A diferenciação da linha celular SH-SY5Y humanas de neuroblastoma

Resumo

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Resumo

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introdução

A capacidade de utilizar em sistemas modelo in vitro melhorou substancialmente nos domínios da neurobiologia e as neurociências. Células em cultura fornecer uma plataforma eficiente para caracterizar a funcionalidade de proteínas e mecanismos moleculares subjacentes fenômenos específicos, para entender a patologia de doenças e infecções, e para realizar avaliações preliminares de testes de drogas. In Neurobiology, os principais tipos de modelos de culturas de células neuronais primárias incluem culturas derivadas de ratos e murganhos, e linhas celulares de neuroblastoma, tais como células B35 de rato ^5, Neuro-2A ^6, células de rato, e células PC12 de rato ^7. Embora a utilização de tais linhas celulares tem avançado de forma significativa do campo, há vários factores de confusão associados com a manipulação de células e de tecidos não-humanos. Estes incluem espécies específicas compreender as diferenças nos processos metabólicos, fenótipos de manifestação da doença e patogênese quando comparado aos seres humanos. É também importante notar que are diferenças significativas entre mouse e expressão do gene humano e sinalização fator de transcrição, destacando as limitações dos modelos de roedores e a importância de compreender as vias metabólicas que são conservadas entre roedores e humanos ^8-11. Outros têm utilizado o uso de linhas de células neuronais humanos, incluindo o N-Tera-2 (NT2), linha celular de teratocarcinoma humano e células estaminais pluripotentes indutíveis (iPSCs). Estas linhas celulares fornecem bons modelos para sistemas in vitro humanos. No entanto, a diferenciação de células NT2 com ácido retinóico (RA) resulta na geração de uma população mista de neurónios, astrócitos e células gliais radiais ^12, que necessitam de um passo de purificação adicional para obtenção de populações puras de neurónios. Além disso, as células NT2 demonstrar um cariótipo altamente variável ^13, com maior do que 60 cromossomas em 72% das células. iPSCs demonstram a variabilidade na diferenciação entre as diferentes linhas de células e diferenciação variar em eficiência ^14. Por conseguinte, é desejável ter um modelo celular neuronal humana consistente e reprodutível para complementar estas alternativas.

SH-SY5Y células neuroblastos-like são um subclone da linha celular de neuroblastoma parentais SK-N-SH. A linha de células parental foi gerado em 1970 a partir de uma biópsia de medula óssea que contém as células epiteliais do tipo ^{15-neuroblastos} como e. As células SH-SY5Y ter um cariótipo estável que consiste de 47 cromossomas, e podem ser diferenciados a partir de um estado de neuroblastos-como em neurónios humanos maduros através de uma variedade de diferentes mecanismos, incluindo o uso de AR, ésteres do forbol, e neurotrofinas específicas, tais como cérebro-derivado factor neurotrófico (BDNF). Antes evidência sugere que a utilização de diferentes métodos podem seleccionar para os subtipos de neurónios adrenérgicos específicos, tais como, colinérgico, e neurónios dopaminérgicos ^16,17. Este último aspecto torna as células SH-SY5Y úteis para uma variedade de experiências de neurobiologia.

onteúdo "> Vários estudos notaram diferenças importantes entre as células SH-SY5Y em seus estados indiferenciados e diferenciadas. Quando as células SH-SY5Y são indiferenciadas, eles rapidamente proliferar e parecem ser não-polarizada, com muito poucos processos, curtos. Eles geralmente crescem em aglomerados e expressam marcadores de neurónios imaturos indicativos ^18,19. Quando diferenciadas, estas células estender ramificada longa processos, a diminuição da proliferação e, em alguns casos polarizar ^2,18. As células SH-SY5Y completamente diferenciadas foram anteriormente demonstrado para expressar um variedade de diferentes marcadores de neurónios maduros incluindo proteína associada ao crescimento (GAP-43), núcleos neuronais (NeuN), sinaptofisina (SYN), sináptica proteína vesicular II (SV2), a enolase específica neuronal (NSE) e microtúbulos proteína associada (MAP) ^2,16,17,20, e a falta de expressão de marcadores gliais, tais como a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) ^4. Em mais apoio diferenciadas que as células SH-SY5Y represeNT uma população neuronal homogénea, a remoção de BDNF resulta em apoptose celular ^4. Isto sugere que a sobrevivência de células SH-SY5Y diferenciadas é dependente de factores tróficos, semelhantes a neurónios maduros.

