SH-SY5Y 인간 신경 모세포종 세포 라인의 차별화

요약

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

초록

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

서문

시험 관내 모델 시스템에 사용하는 능력은 크게 신경 생물학 및 신경 과학 분야를 강화하고있다. 배양 세포가 감염 질병의 병리를 이해하고, 예비 약물 시험 평가를 수행하는 단백질의 기능 및 분자 기전 특정 현상을 특징 효율적인 플랫폼을 제공한다. 신경 생물학에서 세포 배양 모델의 주요 유형은 쥐 B35 세포 ⁵ 신경 2A 마우스 세포 ^6, 랫트 PC12 ^{세포는 7} 쥐 및 신경 아세포종 세포주 유래의 주요 신경 배양 물을 포함한다. 이러한 세포주의 사용이 크게 필드 진행 하였지만, 비 - 인간 세포 및 조직 처리와 연관된 여러 교란 요인이있다. 인간과 비교했을 때 이러한 이해 종 특이 대사 과정의 차이, 질병 증상 및 발병 기전의 표현형을 포함한다. 이 점에 유의하는 것이 중요하다설치류 모델 제약 경로는 설치류와 인간 사이에서 보존되는 ^8-11 이해 중요성 강조 마우스 및 인간의 유전자 발현 및 전사 인자 신호 사이에 상당한 차이가 다시한다. 기타 N-테라 -2- (NT2) 인간 기형 암종 세포주 유도 성 및 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 포함한 인간 신경 세포 라인의 사용을 채용 하였다. 이 세포주는 체외 인간의 시스템에 대한 좋은 모델을 제공합니다. 그러나, 레티노 산 (RA) 신경 교세포의 혼합 집단의 생성을 초래하고 추가의 정제 공정을 필요 반경 신경교 세포 ^(12)와 NT2 세포의 분화 신경 세포 집단을 순수 얻었다. 또한 NT2 세포는 세포의 72 %보다 큰 60 염색체와 매우 가변적 핵형 ¹³ 보여준다. iPSCs는 다른 세포 라인 사이의 차별화에 다양성을 보여 분화 효율에 차이가 ^14. 이들 대안을 편안하게 일관되고 재현 인간 신경 세포 모델을 갖는 것이 바람직하다.

SH-SY5Y의 neuroblast 같은 세포는 부모의 신경 모세포종 세포주 SK-N-SH의 서브 클론입니다. 부모 세포주 neuroblast 같은 상피 세포 형 ^(15)을 모두 포함하는 골수 생검 1970에서 발생 하였다. SH-SY5Y 세포를 47 염색체 이루어진 안정한 핵형을 가지고, 다른 RA의 사용을 포함하는 메커니즘, 포르 볼 에스테르 및 뇌 유래 특정 뉴로 통해 다양한 성숙한 인간 뉴런에 neuroblast 같은 상태로부터 구별 될 수있다 신경 영양 인자 (BDNF). 선행 증거는 다른 방법의 사용은 아드레날린, 콜린성 및 도파민 뉴런 ^16,17 특정 신경 세포 아형에 대해 선택할 수있는 제안한다. 이 후자의 측면은 신경 생물학 실험의 다수 유용 SH-SY5Y 세포를 만든다.

ontent는 "> 여러 연구는 미분화와 차별화 된 지역에서의 SH-SY5Y 세포 사이의 중요한 차이점을 지적했다. 때 SH-SY5Y 세포는 미분화, 그들은 빠르게 증식과 거의 짧은 프로세스와, 비 편광 것으로 보인다. 그들은 종종 성장 분화시 미성숙 뉴런 ^18,19 나타내는 덩어리 및 발현 마커. 이러한 세포는 긴 분지 프로세스 증식의 저하를 확장하고, 어떤 경우에는 ^2,18을 편광. 완전히 분화 ​​된 SH-SY5Y 세포는 이전에 표현하는 것으로 입증되었다 성장 관련 단백질 (GAP-43), 신경 핵 (NeuN), synaptophysin에 (SYN), 시냅스 소포 단백질 II (SV2), 신경 세포 특이에 놀라 (NSE)와 미세 소관 연관 단백질 (MAP)를 포함하여 성숙한 신경 세포의 다른 마커의 다양한 ^2,16,17,20, 이러한 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) ⁴ 등의 폐해 마커의 발현을 부족합니다. SH-SY5Y 세포가 represe 차별화 추가 지원에NT 균질 신경 인구 BDNF를 제거하여 세포 사멸 ⁴ 초래한다. 이는 차별화 된 SH-SY5Y 세포의 생존 신경 세포를 성숙 비슷한 영양 요인에 따라 달라집니다 것이 좋습니다.

