SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株の分化

要約

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

要約

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

概要

ビトロモデル系で使用する能力は、神経生物学と神経科学の分野を大幅に強化しました。培養中の細胞は、タンパク質の機能と特定の現象の根底にある分子メカニズムを特徴づけるために病気や感染症の病態を理解するために、予備薬物検査の評価を実施するための効率的なプラットフォームを提供します。神経生物学では、細胞培養モデルの主要なタイプは、ラットB35細胞^5、ニューロ2Aマウス^セル 6、およびラットPC12細胞を⁷としてラットおよびマウス、および神経芽細胞腫細胞株に由来する初代神経細胞培養物を含みます。このような細胞株の使用が大幅にフィールドを進めているが、非ヒト細胞および組織を処理に関連するいくつかの交絡因子が存在します。人間と比較した場合、これらは理解種特異的代謝過程の違い、病気の症状、および病原性の表現型が含まれます。ことに注意することも重要です再齧歯類モデルおよび経路は、げっ歯類およびヒト^8-11との間で保存されているの理解の重要性の限界を強調し、マウスとヒトの遺伝子発現と転写因子のシグナル伝達の間に有意な差です。他のものはN-テラ-2（NT2）ヒト奇形癌細胞株および誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を含むヒト神経細胞株の使用を採用しています。これらの細胞株は、 インビトロでのヒト・システムのための優れたモデルを提供します。しかしながら、レチノイン酸（RA）、ニューロン、星状細胞の混合集団の発生をもたらし、さらなる精製工程を必要と放射状グリア細胞¹²とNT2細胞の分化は、ニューロンの純粋な集団を得ました。また、NT2細胞は、細胞の72％より大きい60染色体で、非常に可変性核型^13を示しています。性IPSCは、異なる細胞株の間の区別の変動を示し、分化効率が変化します ^14。これらの選択肢を補完するために一貫して再現性のヒト神経細胞モデルを有することが望ましいです。

SH-SY5Y神経芽細胞のような細胞は、親の神経芽細胞腫細胞株SK-N-SHのサブクローンです。親細胞株は、神経芽細胞様および上皮様細胞¹⁵の両方含ま骨髄生検から、1970年に生成されました。 SH-SY5Y細胞は、47の染色体からなる、安定な核型を有し、かつ異なるRAの使用を含む機構、ホルボールエステル、およびそのような脳由来などの特定のニューロトロフィンの様々を通して成熟ヒトニューロンへの神経芽細胞のような状態から区別することができます神経栄養因子（BDNF）。前の証拠は異なる方法の使用は、アドレナリン作動性、コリン作動性、およびドーパミン作動性ニューロン^16,17のような特定のニューロンのサブタイプに選択できることを示唆しています。この後者の側面は、神経生物学実験の多数のためのSH-SY5Y細胞が有用となります。

ontent ">いくつかの研究は、未分化および分化した状態で、SH-SY5Y細胞との間の重要な違いを指摘している。SH-SY5Y細胞が未分化である場合、それらは急速に増殖し、非常に少数の、短いプロセスと、非偏光であるように思われる。彼らは多くの場合、成長します塊および分化、これらの細胞は増殖の減少、長く、分枝プロセスを拡張し、場合によっては^{2,18を偏光}する。未成熟ニューロン^18,19を示すマーカーを発現する。完全に分化したSH-SY5Y細胞は、以前に発現することが実証されています成長関連タンパク質（GAP-43）、ニューロン核（NeuNの）、シナプトフィジン（SYN）、シナプス小胞タンパク質II（SV2）、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）と微小管関連タンパク質（MAP）を含む成熟ニューロンの異なる様々なマーカー^{2,16,17,20、}および^4。SH-SY5Y細胞の分化をさらに支持するものreprese例えばグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）のようなグリアのマーカーの発現を欠いているためにntの均質なニューロン集団は、BDNFの除去は、細胞のアポトーシスを⁴になります。これは、分化したSH-SY5Y細胞の生存は、成熟ニューロンに類似栄養因子に依存することを示唆しています。