Utilização de células SH-SY5Y aumentou desde o subclone foi estabelecida em 1978 ^3. Alguns exemplos da sua utilização incluem a investigação da doença de Parkinson ^17, a doença de Alzheimer ^21, e a patogénese da infecção virai, incluindo poliovírus ^22, enterovírus 71 (EV71) ^23,24 , vírus da varicela-zoster (VZV) ^1, citomegalovírus humano ^25, e vírus do herpes simplex (HSV) ^2,26. É importante notar que diversos estudos utilizando células SH-SY5Y foram utilizadas estas células na sua forma indiferenciada, especialmente no campo da neurovirology ^27-36. A diferença no fenótipo observado de indiferenciada contra células SH-SY5Y diferenciadas levanta a questão de wheterap a progressão da infecção observada seria diferente em neurónios diferenciados maduros. Por exemplo, as células SH-SY5Y diferenciadas têm uma maior eficiência de HSV-1 captação versus, em proliferação células SH-SY5Y indiferenciadas, que pode ser devido a uma falta de receptores de superfície que ligam o HSV e modulam a entrada em indiferenciadas células SH-SY5Y ^2. Portanto, é fundamental que ao projetar um experimento voltado a testar os neurônios in vitro, as células SH-SY5Y deve ser diferenciada a fim de obter os resultados mais precisos para a tradução e comparação de modelos in vivo.

O desenvolvimento de um método confiável para gerar culturas neuronais humanos é imperativo para permitir que os investigadores para realizar experimentos tradução que modelar com precisão o sistema nervoso humano. O protocolo aqui apresentado é um processo que delineia as melhores práticas derivadas de métodos anteriores ^1-4 para o enriquecimento em neurónios humanos que são diferenciadosutilizando ácido retinóico.

Protocolo

1. Considerações Gerais

1. Veja a Tabela de materiais / equipamentos para uma lista de reagentes necessários. Execute todas as etapas sob condições assépticas rigorosas.
2. Use de soro fetal bovino inactivado pelo calor (hiFBS) para todos os meios de comunicação que incluem preparações de FBS. Para aquecer-inactivate, aquecer uma aliquota de 50 ml de FBS a 56 ° C durante 30 min, invertendo a cada 10 min (ver também a Tabela 1).
   Nota: Quando é utilizado FBS sem calor inactivação, o fenótipo epitelial semelhante progride mais rapidamente ao longo culturas de células SH-SY5Y.
3. Antes de usar, permitem meios de comunicação para aquecer e equilibrar em uma incubadora de estabelecer um equilíbrio pH adequado antes de cada etapa. Por exemplo, 50 ml de meio leva aproximadamente uma hora para equilibrar completamente (pH 7, 37 ° C, 5% CO _2).
   Nota: Este protocolo utiliza um processo de fraccionamento em dois passos que requer as células SH-SY5Y diferenciadas parcialmente a ser tratadas com tripsina e re-plaqueadas. Este é um estressanteProcesso para estas células excepcionalmente frágeis. Portanto, é importante para incubar as células em tripsina para uma quantidade mínima de tempo. Isto irá permitir a preferencial lift-off de neurónios, deixando as células epiteliais, como ainda ligado ao prato.
4. Realizar a trituração de células diferenciadas lentamente com uma pipeta de plástico de 10 ml com a ponta contra a parte inferior do tubo cónico contendo as células. Execute trituração em uma velocidade lenta, para cima e para baixo não mais do que cinco vezes.

2. A passagem de Culturas de manutenção SH-SY5Y

1. culturas de manutenção de divisão quando as células atingiram 70-80% de confluência, e não excedem 10 a 15 passagens. As culturas tipicamente necessitam de ser passadas a cada 3-5 dias (culturas assumindo que não são diluídos mais do que 5 vezes durante splitting).
2. Para células passagem de um frasco T-75, aspirar fora da mídia, em seguida, enxaguar com aproximadamente 10 ml de 1x PBS.
   Nota: Não é recomendável dividir o SH-SY5Y culturas de manutenção further de 1: 5 durante a passagem em porque isso pode fazer com que as células a morrer devido ao baixo confluência.
3. Aspirar PBS, e em seguida, adicionar 2,5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (1x).
4. Incubar numa incubadora 2-3 min e ponta suavemente para libertar as células da superfície do frasco.
5. Adicionar 10 ml de mídia básico do Crescimento (ver Tabela 2) e triturar 1-2 vezes.
6. Spin down por 2 min a 1000 xg, meios aspirado, em seguida, ressuspender sedimento em 5 ml Crescimento mídia Basic.
7. Dilui-se as células a partir de 1: 3 a 1: 5 num volume total de 20 ml para revestimento normal no balão T-75, ou de contar e placa de diferenciação (ponto 5).