서브 클론 1978 ³ 년에 설립 된 이후 SH-SY5Y 세포의 사용은 증가하고있다. 그 사용의 예는 파킨슨 병 ^(17), 알츠하이머 병 ^(21), 및 폴리오 바이러스 ^(22), 엔테로 바이러스 71 (EV71)를 포함하는 바이러스 감염의 병인 ^{(23, 24)을} 조사 포함 수두 - 대상 포진 바이러스 (VZV) ^1, 인간 거대 세포 바이러스 ^(25), 및 단순 포진 바이러스 (HSV) ^2,26. 특히 neurovirology ^27-36 분야, SH-SY5Y 세포는 미분화 형태로 이들 세포를 사용하여 한 것을 여러 연구가 중요하다. 분화 된 SH-SY5Y 세포에 비해 미분화 관찰 된 표현형의 차이 whe에 의문을 제기THER 감염의 진행을 관찰 성숙한 분화 된 신경 세포에서 상이한 것이다. 예를 들어, 분화 된 SH-SY5Y 세포에 의한 HSV 결합 미분화 SH-SY5Y 세포를 ² 엔트리를 변조 표면 수용체의 부족 일 수있다 분화, 증식 SH-SY5Y 세포, 대 HSV-1 흡수 높은 효율을 갖는다. 이는 시험관 내에서 신경 세포를 테스트에 초점을 맞춘 실험을 설계 할 때, SH-SY5Y 세포를 생체 내 모델로 변환하고 비교에 대한 가장 정확한 결과를 얻기 위하여 구별되어야 함 때문에 중요하다.

인간 신경 세포 배양 물을 생성하는 신뢰할 수있는 방법의 개발이 연구 정확하게 인간 신경계 병진 모델 실험을 수행 할 수 있도록하는 것이 필수적이다. 여기에 제시된 프로토콜은 차별화되는 인간의 신경 세포에 대한 풍부 이전의 방법 ^1-4에서 파생 된 모범 사례를 묘사 절차레티노 산을 사용.

프로토콜

1. 일반 고려 사항

1. 필요한 시약의 목록을 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. 엄격한 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다.
2. FBS를 포함하는 모든 미디어 준비에 대한 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (hiFBS)를 사용합니다. 열 - 불 활성화, 10 분마다 반전, 30 분 동안 56 ° C에서의 FBS 50 ㎖ 분취 량을 따뜻하게 (또한하기 표 1 참조).
   주 : FBS가 열 불 활성화없이 사용하는 경우에는, 상피 같은 표현형 SH-SY5Y 세포의 배양에 걸쳐보다 빠르게 진행한다.
3. 사용하기 전에는 미디어가 따뜻하게 모든 단계 전에 적절한 산도 균형을 설정하는 인큐베이터에서 평형 수 있습니다. 예를 들어, 매체의 50 ㎖ 완전히 평형을 약 1 시간 소요 (pH가 7, 37 ° C, 5 % CO _2).
   주 :이 프로토콜은 트립신 처리하고 다시 도금 될 편미분 SH-SY5Y 세포를 필요로하는 두 단계의 분리 방법을 사용한다. 이것은 스트레스이러한 매우 깨지기 쉬운 세포에 대한 처리. 따라서, 최소의 시간 트립신에 세포를 배양 중요하다. 이것은 여전히​​ 접시에 부착 된 상피 - 유사 세포를 떠나, 신경 세포의 특혜 리프트 오프 (lift-off)를 허용합니다.
4. 서서히 세포를 함유하는 원뿔형 튜브의 바닥에 대해 팁 10 ㎖ 플라스틱 피펫으로 분화 된 세포의 분쇄를 수행한다. 상하 더 느린 속도로 다섯번 이상 분쇄를 수행한다.