サブクローンは、1978年³に設立されて以来、SH-SY5Y細胞の使用が増加している。その使用のいくつかの例としては、パーキンソン病^17、アルツハイマー病^21、およびポリオウイルス²²などのウイルス感染症の病因、エンテロウイルス^{71（EV71）23,24を調査}含ま、水痘帯状疱疹ウイルス^{（VZV）1、}ヒトサイトメガロウイルス^25、および単純ヘルペスウイルス^{（HSV）2,26。} SH-SY5Y細胞を用いたいくつかの研究は、特に神経ウイルス学^27-36の分野において、その未分化形態において、これらの細胞を使用していることに留意することが重要です。分化したSH-SY5Y細胞対未分化の観察された表現型の違いは、WHEの問題を提起しますTHER感染の観察進行が成熟分化したニューロンで異なるだろう。例えば、分化したSH-SY5Y細胞は、原因HSVに結合し、未分化SH-SY5Y細胞²のエントリを調節する表面受容体の欠如にすることができる未分化、増殖するSH-SY5Y細胞に対するHSV-1の取り込みのより高い効率を有します。 in vitroでのニューロンのテストに焦点を当てた実験を設計する際に、SH-SY5Y細胞をin vivoモデルに変換し、比較のために最も正確な結果を得るためには区別されるべきであることが重要です。

ヒトニューロン培養物を生成するための信頼できる方法の開発は、研究者は正確に人間の神経系をモデル化する翻訳実験を実行することを可能にするのに不可欠です。ここで紹介するプロトコルは区別されている人間の神経細胞を濃縮するために、従来の方法^1-4由来のベストプラクティスを描く手順ですレチノイン酸を使用。

プロトコル

1.一般的な考慮事項

1. 必要な試薬のリストについては、 マテリアル/機器の表を参照してください。厳格な無菌条件下で、すべての手順を実行します。
2. FBSを含むすべてのメディアの準備のための熱不活性化ウシ胎児血清（hiFBS）を使用します。熱-不活性化するために、10分毎に反転、30分間56℃でFBS 50mlのアリコートを温める（ 表 1 参照）。
   注：FBSを熱不活性化なしで使用される場合、上皮様表現型は、SH-SY5Y細胞の培養を通してより迅速に進行します。
3. 使用前に、メディアが温め、すべてのステップの前に、適切なpHバランスを確立するためのインキュベーターで平衡化することを可能にします。例えば、培地の50mlを完全に平衡化するのに約1時間かかり液（pH 7、37℃、5％CO _2）。
   注：このプロトコルは、部分的に分化したSH-SY5Y細胞をトリプシン処理し、再メッキされている必要があり2段階の分割手順を使用しています。これはストレスが多いですこれらの非常に脆弱な細胞のためのプロセス。したがって、最小限の時間のために、トリプシンで細胞をインキュベートすることが重要です。これはまだ皿に付着した上皮様細胞を残して、ニューロンの優先リフトオフが可能になります。
4. 細胞を含有する円錐管の底部に対して先端と10ミリリットルプラスチックピペットでゆっくりと分化した細胞のトリチュレーションを実行します。上下ない、低速で5倍以上のトリチュレーションを実行しません。

SH-SY5Yメンテナンス文化の2パッセージ

1. 細胞が70-80％コンフルエントに達しており、10〜15継代を超えない分割維持培養。培養物は、典型的には、（培養が分裂中に以上の5倍に希釈されていないと仮定して）3〜5日毎に継代する必要があります。
2. T-75フラスコから継代細胞に、約10ミリリットル1×PBSですすぎ、その後、メディアを吸引します。
   注：私たちは、SH-SY5Yメンテナンスの文化のfuを分割することはお勧めしません。1よりrther：5継代の間には、これは、細胞が低い密集度のために死ぬことを引き起こす可能性があるため。
3. 吸引し、PBS、その後、2.5ミリリットル0.05％トリプシン-EDTA（1X）を追加します。
4. インキュベーター2-3分でインキュベートし、フラスコの表面から細胞を解放するために穏やかに転倒。
5. 10ミリリットルの基本的な成長培地を追加します（ 表2を参照）、1-2回粉砕します。
6. 千×gで2分間スピンダウンし、培地を吸引し、次いで5ミリリットルの基本的な増殖培地でペレットを再懸濁。
7. T-75フラスコ内で、通常のめっき用20ミリリットルの全容量に5、または分化（第5節）のためにカウントし、プレート：3から1：1から細​​胞を希釈します。

