Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

Resumen

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Resumen

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrP^C) to an abnormal protease resistant isomer called PrP^Res. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrP^Res isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrP^Res formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrP^C, and are often too toxic to use in animal or human subjects.

We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrP^C is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrP^C expression of neurons in the CNS.

Introducción

Los priones son enfermedades neurodegenerativas graves que afectan el SNC. Las enfermedades priónicas son el resultado de la mal plegamiento de la proteína priónica celular normal, PrP ^C, por un isómero infecciosa llamada PrP ^Res. Estas enfermedades afectan a una amplia variedad de especies, incluyendo la encefalopatía espongiforme bovina en vacas, scrapie en ovejas, la caquexia crónica en los cérvidos, y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos ^1-3. Los priones causan neurodegeneración que se inicia con la pérdida sináptica, y progresa a vacuolización, gliosis, pérdida neuronal, y los depósitos de placa. Con el tiempo, dando como resultado la muerte del animal / persona ^4. Durante décadas, los investigadores han investigado compuestos destinados a ralentizar o detener la progresión de la enfermedad priónica. Sin embargo, los investigadores no han encontrado ya sea una terapia exitosa o un vehículo de administración sistémica eficaz.

Se requiere la expresión endógena PrP ^C para el desarrollo de las enfermedades priónicas ⁵ . Por lo tanto, disminuir o eliminar la expresión de PrP ^C puede resultar en un retraso o mejora de la enfermedad. Varios grupos crearon ratones transgénicos con niveles reducidos de PrP ^C o lentivectores inyectados que expresan shRNA directamente en el tejido cerebral murino para investigar el papel de los niveles de expresión PrP ^C en la enfermedad priónica. Estos investigadores han encontrado que reduce la cantidad de PrP ^C neuronal resultó en la detención de la neuropatología progresivo de las enfermedades priónicas y extendieron la vida de los animales ^6-9. Nos han informado de que los resultados del tratamiento PrP ^C siRNA en el aclaramiento de la PrP ^Res en células de neuroblastoma de ratón ^10. Estos estudios sugieren que el uso de terapias para disminuir PrP ^C los niveles de expresión, como pequeños ARN de interferencia (siRNA), que escinde mRNA, puede suficientemente retrasar la progresión de las enfermedades priónicas. Sin embargo, la mayoría de las terapias para las enfermedades priónicas investigados fueron entregados en una forma que no sería prácticoen un entorno clínico. Por lo tanto, una terapia de ARNip necesita un sistema de administración sistémica, que se entrega por vía intravenosa y dirigido al SNC.

Los investigadores han estudiado el uso de liposomas como vehículos de administración para los productos de terapia génica. Los lípidos catiónicos y aniónicos se utilizan ambos en la formación de liposomas. Los lípidos catiónicos son los más utilizados que los lípidos aniónicos debido a que la diferencia de carga entre el lípido catiónico y el ADN / ARN permite para el embalaje eficiente. Otra ventaja de los lípidos catiónicos es que atraviesan la membrana celular más fácilmente que otros lípidos ^11-14. Sin embargo, los lípidos catiónicos son más inmunogénicos que los lípidos aniónicos ^13,14. Por lo tanto, los investigadores han comenzado a cambiar el uso catiónico a los tensioactivos aniónicos lípidos en liposomas. Productos de terapia génica se pueden empaquetar de manera eficiente en liposomas aniónicos utilizando el péptido cargado positivamente sulfato de protamina, que se condensa moléculas de ADN / ARN ^{de 15-19.} Desde lipi aniónicods son menos inmunogénicas que los lípidos catiónicos que pueden haber aumento de los tiempos de circulación, y pueden ser más toleradas en modelos animales ^13,14. Los liposomas se dirigen a tejidos específicos utilizando péptidos dirigidos que se unen a los liposomas. El neuropéptido RVG-9R, que se une a los receptores nicotínicos de la acetilcolina, se ha utilizado para orientar siRNA y liposomas para el SNC ^17-20.