3. Congelamento células SH-SY5Y

1. Congelar passagens precoces de células de neuroblastoma SH-SY5Y em crescimento básico de meios suplementados com 5% (v / v) de DMSO.
2. Inicialmente, congelar alíquotas a -80 ° C durante 24 hr, em seguida, transferir para azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.
   Nota: Para referência, um confluentes (75-85%) T-75 frasco irá produzir cincoAlíquotas de 1 ml de células SH-SY5Y para congelamento. Cada uma destas alíquotas deve conter de 2-5 milhões de células totais.

4. As células Thaw e Cultura indiferenciado SH-SY5Y de neuroblastoma

1. Prepare mídia básico Crescimento.
2. Descongelar rapidamente células congeladas num banho de água a 37 ° C (cerca de 2 min).
3. Ressuspender as células em 9 ml Crescimento de mídia básico em um tubo de 15 ml, e em seguida, centrifugar por 2 min a 1.000 x g.
4. Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar as células peletizadas e células delicadamente ressuspender em 10 ml Crescimento mídia Basic.
5. Células da placa em um frasco T-25 ou 60 ^mm2 prato.
6. No dia seguinte, substituir meios para remover as células mortas.

5. Dia 0: cultivar células para Diferenciação

1. Ver Figura 1 para a programação de diferenciação.
2. Lavar as células indiferenciadas com 1x PBS, aspirado, e depois trypsinize usando 1-2 ml aquecido1x 0,05% de tripsina-EDTA.
3. Quando as células estão em tripsina, incubar durante aproximadamente 3 min num incubador.
4. Extingue-se a tripsina por adição de 10 ml de meio de crescimento básico, lavar as paredes do frasco ou prato, e triturar suavemente 1-3 vezes. Transferir o conteúdo para um tubo cônico de 15 ml.
5. Centrifugar por 2 min a 1000 xg, e aspirar os meios de comunicação, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.
6. Ressuspender sedimento em 5 ml Crescimento de mídia básico e triturar 1-3 vezes.
7. Contagem de células utilizando um hemocitómetro, depois dilui-se com meio de crescimento básico a 50.000 células / ml.
8. Placa 2 ml de células por 35 ^mm2 prato para um total de 100.000 células por prato e coloque de volta para incubadora.

6. Dia 1: Mudar mídia (Diferenciação de mídia # 1)

1. Alíquota de 50 ml de diferenciação Meios # 1 (ver Tabela 2) e incuba-se em um banho de água a 37 ° C.
2. Quando a mídia é aquecido, permitir que ele atinja o equilíbrio em uma incubadora (37° C, 5% CO ₂₎ durante pelo menos uma hora para estabelecer um equilíbrio do pH antes da utilização.
3. Adicionar ácido retinóico (RA) (ver Tabela 1) aquecido e media equilibrada imediatamente antes de adicionar mídia para pratos.
   Nota: O ácido retinóico é sensível à luz e deve ser armazenado em frascos escuros a 4 ° C
4. Aspirar cuidadosamente off velha mídia e descarte.
5. Adicionar 2 ml de Diferenciação de mídia # 1 com RA por 35 ^mm2 prato e retornar à incubadora.

7. Dia 3: Mudança de mídia (Diferenciação de mídia # 1)

1. Repita a Seção 6 (passos 1-5)

8. Dia 5: Mudar mídia (Diferenciação de mídia # 1)

1. Repita a Seção 6 (passos 1-5)

9. Dia 7: Dividir células de 1: 1

1. Adicionar RA a aquecido e equilibrada Diferenciação de mídia nº 1 imediatamente antes de adicionar mídia para pratos.
2. Aspirar cuidadosamente off velha mídia e descarte.
3. Adicionar 200 ulaqueceu-se 0,05% de EDTA 1x tripsina por 35 milímetros e ^dois prato quente na incubadora aproximadamente 2-3 minutos ou até que as células são visivelmente levantada a partir da placa, como observado sob um microscópio.
4. Extingue-se a tripsina por adição de 2 ml de mídia Diferenciação # 1 com RA por 35 ^mm2 prato e usar a mídia para lavar restantes células neuronais lado da placa. Em seguida, transferir o conteúdo para um tubo cônico de 50 ml.
   Nota: Durante a tripsinização passos, não trypsinize muitos pratos ao mesmo tempo. Isto ajuda a assegurar culturas neuronais não são incubados em tripsina durante demasiado tempo, que pode ser citotóxica.
5. Juntar o conteúdo de até 10 pratos no tubo de 50 ml e gentilmente triturar lentamente para cima e para baixo não mais do que cinco vezes com uma pipeta de plástico de 10 ml.
6. Aliquota de suspensão de células de 2 ml em fresco de 35 mm pratos ² e retornar à incubadora.

