La differenziazione del SH-SY5Y neuroblastoma umano linea cellulare

Riepilogo

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduzione

La possibilità di utilizzare in sistemi modello in vitro ha notevolmente migliorato i campi della neurobiologia e neuroscienze. Le cellule in coltura forniscono una piattaforma efficiente per caratterizzare la funzionalità delle proteine ​​e dei meccanismi molecolari alla base dei fenomeni specifici, per comprendere la patologia di malattie e infezioni, e di effettuare valutazioni preliminari di prova della droga. In neurobiologia, i principali tipi di modelli di coltura cellulare includono colture neuronali primarie derivate da ratti e topi, e le linee di cellule di neuroblastoma come le cellule di ratto B35 ^5, Neuro-2A cellule di topo ^6, e le cellule di ratto PC12 ^7. Sebbene l'uso di tali linee cellulari ha avanzato significativamente il campo, ci sono diversi fattori confondenti associati alla manipolazione cellule non e tessuti umani. Questi includono la comprensione specie-specifiche differenze nei processi metabolici, fenotipi di manifestazione della malattia, e la patogenesi rispetto agli esseri umani. E 'anche importante notare che ilre sono differenze significative tra il mouse e l'espressione genica umana e segnalazione fattore di trascrizione, mettendo in evidenza i limiti dei modelli di roditori e l'importanza di comprendere quali percorsi sono conservati tra i roditori e gli esseri umani ^8-11. Altri hanno impiegato l'uso di linee cellulari neuronali umani, tra cui la N-Tera-2 (NT2) linea di cellule umane teratocarcinoma e le cellule staminali pluripotenti inducibile (iPSCs). Queste linee cellulari forniscono buoni modelli per i sistemi umani in vitro. Tuttavia, la differenziazione delle cellule NT2 con acido retinoico (RA) comporta la generazione di una popolazione mista di neuroni, astrociti e cellule gliali radiali ^12, che richiedono un ulteriore stadio di purificazione per ottenere popolazioni pure di neuroni. Inoltre, cellule NT2 mostrano un cariotipo altamente variabile ^13, con più del 60 cromosomi in 72% di cellule. iPSCs dimostrano variabilità nella differenziazione tra diverse linee cellulari e variano in termini di efficienza differenziazione ^14. E 'quindi auspicabile disporre di un modello di cellule neuronali umane e riproducibile per completare queste alternative.

cellule neuroblasti-like SH-SY5Y sono un sottoclone della parentali cellule di neuroblastoma SK-N-SH. La linea cellulare parentale è stato generato nel 1970 da una biopsia del midollo osseo che contiene sia neuroblast-like e cellule ^{epiteliali-come} 15. cellule SH-SY5Y hanno un cariotipo stabile composto di 47 cromosomi, e possono essere differenziati da uno stato neuroblast simile in neuroni umani maturi attraverso una varietà di meccanismi diversi, tra cui l'uso di RA, esteri del forbolo, e neurotrofine specifici come derivato dal cervello fattore neurotrofico (BDNF). Prove Prima suggerisce che l'uso di metodi differenti può selezionare per specifici sottotipi neuronali come adrenergici, colinergici, e neuroni dopaminergici ^16,17. Quest'ultimo aspetto rende le cellule SH-SY5Y utili per una moltitudine di esperimenti neurobiologia.

ontent "> Diversi studi hanno notato importanti differenze tra le cellule SH-SY5Y nei loro stati indifferenziati e differenziati. Quando le cellule SH-SY5Y sono indifferenziate, che rapidamente proliferano e sembrano essere non polarizzata, con pochissime, processi brevi. Spesso crescono in gruppi ed esprimere marcatori indicativi di neuroni immaturi ^18,19. Quando differenziate, queste cellule si estendono lungo, ramificata processi, diminuzione della proliferazione, e in alcuni casi polarizzano ^2,18. cellule SH-SY5Y completamente differenziati sono stati precedentemente dimostrato di esprimere un varietà di diversi marcatori di neuroni maturi tra cui proteine ​​di crescita-associata (GAP-43), i nuclei neuronali (NeuN), synaptophysin (SYN), delle vescicole sinaptiche proteina II (SV2), enolasi neurone specifica (NSE) e proteine ​​associate ai microtubuli (MAP) ^2,16,17,20, e mancare espressione di marcatori gliali come la proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) ^4. a ulteriore sostegno che differenziano le cellule SH-SY5Y RAPPRESEnt una popolazione neuronale omogenea, la rimozione di BDNF si traduce in apoptosi cellulare ^4. Questo suggerisce che la sopravvivenza delle cellule SH-SY5Y differenziate dipende da fattori trofici, simile a maturare neuroni.