SH-SY5Y 유지 관리 문화의 2. 통과

1. 세포를 70-80 %의 컨 플루 언시에 도달하고, 10 ~ 15 유로를 초과하지 않는 분리 유지 배양. 문화는 일반적으로 (가정 문화가 분할 동안 5 배 이상 희석되지 않음) 모든 3-5일를 계대 할 필요가있다.
2. T-75 플라스크에서 통과 셀에 다음 PBS 1X 약 10 ㎖로 씻어, 미디어를 대기음.
   참고 : 우리는 SH-SY5Y 유지 보수 문화 쿵푸을 분할하지 않는 것이 좋습니다1보다 rther : 5 계대 동안이 세포가 낮은 컨 플루로 인해 사망 원인이 될 수 있기 때문이다.
3. 대기음 PBS는 다음 2.5 ml의 0.05 % 트립신 - EDTA (1 배)를 추가합니다.
4. 배양기에서 2-3 분 인큐베이션하고 플라스크의 표면으로부터 세포를 분리 부드럽게 팁.
5. 10 ml의 기본 성장 미디어 추가 (표 2 참조) 및 1-2 번 씹다.
6. 1,000 XG에서 2 분 동안 스핀 다운, 흡인 미디어 다음, 5 ml의 기본 성장 미디어에서 펠렛을 재현 탁.
7. T-75 플라스크에서 일반 도금 20 ML의 총 부피 5, 또는 분화 (섹션 5)에 대한 계산과 판 : 1 ~ 3 : 1에서 세포를 희석.

3. 냉동 SH-SY5Y 세포

1. 5 % (v / v)의 DMSO 보충 된 기본 배지에서 성장 SH-SY5Y 세포의 신경 아세포종 초기 통로 동결.
2. 처음 24 시간 동안 -80 ℃에서 분취 액을 동결 한 후 장기간 저장을 위해 액체 질소로 옮긴다.
   주 : 참고로 합류 (75~85%)를 T-75 플라스크에 다섯 수득 할냉동 SH-SY5Y 세포를 1 ml의 분취. 이 분취 액의 각각은 총 어디서나 2-5000000 세포를 포함해야합니다.

4. 해​​동 문화 미분화 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포

1. 기본 성장 미디어를 준비합니다.
2. 빠르게 37 ° C의 물을 욕조 (약 2 분)에 동결 된 세포를 해동.
3. 15ml의 원뿔형 튜브에서 9 ㎖의 기본 성장 배지에서 세포를 재현 탁하고, 그 다음 1000 x g에서 2 분간 원심 분리.
4. 기음 뜨는 10 ml의 기본 성장 미디어에서 펠렛 세포, 부드럽게 재현 탁 세포를 방해하지 않도록주의하면서.
5. T-25 플라스크 또는 60mm ² 접시 위에 플레이트 세포.
6. 다음 날, 죽은 세포를 제거하기 위해 미디어를 교체합니다.

5 일 0 : 차별화에 대한 도금 세포

1. 차별화 일정 그림 1을 참조하십시오.
2. 1X PBS, 대기음으로 미분화 세포를 씻어 후 1-2 ml를 따뜻하게 사용하여를 Trypsinize1 배 0.05 % 트립신 - EDTA.
3. 세포가 트립신에있을 때, 인큐베이터에서 약 3 분 동안 품어.
4. 10 ml의 기본 성장 미디어를 추가하여 트립신을 해소 플라스크 또는 접시의 측면을 씻어 부드럽게 1-3 번 씹다. 15 ML 원뿔 튜브에 내용을 전송합니다.
5. 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 1,000 XG에 2 분 동안 원심 분리기, 그리고 미디어를 대기음.
6. 재현 탁의 5 ml의 기본 성장 미디어에서 펠렛과 1-3 번 씹다.
7. 혈구를 사용하여 세포를 계산 한 다음 / ㎖ 50,000 셀에 기본 성장 미디어를 사용하여 희석.
8. 접시 2 접시 당 10 만 셀의 총 35mm ² 접시 당 세포 ㎖의 인큐베이터에 다시 배치합니다.