3.凍結SH-SY5Y細胞

1. 5％（v / v）のDMSOを補充した基本的な増殖培地中でSH-SY5Y神経芽腫細胞の早期継代の凍結。
2. 当初は、長期保存のために液体窒素に転送した後、24時間-80℃でアリコートを凍結します。
   注：参考のために、コンフルエント（75から85パーセント）T-75フラスコは、5を得られます凍結するSH-SY5Y細胞を1mlのアリコート。これらのアリコートのそれぞれが総どこでも2から5万個の細胞が含まれている必要があります。

4.解凍と文化未分化SH-SY5Y神経芽腫細胞

1. 基本的な増殖培地を準備します。
2. 急速に37℃の水浴（約2分）で凍結細胞を解凍します。
3. 15ミリリットルコニカルチューブ内の9ミリリットルの基本的な増殖培地中で細胞を再懸濁し、そしてその後、千×gで2分間遠心します。
4. 吸引し、ペレット化した細胞を妨害し、そして穏やかに10ミリリットルの基本的な増殖培地中で細胞を再懸濁させないように注意しながら上清。
5. T-25フラスコまたは60ミリメートル²皿にプレート細胞。
6. 次の日は、死んだ細胞を除去するためにメディアを交換してください。

5. 0日：分化のためのめっきセル

1. 分化スケジュールについては、図1を参照してください。
2. 1×PBS、吸引と未分化細胞をすすぎ、その後、温めた1〜2ミリリットルを使用してトリプシン処理1倍、0.05％トリプシン-EDTA。
3. 細胞はトリプシンである場合に、インキュベーター内で約3分間インキュベートします。
4. 、10ミリリットルの基本的な成長培地を添加することにより、トリプシンをクエンチフラスコまたは皿の側面を洗い流し、そして穏やかに1-3回を粉砕します。 15ミリリットルコニカルチューブにコンテンツを転送します。
5. 千×gで2分間遠心分離し、ペレットを乱さないように注意しながら、メディアを吸引除去します。
6. 5ミリリットルの基本的な増殖培地で再懸濁ペレットと1-3回粉砕します。
7. 50,000細胞/ mlに基本的な増殖培地を用いて希釈した後、血球計数器を用いて細胞数を計測します。
8. プレート2皿当たり100,000細胞の合計のための35ミリメートル²ディッシュあたりの細胞mlのインキュベーターに戻し置きます。

6. 1日目：メディアの変更（分化メディア＃1）

1. 分化メディア＃1のアリコート50mlを（ 表2を参照）、37℃の水浴中でインキュベートします。
2. メディアが温められたとき、それは培養器に平衡化させる（37°Cで、5％CO _2）は、少なくとも1時間、使用前に適切なpHバランスを確立します。
3. レチノイン酸（RA）を追加し、すぐに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。
   注：レチノイン酸は光に敏感であり、4℃で暗所瓶に保存する必要があります
4. ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。
5. 35ミリメートル²ディッシュあたりRAに2ミリリットル分化メディア＃1を追加し、インキュベーターに戻します。

7. 3日目：メディアの変更（分化メディア＃1）

1. 繰り返しセクション6（1-5ステップ）

8. 5日目：メディアの変更（分化メディア＃1）

1. 繰り返しセクション6（1-5ステップ）

9. 7日目：セルの分割1：1

1. すぐに料理にメディアを追加する前に分化メディア＃1を温めて、平衡化するためにRAを追加します。
2. ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。
3. 200μLを加えます35ミリメートル²ディッシュあたり0.05％の1xトリプシンEDTAを温め、約2〜3分または細胞までは目に見えて、顕微鏡下で観察されるようにプレートから持ち上げられるインキュベーターで暖かいです。
4. 35ミリメートル²皿あたりRAに2ミリリットル分化メディア＃1を追加することにより、トリプシンをクエンチ そしてプレートから残りの神経細胞を洗浄するためにメディアを使用しています。次いで、50mLのコニカルチューブにコンテンツを転送します。
   注意：トリプシン処理手順の間に、一度にあまりにも多くの料理をトリプシン処理しません。これは、神経細胞培養は、細胞毒性であることができる、あまりにも長い間、トリプシン中でインキュベートされないことを保証するのに役立ちます。
5. 50ミリリットルコニカルチューブに最大10個の皿からのコンテンツを組み合わせて、静かにアップなしの5倍以上ダウン10ミリリットルプラスチックピペットでゆっくりと摩砕。
6. 35ミリメートル²新鮮な料理とインキュベータへの復帰へのアリコート2ミリリットルの細胞懸濁液。