10. Dia 8: Mudar mídia (Diferenciação de mídia # 2)

1. Adicionar RA (veja Tabela 1) aquecido e equilibrada mídia imediatamente antes de adicionar mídia para pratos.
2. Aspirar cuidadosamente off velha mídia e descarte.
3. Adiciona-se lentamente 2 mL de Diferenciação conteúdo # 2 (ver Tabela 2) com AR por 35 ^mm2 prato e retorno à incubadora. Não permitem neurónios para ser exposta ao ar por um período prolongado de tempo que pode secar rapidamente.

11. Dia 9: Prepare Matriz Extracelular (ECM) placas revestidas

1. Descongelar um frasco de solução de ECM no gelo e diluir 1: 100 em DMEM frio.
2. Dispensar 2 mL de mistura em cada 35 milímetros prato ² e assegurar que toda a base do prato é coberto.
3. Coloque dentro de uma incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante 1 hora ou durante a noite.
4. mistura Aspirar e deixar secar ao ar durante aproximadamente 1 hora em uma capa. Armazenar à temperatura ambiente por até 2 meses.

12. Dia 10: Transferência de células nasECM placas revestidas com 1: 1

1. Adicionar RA (ver Tabela 1) aquecido e media equilibrada imediatamente antes de adicionar mídia para pratos.
2. Aspirar cuidadosamente off media e descarte.
3. Adicionar 200 ul de tripsina a cada aquecido 35 milímetros prato ² e deixa-se incubar à temperatura ambiente durante cerca de 1-2 minutos, ou até que os neurónios são visivelmente levantado do prato como observado sob um microscópio.
   Nota: Executar esta etapa tripsinização à temperatura ambiente de modo a não sobre-incubar neurônios com tripsina e causar danos. Neurônios liberar a partir de placas muito mais rápido do que as células epiteliais-como nesta fase.
4. Extingue-se a tripsina por adição de 2 ml de mídia Diferenciação # 2 por 35 ^mm2 prato e usar a mídia para lavar restantes células neuronais lado da placa. Em seguida, transferir o conteúdo para um tubo cônico de 50 ml.
5. Juntar o conteúdo de até 10 pratos no tubo de 50 ml e gentilmente triturar lentamente para cima e para baixo não mais do que cinco vezes comuma pipeta de plástico de 10 ml.
6. Dispensar 2 ml de suspensão de células em pratos de 35 mm revestidos por ^dois ECM e retornar à incubadora.

13. Dia 11: Mudança de mídia (Diferenciação de mídia # 3)

1. Adicionar RA (ver Tabela 1) aquecido e media equilibrada imediatamente antes de adicionar mídia para pratos.
2. Aspirar cuidadosamente off velha mídia e descarte.
3. Adiciona-se lentamente 2 ml de Diferenciação conteúdo # 3 (ver Quadro 2) com RA por 35 milímetros prato ² e retornar à incubadora. Não permitem neurónios para ser exposta ao ar por um período prolongado de tempo.

14. Dia 14: Mudança de mídia (Diferenciação de mídia # 3)

1. Repita a Seção 13 (passos 1-3)

15. Dia 17: Última mídia Change (Diferenciação de mídia # 3)

1. Repita a Seção 13 (passos 1-3)

16. Dia 18: culturas neuronais pronto para usar

1. Mudar mídia para Diff frescoerentiation conteúdo # 3 com RA a cada 3 dias para manter a saúde neurónio.
   Nota: As células devem ser diferenciadas em neurônios e apresentam um fenótipo neuronal. As culturas são tipicamente estáveis ​​durante até 14 dias após a diferenciação terminal, no entanto a duração da viabilidade neuronal é dependente do número de passagem das células indiferenciadas no início da diferenciação. números passagem maior rendimento neurônios diferenciados com uma vida útil mais curta.

Resultados

Neste momento, existem muitos casos na área da neurobiologia e neurovirology onde as células SH-SY5Y indiferenciadas estão sendo usados ​​como um modelo funcional para os neurônios humanos ^27-36 e, mais importante, as células indiferenciadas podem não ter fenótipos, tais como a absorção viral óptima ^{2, que} são necessário para a interpretação precisa. É crítico que, ao usar células SH-SY5Y ou qualquer outro sistema neuronal in vitro, as células são apropriadamente dif...

Discussão

O protocolo acima fornece um método simples e reprodutível para gerar culturas neuronais humanos homogéneos e viáveis. Este protocolo utiliza técnicas e práticas que integram vários métodos publicados anteriormente ^1-4 e tem como objetivo delinear as melhores práticas de cada um. Diferenciação de células SH-SY5Y depende de privação de soro gradual; a adição de ácido retinóico, factores neurotróficos e proteínas da matriz extracelular; e divisão de série para seleccionar para os neurônio...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	-
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	-
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	-
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	-
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	-