Este informe describe un protocolo para producir tres vehículos de entrega de siRNA, y para empaquetar y entregar el siRNA para las células neuronales (Figura 1). complejos liposoma-siRNA-péptido (LSPCs) se componen de liposomas con siRNA y el RVG-9R péptido dirigido electrostáticamente unidos a la superficie exterior del liposoma. Péptido dirigida encapsulado en liposomas terapéuticos siRNA (PALETS) se componen de siRNA y protamina encapsulado dentro del liposoma, con RVG-9R covalentemente unido a grupos PEG de lípidos. El uso de los métodos siguientes para generar LSPCs y PALETS, PrP ^C siRNA disminuye la expresión PrP ^C hasta el 90% en las células neuronales, que posee una gran promesa para curar o retrasar la aparición de patología de la enfermedad de priones sustancialmente.

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Protocolo

Todos los animales fueron criados y mantenidos en el laboratorio de Recursos Animales, acreditados por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International, de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Estado de Colorado.

1. Preparación de LSPCs

1. Use un 1: 1 de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano): la proporción de colesterol para LSPCs. Para una preparación de liposomas nmol 4, mezclar 2 nmoles de DOTAP y 2 nmoles de colesterol en 10 ml de una solución 1: metanol en un matraz: cloroformo 1.
2. Evaporar 9 ml de cloroformo: solución de metanol usando N ₂ gas en una campana de humos. Evaporar los últimos 1 ml de disolvente en una campana de humos durante la noche sin gas. Observar una película delgada de lípidos en el fondo del matraz.
3. Heat 10 ml de una solución de sacarosa al 10% a 55 ° C.
4. Se vierte la solución de sacarosa al 10% se calienta a la película lipídica delgada lentamente, es decir, 1 ml / min, mientras que gently agitando el matraz. Mantener la sacarosa 10% y el matraz con lípidos a 55 ° C de modo que las moléculas de lípidos permanecen en la fase de gel-líquido. resultados de rehidratación en la formación de vesículas multilamelares (MLV).
5. Permitir lípidos para rehidratar a 55 ° C durante al menos una hora antes de dimensionar los liposomas.
6. Montar un extrusor según las instrucciones del fabricante con 1,0 micras filtros o usar filtros de jeringa de 1,0 micras para el dimensionamiento.
7. Añadir 1 ml de la suspensión de liposomas se calentó a una de las jeringas en la extrusora, y pasar la suspensión entre las dos jeringas 11 veces. Asegúrese de que la suspensión está en la jeringa opuesta a la jeringa comienza después de los 11 pases.
8. Tamaño de los liposomas de nuevo a través de 0,45 micras y luego 0,2 micras filtros para generar grandes vesículas unilamelares (LUV). Mantener la suspensión de liposomas se calienta para el dimensionamiento más fácil.
9. Incubar 20 l de la suspensión de liposomas 4 nmol (200 M) con 200 l de un 20 micras (4total de nmol) solución madre de siRNA para 10 min a temperatura ambiente.
10. Incubar 80 l de una 500 mM (40 nmol total de) solución RVG-9R de valores con la solución / liposoma siRNA durante 10 min a RT. LSPCs deben utilizarse tan pronto como sea posible, pero se pueden utilizar hasta varias horas después de la preparación. LSPCs se almacena a 4 ° C durante varias horas después de la preparación.

