטורת החדר למשך כ 1-2 דקות או עד נוירונים הם הרימו בעליל מצלחת כפי שנצפה תחת מיקרוסקופ.
   הערה: Execute trypsinization שלב זה בטמפרטורת החדר כדי לא להפריז דגירה הנוירונים עם טריפסין ולגרום נזק. נוירונים לשחרר מצלחות הרבה יותר מהר מאשר תאים דמויי אפיתל בשלב זה.
4. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל בידול מדיה # 2 לכל 35 מ"מ ² צלחת ולהשתמש בתקשורת לשטוף הנותרים תאים עצביים מצלחת. ואז להעביר תכנים אל צינור חרוטי 50 מ"ל.
5. שלב תוכן ממרחק של עד 10 מנות בצינור חרוטי 50 מ"ל בעדינות triturate באיטיות מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים עםpipet פלסטיק 10 מ"ל.
6. לוותר על 2 מ"ל תרחיף תאים לתוך ECM מצופה 35 מ"מ ^{2 מנות} ולחזור חממה.

13. יום 11: מדיה שינוי (מדיה בידול # 3)

1. להוסיף RA (ראו טבלה 1) כדי חימם ומדיה equilibrated מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
2. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
3. לאט לאט להוסיף 2 מ"ל בידול מדיה # 3 (ראה טבלה 2) עם RA לכל צלחת 35 מ"מ ² ולחזור חממה. אל תאפשר נוירונים להיות חשופים לאוויר במשך תקופה ארוכה של זמן.

14. יום 14: מדיה שינוי (מדיה בידול # 3)

1. מקטע חוזר 13 (שלבים 1-3)

15. יום 17: שינוי מדיה האחרון (בידול מדיה # 3)

1. מקטע חוזר 13 (שלבים 1-3)

16. יום 18: תרבויות עצביות מוכנות להשתמש

1. שינוי תקשורת כדי הגירסות טריותerentiation מדיה # 3 עם RA כל 3 ימים כדי לשמור על בריאות הנוירון.
   הערה: תאים צריכים להיות מובחנים לתוך הנוירונים ולהציג פנוטיפ עצבית. תרבויות הן בדרך כלל יציבה עד 14 יום לאחר בידול הטרמינל, אולם משך הכדאיות נוירון תלויה במספר המעבר של תאים שלא עברו התמיינות בתחילת בידול. מספרים מעבר גבוהים יותר מניבות נוירונים בדיל עם אורך חיים שימושי קצר.

תוצאות

נכון לעכשיו, ישנם מקרים רבים בתחום נוירוביולוגיה neurovirology שבו תאים SH-SY5Y מובחן נמצאים בשימוש כמודל פונקציונלי עבור נוירונים האדם ^27-36, וחשוב מכך, תאים שלא עברו התמיינות עשוי היעדר פנוטיפים כגון ספיגת ויראלי אופטימלי ² כי הם הכרחי פרשנות מדויקת. זה קריטי, כי בע...

Discussion

בפרוטוקול לעיל מספק שיטה פשוטה לשחזור כדי ליצור תרביות נוירונים אדם הומוגנית ובת קיימא. פרוטוקול זה מנצל טכניקות ושיטות עבודה המשלבים מספר שיטות שפורסמו בעבר ^1-4 ומטרתה להתוות את שיטות העבודה המומלצות של כל אחד. התמיינות של תאי SH-SY5Y מסתמכים על קיפוח בסרום הדרגת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	-
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	-
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	-
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	-
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	-