6. 1 일 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 1)

1. 분화 매체 # 1 분취 액 50 ㎖를 (표 2 참조)를 37 ℃의 수조에서 배양한다.
2. 미디어가 가온되면 (이것은 인큐베이터 평형 37 있도록° C는 5 % CO ₂₎ 적어도 하나의 시간 동안 사용하기 전에 적절한 산도 균형을 확립한다.
3. 레티노 산 (RA)를 추가 즉시 요리 미디어를 첨가하기 전에 승온시키고 평형화 미디어 (표 1 참조).
   참고 : 레티노 산 민감한 빛과 4 ° C에서 어두운 병에 보관해야합니다
4. 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다.
5. 35mm ² 접시 당 RA와 2 ml의 차별화 미디어 # 1을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다.

7. 3 일 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 1)

1. 반복 섹션 6 (1-5 단계)

8. 5 일 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 1)

1. 반복 섹션 6 (1-5 단계)

9 일 7 : 분할 세포 1 : 1

1. RA는 따뜻하게 추가하고 즉시 요리에 미디어를 추가하기 전에 차별화 미디어 # 1 평형.
2. 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다.
3. 200 μl를 추가35mm ² 접시 당 0.05 % 1X 트립신 EDTA를 따뜻하게 약 2 ~ 3 분 또는 셀까지가 눈에 띄게 현미경으로 관찰 판에서 해제되는 인큐베이터 따뜻한.
4. 35mm ² 접시 당 RA와 2 ml의 차별화 미디어 # 1을 추가하여 트립신을 끄다 플레이트 떨어져 신경 세포 남은 린스 미디어를 사용합니다. 그런 다음 50 ㎖ 원뿔 관에 내용을 전송합니다.
   참고 : 트립신 단계 동안, 한 번에 너무 많은 요리를 Trypsinize하지 않습니다. 이 세포 독성이 될 수있는 연결을 문화가 너무 오래 트립신 배양되지 않도록하는 데 도움이됩니다.
5. 50 ML 원뿔 튜브에 최대 10 요리에서 내용을 결합하고 부드럽게하고 더 이상 5 배 아래로 10 ml의 플라스틱 피펫으로 천천히 씹다.
6. 나누어지는 2 ml의 세포 신선한 35mm ² 요리에 매달리기와 인큐베이터로 돌아갑니다.

10 일 8 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 2)

1. RA를 추가합니다 (<강한> 표 1) 가온 즉시 요리에 미디어를 추가하기 전에 미디어를 평형합니다.
2. 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다.
3. 천천히 2 mL의 차별화 미디어 # 2 (표 2 참조) 추가 35mm ² 접시와 인큐베이터에 반환 당 RA와. 허용하지 않음 뉴런은 빨리 건조 수 장기간 공기에 노출된다.

11 일 9 : 세포 외 기질 (ECM)를 준비 코팅 요리

1. 얼음에 ECM 솔루션 중 하나 병을 해동 1을 희석 : 100 차가운 DMEM으로.
2. 각 35mm ² 접시에 혼합 2 ㎖를 분배하고 접시의 전체 염기가 포함되어 있는지 확인합니다.
3. 인큐베이터에있는 장소 (37 ° C, 5 % CO ₂₎ 1 시간 또는 하룻밤합니다.
4. 기음 혼합물과 후드에서 약 1 시간 동안 공기 건조에 있습니다. 최대 2 개월 동안 실온에서 보관.