L'utilizzo di cellule SH-SY5Y è aumentato rispetto alla subclone è stata fondata nel 1978 ^3. Alcuni esempi del loro uso includono indagare la malattia di Parkinson ^17, il morbo di Alzheimer ^21, e la patogenesi delle infezioni virali tra cui poliovirus ^22, enterovirus 71 (EV71) ^23,24 , virus varicella-zoster (VZV) ^1, citomegalovirus umano ^25, e il virus herpes simplex (HSV) ^2,26. È importante notare che diversi studi utilizzando cellule SH-SY5Y hanno utilizzato queste cellule nella loro forma indifferenziata, soprattutto nel campo della neurovirology ^27-36. La differenza nel fenotipo osservato di indifferenziata rispetto a cellule SH-SY5Y differenziate pone la questione di whether la progressione osservata dell'infezione sarebbe diversa nei neuroni differenziati maturi. Ad esempio, le cellule SH-SY5Y differenziati hanno una maggiore efficienza di HSV-1 captazione contro, proliferano le cellule SH-SY5Y indifferenziate, che può essere a causa della mancanza di recettori di superficie che legano HSV e modulano l'ingresso sul indifferenziate cellule SH-SY5Y ^2. È quindi importante che quando si progetta un esperimento focalizzata sui test neuroni in vitro, cellule SH-SY5Y dovrebbero essere differenziati al fine di ottenere i risultati più accurati per la traduzione e confronto di modelli in vivo.

Lo sviluppo di un metodo affidabile per generare colture neuronali umane è indispensabile per consentire ai ricercatori di effettuare esperimenti traslazionale che modellano con precisione il sistema nervoso umano. Il protocollo qui presentata è una procedura che delinea le best practice derivate da metodi precedenti ^1-4 per arricchire per i neuroni umani che si differenzianocon acido retinoico.

Protocollo

1. Considerazioni generali

1. Vedere la tabella dei materiali / attrezzature per un elenco di reagenti necessari. Eseguire tutte le operazioni in condizioni asettiche rigorose.
2. Utilizzare siero fetale bovino inattivato al calore (hiFBS) per tutte le preparazioni dei media che includono FBS. Per riscaldare-inattivare, riscaldare a 50 ml aliquota di FBS a 56 ° C per 30 minuti, invertendo ogni 10 min (vedi anche tabella 1).
   Nota: Quando FBS viene utilizzato senza calore inattivazione, il fenotipo epiteliale-come progredisce più rapidamente in tutto colture di cellule SH-SY5Y.
3. Prima dell'uso, consentire ai media per riscaldare ed equilibrare in un incubatore di stabilire un equilibrio del pH corretto prima di ogni passo. Ad esempio, 50 ml di media dura circa un'ora per equilibrare completamente (pH 7, 37 ° C, 5% CO _2).
   Nota: Questo protocollo utilizza una procedura di scissione in due fasi che richiede cellule parzialmente differenziate SH-SY5Y essere trypsinized e ri-placcati. Questa è una stressanteProcedimento per queste cellule estremamente fragili. Pertanto, è importante incubare le cellule in tripsina per una quantità minima di tempo. Ciò consentirà per la preferenziale lift-off di neuroni, lasciando le cellule epiteliali come ancora attaccato al piatto.
4. Eseguire triturazione di cellule differenziate lentamente con una pipetta di plastica da 10 ml con la punta contro il fondo del tubo conico contenente le cellule. Eseguire triturazione a bassa velocità, su e giù per non più di cinque volte.

2. Il passaggio di SH-SY5Y Culture manutenzione

1. culture manutenzione Split quando le cellule hanno raggiunto il 70-80% di confluenza, e non superare i 10 ei 15 passaggi. Le culture in genere devono essere diversi passaggi ogni 3-5 giorni (culture assumendo non sono diluiti più di 5 volte durante splitting).
2. Per le celle passaggio da un pallone T-75, aspirare fuori dei media, quindi risciacquare con circa 10 ml di PBS 1X.
   Nota: Si consiglia di non dividere il SH-SY5Y manutenzione culture further di 1: 5 durante passaging perché questo può causare le cellule a morire a causa della bassa confluenza.
3. Aspirare PBS e aggiungere 2,5 ml di 0,05% tripsina-EDTA (1x).
4. Incubare in incubatrice 2-3 min e ribaltare delicatamente per rilasciare cellule dalla superficie del pallone.
5. Aggiungere 10 ml di base Crescita media (vedi Tabella 2) e triturare 1-2 volte.
6. Spin down per 2 min a 1000 xg, i media aspirare, quindi risospendere pellet in 5 ml di base Crescita Media.
7. Diluire le cellule da 1: 3 a 1: 5 in un volume totale di 20 ml per placcatura normale T-75 pallone, o contare e la piastra di differenziazione (punto 5).