10. 8日目：変更メディア（分化メディア＃2）

1. RAを追加します（参照<すぐに料理にメディアを追加する前にメディアを温めて、平衡化するための強力な>表1）。
2. ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。
3. ゆっくりと2 mLの分化メディア＃2を追加します（ 表2参照 ） 35ミリメートル²皿当たりRAと、インキュベーターに戻します。ニューロンは、彼らはすぐに乾燥させることができるように長期間にわたって大気に曝されないようにしてください。

11. 9日目：細胞外マトリックス（ECM）を準備コートディッシュ

1. 氷上でECMソリューションの1つのバイアルを解凍し、1を希釈：100を冷たいDMEMに。
2. 各35ミリメートル²皿に混合物の2ミリリットルを分配し、皿のベース全体が覆われていることを確認します。
3. 一晩で1時間またはインキュベーター（37℃、5％CO _2）内の場所。
4. 吸引した混合物とフードで約1時間、空気乾燥させ。最大2ヶ月間室温で保管してください。

12日10：転送細胞にECMコーティングプレート1：1

1. RAを追加直ちに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。
2. 静かにメディアをオフに吸引し、廃棄します。
3. 各35ミリメートル²皿にトリプシン温め200μlを添加して、約1〜2分間、またはニューロンが目に見えて、顕微鏡下で観察されるように皿から持ち上げられるまで室温でインキュベートすることができます。
   注：トリプシンニューロンを過剰インキュベートし、損傷が発生しないように室温でこのトリプシン処理ステップを実行します。ニューロンは、この段階で上皮様細胞よりもはるかに高速プレートから離します。
4. 35ミリメートル²皿当たり2ミリリットル分化メディア＃2を追加することにより、トリプシンをクエンチし、プレートから残りの神経細胞を洗浄するためにメディアを使用しています。次いで、50mLのコニカルチューブにコンテンツを転送します。
5. 50ミリリットルコニカルチューブに最大10個の皿からのコンテンツを組み合わせて、優しくまでととせいぜい5回上下にゆっくりと粉砕します10ミリリットルプラスチックピペット。
6. ECMコーティングされた35ミリメートル²皿に2ミリリットルの細胞懸濁液を分注し、インキュベーターに戻します。

13.日11：メディアの変更（分化メディア＃3）

1. RAを追加直ちに皿にメディアを追加する前に温めし、平衡化した培地（ 表1参照 ）。
2. ゆっくり古いメディアをオフに吸引し、廃棄します。
3. ゆっくりと35ミリメートル²ディッシュあたりRAと（ 表2参照 ）2ミリリットル分化メディア＃3を追加し、インキュベーターに戻します。ニューロンが長時間空気中に露出することはできません。

14日14：メディアの変更（分化メディア＃3）

1. 繰り返しセクション13（1-3ステップ）

15.日17：最後のメディアの変更（分化メディア＃3）

1. 繰り返しセクション13（1-3ステップ）

16.日18：使用する準備ができて神経細胞培養

1. 新鮮な差分にメディアを変更3日ごとにRAとerentiationメディア＃3は、ニューロンの健康を維持します。
   注：細胞は、神経細胞に分化し、神経細胞の表現型を示すべきです。培養物は、しかし、ニューロンの生存率の持続時間は分化の開始時に未分化細胞の継代回数に依存して、最終分化次の14日まで一般的に安定しています。高い継代数は、より短い耐用寿命と分化したニューロンをもたらします。

結果

現時点では、未分化SH-SY5Y細胞は、ヒトのニューロン^27-36のための機能モデルとして使用されている神経生物学と神経ウイルス学の分野で多くのインスタンスがあり、重要なのは、未分化細胞である、そのような最適なウイルスの取り込み²のような表現型を欠いてもよいです正確な解釈のために必要な。 SH-SY5Y細胞または他のin vitroの神経系を使用する場合、細胞は適切?...

ディスカッション

上記のプロトコルは、均質かつ実行可能な人間の神経細胞培養を生成するための簡単​​で再現性のある方法を提供します。このプロトコルは、いくつかの以前に公開された方法^1-4を統合手法と実践を利用し、それぞれのベストプラクティスを描写することを目指しています。 SH-SY5Y細胞の分化は、緩やかな血清欠乏に依存しています。レチノイン酸、神経栄養因子および細胞外マト...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	-
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	-
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	-
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	-
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	-