2. Preparación de palets

1. Use un 55: 5 relación molar de cualquiera de DSPE (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina):: 40 colesterol: DSPE-PEG o DOTAP: colesterol: DSPE-PEG para PALETS. Para una preparación de liposomas nmol 4, mezclar 2,2 nmoles de o bien DSPE o DOTAP, 1,6 nmoles de colesterol, y 0,2 nmoles de DSPE-PEG en 10 ml de una mezcla 2: solución de metanol en un matraz: cloroformo 1.
2. Preparar suspensión de liposomas exactamente como se describe en el paso 1.1 y 1.2 anterior. Rehidratar los liposomas DSPE en 10 ml de PBS 1x calentó a 75 ° C, la adición de 1 ml / min. Permitir lípidos para rehidratar a 75 ° C durante por lopor lo menos 1 hora antes de dimensionar.
3. Tamaño de la suspensión de liposomas exactamente como se describe en el Paso 1.6 a 1.8.
4. Pipetear 20 l de cada una de las suspensiones de liposomas 4 nmol (200 mM) en alícuotas de un solo uso después de DOTAP y DSPE liposomas han sido tamaño, y liofilizar durante 30 minutos utilizando un secador de congelación de sobremesa (Figura 2).
5. Incubar 200 l de una solución madre 20 mM (4 en total nmol) siRNA con 1,4 l de una solución 26,6 M de sulfato de protamina durante 10 min a RT para siRNA que ha de ser encapsulado en liposomas DSPE PALETS.
6. Rehidratar los liposomas DOTAP palets 200 l de una solución madre nmol 4 de siRNA o rehidratar los liposomas DSPE palets 201,4 l de la solución / protamina siRNA. Incubar solución / siRNA liposoma durante 10 min a RT.
7. Añadir 10 l de una solución 60 mM de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) a la solución de liposomas / siRNA para ambos DOTAP y DSPE PALETS.
8. Añadir 10 l de una solución 150 mM N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) a la solución de liposomas / siRNA para ambos DOTAP y DSPE PALETS.
9. Incubar la EDC y sulfo-NHS con la suspensión / liposoma siRNA durante 2 horas a RT.
10. Incubar 80 l de una 500 mM (40 nmol total de) solución RVG-9R de valores con el siRNA / liposoma solución durante 10 min a RT reticulación.
    NOTA: La EDC / sulfo-NHS permite la RVG-9r para unir covalentemente a los lípidos PEG. PALETS utilizar dentro de varias horas después de la preparación. PALETS se almacena a 4 ° C durante varias horas después de la preparación.
11. Para determinar la eficiencia de encapsulación siRNA de palets:
    1. Medir la concentración de siRNA antes y después de la adición de protamina y liposomas usando un espectrofotómetro ajustado a 260 nm.
    2. Se filtra la no encapsulado siRNA desde el liposoma suspensión siRNA / encapsulado usando 50 kDa filtros centrífugos. Centrifugar a 1000 xg durante 20 min.
    3. Medir la concentración desiRNA no encapsulado en el filtrado y la concentración de siRNA encapsulado en el material retenido usando un espectrofotómetro a 260 nm.

3. La inyección de ratones con LSPCs o PALETS

1. Exponer a los ratones durante 5-10 minutos a una lámpara de calor para dilatar la vasculatura.
2. Anestesiar ratón con un 2-3% de isofluorano / oxígeno fluya 5-10 min antes de la inyección, y durante la inyección. Confirmar la anestesia cuando los animales ya no es ambulante y respiraciones han frenado haciendo una pizca dedo del pie. Coloca el ratón sobre su parte posterior o lateral para acceder a la vena de la cola. Utilice ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar que se seque mientras está bajo anestesia.
3. Limpiar / rociar la cola con 70% de EtOH y se inyecta 300 l de LSPCs o PALETS en la vena de la cola del ratón utilizando una jeringa de 26 G de insulina. Iniciar la inyección distalmente en la vena de la cola y mover proximalmente Si la vena se derrumba o se rompe.
4. Coloque el ratón en una jaula limpia hasta que se mantiene decúbito esternal. No coloque moutilizar con otros compañeros de jaula hasta que se haya recuperado por completo. Los ratones deben recuperarse en 5 a 15 minutos. Se pueden colocar en una almohadilla eléctrica o bajo una lámpara de calor para mantener la temperatura corporal si la recuperación tarda más tiempo. Los ratones deben ser vigilados estrechamente para proteger contra el sobrecalentamiento.
5. Monitorear los animales varias horas después de la inyección para asegurar efecto de la anestesia, y no hay efectos nocivos del tratamiento. Permitir a los LSPCs o palets a circular por lo menos durante 24 horas.