3. congelamento cellule SH-SY5Y

1. Congelare i primi passaggi di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y in crescita di base di media integrati con il 5% (v / v) DMSO.
2. Inizialmente, congelare aliquote a -80 ° C per 24 ore, poi il trasferimento per l'azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
   Nota: Per avere un riferimento, un confluenti (75-85%) T-75 pallone produrrà cinque1 ml aliquote di cellule SH-SY5Y per il congelamento. Ognuna di queste aliquote dovrebbero contenere ovunque da 2-5 milioni di cellule totali.

4. Cellule Scongelare e Cultura indifferenziata SH-SY5Y neuroblastoma

1. Preparare la crescita di base Media.
2. Scongelare rapidamente cellule congelate a bagnomaria C 37 ° (circa 2 min).
3. Risospendere le cellule in 9 ml di base la crescita media in un tubo da 15 ml, e poi centrifugare per 2 min a 1000 x g.
4. Aspirare il surnatante facendo attenzione a non disturbare le cellule pellet, e le cellule delicatamente risospendere in 10 ml di base Crescita Media.
5. Cellule piatto sulla un pallone T-25 o 60 ^mm 2 piatto.
6. Il giorno successivo, sostituire il supporto per rimuovere le cellule morte.

5. Giorno 0: placcatura cellule di differenziazione

1. Vedere la Figura 1 per il programma di differenziazione.
2. Lavare le cellule indifferenziate con 1x PBS, aspirare, e poi trypsinize con 1-2 ml riscaldati1x 0,05% tripsina-EDTA.
3. Quando le cellule sono in tripsina, incubare per circa 3 minuti in un incubatore.
4. Placare la tripsina con l'aggiunta di 10 ml di crescita di base dei media, sciacquare le pareti del pallone o un piatto, e triturare delicatamente 1-3 volte. Trasferire contenuto in una provetta conica da 15 ml.
5. Centrifugare per 2 min a 1000 xg, e aspirare i media facendo attenzione a non disturbare il pellet.
6. Risospendere il pellet in 5 ml di base Crescita media e triturare 1-3 volte.
7. Contare le cellule utilizzando un emocitometro, poi diluite con la crescita di base media di 50.000 cellule / ml.
8. Piastra 2 ml di cellule per ³⁵ mm 2 piatto per un totale di 100.000 cellule per piatto e mettere di nuovo in incubatrice.

6. Giorno 1: Cambia supporto (Differenziazione media # 1)

1. Aliquota 50 ml di differenziazione media # 1 (vedi tabella 2) e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C.
2. Quando il supporto è riscaldato, lasciarlo equilibrare in un incubatore (37° C, 5% CO ₂₎ per almeno un ora di stabilire un giusto equilibrio pH prima dell'uso.
3. Aggiungere acido retinoico (RA) (vedi Tabella 1) per riscaldato e dei media equilibrata immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
   Nota: L'acido retinoico è sensibile alla luce e deve essere conservato in bottiglie scure a 4 ° C
4. Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
5. Aggiungere 2 ml di differenziazione media # 1 con RA per ³⁵ mm 2 piatto e tornare a incubatore.

7. Giorno 3: Cambia supporto (Differenziazione media # 1)

1. Ripetere Sezione 6 (punti 1-5)

8. Giorno 5: Cambia supporto (Differenziazione media # 1)

1. Ripetere Sezione 6 (punti 1-5)

9. Giorno 7: Dividi celle 1: 1

1. Aggiungere RA riscaldato ed equilibrato differenziazione media # 1 immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
2. Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
3. Aggiungere 200 plriscaldato 0,05% 1x tripsina EDTA a ³⁵ mm 2 piatto e caldo in incubatrice circa 2-3 minuti o fino a quando le cellule sono visibilmente sollevati dalla piastra come osservato sotto un microscopio.
4. Placare la tripsina con l'aggiunta di 2 ml di differenziazione media # 1 con RA per ³⁵ mm 2 piatto e utilizzare i media per lavare rimanenti cellule neuronali fuori la piastra. Poi il trasferimento contenuto in un tubo conico da 50 ml.
   Nota: Durante tripsinizzazione passi, non trypsinize troppi piatti in una sola volta. Questo aiuta ad assicurare colture neuronali non vengono incubate in tripsina per troppo tempo, che può essere citotossico.
5. Unire il contenuto da un massimo di 10 piatti in tubo conico da 50 ml e delicatamente triturare lentamente su e giù non più di cinque volte con una pipetta di plastica da 10 ml.
6. Aliquota sospensione cellulare 2 ml in fresco 35 mm ² piatti e tornare a incubatore.