12 일 10 : 전송 세포 상ECM 코팅 된 플레이트 1 :

1. RA 추가 즉시 요리 미디어를 첨가하기 전에 승온시키고 평형화 미디어 (표 1 참조).
2. 조심스럽게 미디어를 대기음 및 폐기합니다.
3. 각 35mm ² 접시에 트립신 가온 200 μl를 추가하고 약 1-2 분 동안 또는 신경 세포가 눈에 띄게 현미경으로 관찰 접시에서 해제 될 때까지 실온에서 배양 할 수 있습니다.
   주 : 트립신 뉴런 오버 부화 손상하지 않도록하고 실온이 트립신 처리 단계를 실행한다. 뉴런은이 단계에서 상피 - 같은 세포보다 훨씬 빠른 판에서 놓습니다.
4. 35mm ² 접시 당 2 ml의 차별화 미디어 # 2를 추가하여 트립신을 해소하고, 플레이트 떨어져 신경 세포 남은 린스 미디어를 사용합니다. 그런 다음 50 ㎖ 원뿔 관에 내용을 전송합니다.
5. 50 ML 원뿔 튜브에 최대 10 요리에서 내용을 결합하고 부드럽게 위로와 함께 더 이상 5 배 아래로 천천히 씹다10 ml의 플라스틱 피펫.
6. ECM 코팅 35mm ² 요리에 2 ㎖의 세포 현탁액을 분배하고 인큐베이터로 돌아갑니다.

13 일 11 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 3)

1. RA 추가 즉시 요리 미디어를 첨가하기 전에 승온시키고 평형화 미디어 (표 1 참조).
2. 조심스럽게 된 미디어를 대기음 및 폐기합니다.
3. 천천히 35mm ² 접시 당 RA와 2 ml의 차별화 미디어 # 3 (표 2 참조) 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 허용하지 않음 뉴런 장기간 공기에 노출된다.

14 일 14 : 변경 미디어 (차별화 미디어 # 3)

1. 반복 섹션 13 (1-3 단계)

15 일 17 : 마지막 미디어 변경 (차별화 미디어 # 3)

1. 반복 섹션 13 (1-3 단계)

16 일 18 : 사용 준비 신경 문화

1. 신선한의 Diff 미디어 변경3 일마다 RA와 erentiation 미디어 # 3는 신경 세포의 건강을 유지합니다.
   세포가 신경 세포로 분화되어야하며, 신경 세포 표현형을 나타내는 참고. 배양 단말 분화 다음 최대 14 일 동안 일반적으로 안정, 신경 세포 생존을 지속하지만 분화의 시작에서 미분화 세포의 통과 횟수에 의존한다. 높은 통로 번호는 더 짧은 유효 수명 차별화 뉴런을 얻었다.

결과

현재, 이러한 흡수되어 최적 바이러스 ^2와 같은 획일적 인 SH-SY5Y 세포는 중요한 미분화 세포가 부족할 수 인간 뉴런 ^27-36, 표현형 및 기능에 대한 모델로서 사용되는 신경 생물학 및 neurovirology 분야의 많은 경우가있다 정확한 해석을 위해 필요한. 이 체외 신경계를 SH-SY5Y 세포를 사용하거나 다른 어떤 경우에는, 세포가 적절하게 생체 내에서 뉴런에서 발생 될 것인가의...

토론

위의 프로토콜은 균일하고 가능한 인간의 신경 세포 문화를 생성하는 간단하고 재현성있는 방법을 제공한다. 이 프로토콜은 기술과 각각의 모범 사례를 서술하는 데 몇 이전에 발행 된 방법 ^1-4과 목표를 통합하는 방법을 사용합니다. SH-SY5Y 세포의 분화는 점진적으로 혈청 부족에 의존; 레티노 산, 향 신경성 인자 및 세포 외 기질 단백질의 첨가; 시리얼 분할 차별화 성숙한 부착 뉴런 선택...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	ThermoFisher Scientific	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	-
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	-
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	-
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	-
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35 mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	-