4. Análisis de la expresión de proteínas a través de Citometría de Flujo

1. La eutanasia a los ratones con un CO ₂ velocidad de flujo 20% durante 15 min.
2. Diseccionar la mitad de un hemisferio del cerebro mediante el corte de la piel y el cráneo del ratón usando tijeras. Peel distancia media de un hemisferio cerebral lejos de la cráneo con unas pinzas o el extremo de un par de tijeras.
3. Press medio de un hemisferio cerebral de cada ratón a través de un filtro de células de malla de 40 micras utilizando 2,5 ml de tampón FACS (1x; PBS, 1% de suero bovino fetal, 10 mM EDTA) en una placa de Petri con el émbolo de una jeringa.
4. Enjuague el filtro de células y la placa de Petri con un adicional de 2,5 ml de tampón FACS. Poner la suspensión de células individuales en un tubo cónico de 15 ml en hielo.
5. Pipetear 100 l de la 5 ml de suspensión de células individuales en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar durante 5 min a 350 x g. Desechar el sedimento celular sobrenadante y resuspender en 1 ml de tampón de FACS. Girar a 350 xg durante 5 min. Repita con el otro 1 ml de tampón FACS. Mantener la suspensión de células en hielo.
6. Se incuban las células en 100 l de dilución 1: 100 de un / ml rata bloque anti-ratón Fc 0,5 mg en tampón FACS durante 30-60 min en hielo. Pellets y lavar las células como en el paso 4.5. Mantener la suspensión de células en hielo.
7. Se incuban las células en 100 l de un anticuerpo de 20 mg / ml fluorescente contra ratón PrP ^C en suero de ratón 7% en tampón FACS en hielo durante 30-60 min. Pellets y lavar las células como en el paso 4.5. Mantener la suspensión de célulassobre hielo.
8. Pellets y resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (1x PBS, 155 mM NH ₄ Cl, 12 mM _{de NaHCO3,} EDTA 0,1 mM) durante 1 min. Pellet como en el paso 4.5 y resuspender las células en 1 ml de tampón de FACS. Mantener la suspensión de células en hielo.
9. Analizar la expresión de PrP ^C usando un citómetro de flujo como se ha descrito previamente ^10. Puerta de las células de la población total de células en vivo. Puerta de PrP ^C + células de la población de células vivas para determinar MFI (intensidad de fluorescencia media).

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Resultados

Para aumentar la eficiencia de la encapsulación dentro de siRNA PALETS aniónicos, el ARNsi se mezcló con protamina. Para determinar la mejor concentración de protamina para el siRNA, el ARNsi se mezcló con diferentes concentraciones de protamina, a partir de 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). Había una eficiencia de encapsulación siRNA 60-65% en liposomas aniónicos sin el uso de protamina. Las muestras con protamina: relaciones molares siRNA de 1: 1 a 1,5: 1 (133 a 266 nM)...

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Discusión

Este informe describe un protocolo para crear dos sistemas de administración dirigida que transporta de manera eficiente ARNsi al SNC. Los métodos anteriores de la entrega de siRNA en el SNC incluyen la inyección de vectores de siRNA / shRNA directamente en el cerebro, la inyección intravenosa de siRNA dirigidos, o inyección intravenosa de complejos de liposomas-siRNA no dirigidas. La inyección de los vectores de siRNA / shRNA en el SNC no causa una disminución en los niveles de expresión de proteína objetivo. ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
Cholesterol	Avanti Lipids	700000
DSPE	Avanti Lipids	850715
DSPE-PEG	Avanti Lipids	880125
Chloroform	Fisher Scientific	AC268320010
Methanol	EMD Millipore	113351
N2 Gas	AirGas
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Extruder	Avanti Lipids	610023
1.0, 0.4, and 0.2 μm filters	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006
PBS	Life Technologies	70011-044
Protamine sulfate	Fisher Scientific	ICN10275205
EDC	Thermo Scientific	22980	Aliquoted for single use
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510	Aliquoted for single use
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block	BD Pharmigen	553141
Anti-PrP antibody (PRC5)	Proprietary - PRC