10. Giorno 8: Variazione media (differenziazione media # 2)

1. Aggiungere RA (vedi Tabella 1) per riscaldato ed equilibrato dei media immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
2. Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
3. Lentamente aggiungere 2 ml di differenziazione media # 2 (vedi tabella 2) con RA per ³⁵ mm 2 piatto e ritorno in incubatrice. Non permettere neuroni di essere esposte all'aria per un periodo prolungato di tempo in quanto possono asciugare rapidamente.

11. Giorno 9: Preparare matrice extracellulare (ECM) Piatti rivestiti

1. Scongelare una fiala di soluzione di ECM sul ghiaccio e diluire 1: 100 in DMEM freddo.
2. Distribuire 2 ml di miscela in ciascuna delle piastre ³⁵ mm 2 e garantire l'intera base del piatto è coperto.
3. Inserire in termostato (37 ° C, 5% CO ₂₎ per 1 ora o durante la notte.
4. miscela Aspirare e lasciare asciugare per circa 1 ora in una cappa. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 2 mesi.

12. Giorno 10: Cellule trasferimento suECM Piastre rivestite 1: 1

1. Aggiungere RA (vedi Tabella 1) per riscaldato e dei media equilibrata immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
2. Delicatamente aspirare fuori dei media e scartare.
3. Aggiungere 200 microlitri riscaldati tripsina a ciascuna piastra da 35 ^mm 2 e lasciare incubare a temperatura ambiente per circa 1-2 minuti o fino neuroni sono visibilmente sollevati dal piatto come osservato sotto un microscopio.
   Nota: Eseguire questo passaggio tripsinizzazione a temperatura ambiente in modo da non a un eccesso di incubare neuroni con tripsina e causare danni. I neuroni rilasciano dai piatti molto più velocemente rispetto alle cellule epiteliali-come in questa fase.
4. Placare la tripsina con l'aggiunta di 2 ml di differenziazione media # 2 per ³⁵ mm 2 piatto e utilizzare i media per lavare rimanenti cellule neuronali fuori la piastra. Poi il trasferimento contenuto in un tubo conico da 50 ml.
5. Unire il contenuto da un massimo di 10 piatti in tubo conico da 50 ml e delicatamente triturare lentamente su e giù non più di cinque volte conuna plastica pipetta 10 ml.
6. Dispensare 2 ml di sospensione cellulare in ECM rivestite da 35 mm ² piatti e tornare a incubatore.

13. Giorno 11: Cambia supporto (differenziazione media # 3)

1. Aggiungere RA (vedi Tabella 1) per riscaldato e dei media equilibrata immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
2. Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
3. Aggiungere lentamente 2 ml Differenziazione media # 3 (vedi tabella 2) con RA per ³⁵ mm 2 piatto e tornare a incubatore. Non permettere neuroni di essere esposte all'aria per un periodo prolungato di tempo.

14. Giorno 14: Cambia supporto (differenziazione media # 3)

1. Ripetere Sezione 13 (passi 1-3)

15. Giorno 17: Ultima media Change (Differenziazione media # 3)

1. Ripetere Sezione 13 (passi 1-3)

16. Giorno 18: colture neuronali pronto per l'uso

1. Cambia supporto per fresco Differenziazione media # 3 con RA ogni 3 giorni per mantenere la salute dei neuroni.
   Nota: Le cellule devono essere differenziate in neuroni e mostrano un fenotipo neuronale. Le culture sono generalmente stabili fino a 14 giorni dopo la differenziazione terminale, tuttavia durata del neurone redditività dipende dal numero passaggio delle cellule indifferenziate all'inizio di differenziazione. numeri di passaggio maggiore resa neuroni differenziati con una vita utile più breve.

Risultati

Attualmente, ci sono molti casi nel campo della neurobiologia e neurovirology in cui le cellule SH-SY5Y indifferenziate vengono utilizzati come un modello funzionale per i neuroni umani ^27-36, e, soprattutto, le cellule indifferenziate possono mancare fenotipi quali ottimale assorbimento virale ^{2 che sono} necessario per la corretta interpretazione. È fondamentale che quando si usano cellule SH-SY5Y o qualsiasi altro sistema in vitro neuronale, le cellule sono opportunamente differenziate ...

Discussione

Il protocollo di cui sopra fornisce un metodo semplice e riproducibile per generare colture neuronali umane omogenee e vitali. Questo protocollo utilizza tecniche e pratiche che integrano diversi metodi precedentemente pubblicati ^1-4 e mira a delineare le migliori pratiche di ciascuno. Differenziazione delle cellule SH-SY5Y si basa sulla progressiva deprivazione di siero; l'aggiunta di acido retinoico, fattori neurotrofici e proteine ​​della matrice extracellulare; e la divisione di serie per selezion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	ThermoFisher Scientific	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	-
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	-
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	-
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	-
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35 mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	-