Livraison de siRNA thérapeutique du SNC Utilisation cationique et anionique Liposomes

Résumé

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Résumé

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrP^C) to an abnormal protease resistant isomer called PrP^Res. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrP^Res isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrP^Res formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrP^C, and are often too toxic to use in animal or human subjects.

We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrP^C is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrP^C expression of neurons in the CNS.

Introduction

Les prions sont des maladies neurodégénératives graves qui affectent le système nerveux central. Les maladies à prion résultent du mauvais repliement de la protéine prion cellulaire normale, la ^PrPc, par un isomère infectieuse appelée PrP ^Res. Ces maladies touchent une grande variété d'espèces , y compris l' encéphalopathie spongiforme bovine chez les vaches, la tremblante du mouton, la maladie du dépérissement chronique chez les cervidés et la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l' homme ^1-3. Prion provoquent la neurodégénérescence qui commence par la perte synaptique, et progresse vers vacuolisation, gliose, perte neuronale, et les dépôts de plaque. Finalement, ce qui entraîne la mort de l'animal / personne ^4. Pendant des décennies, les chercheurs ont étudié les composés destinés à ralentir ou arrêter la progression de la maladie du prion. Cependant, les chercheurs ont pas trouvé soit une thérapie réussie ou un véhicule de livraison systémique efficace.

L' expression endogène de PrP ^C est nécessaire pour le développement des maladies à prion ⁵ . Par conséquent, en diminuant ou en éliminant l' expression PrP ^C peut entraîner un retard ou l' amélioration de la maladie. Plusieurs groupes ont créé des souris transgéniques avec des niveaux réduits de PrP ^C ou lentivecteurs injectés exprimant shRNA directement dans le tissu cérébral murin pour étudier le rôle des niveaux d'expression de la PrP ^C dans les maladies à prions. Ces chercheurs ont constaté la réduction de la quantité de neurones PrP ^C ont donné lieu à l' arrêt de la neuropathologie progressive des maladies à prions et prolongé la durée de vie des animaux ^6-9. Nous avons signalé que les résultats de traitement PrP ^C siRNA de la clairance de la PrP ^Res dans les cellules de neuroblastome de souris ^10. Ces études suggèrent que l'utilisation des thérapies pour réduire les niveaux d'expression de la PrP ^C, comme des petits ARN interférents (siRNA), qui clive l' ARNm, peut suffisamment retarder la progression des maladies à prions. Cependant, la plupart des thérapies étudiées pour les maladies à prions ont été livrées d'une manière qui ne serait pas pratiquedans un contexte clinique. Par conséquent, une thérapie par ARNsi a besoin d'un système d'administration systémique, qui est délivré par voie intraveineuse et ciblée vers le système nerveux central.

Chercheurs ont étudié l'utilisation de liposomes en tant que véhicules de délivrance pour des produits de thérapie génique. Des lipides cationiques et anioniques sont utilisés à la fois dans la formation des liposomes. Des lipides cationiques sont plus largement utilisés que les lipides anioniques, car la différence de charge entre le lipide cationique et l'ADN / ARN permet un conditionnement efficace. Un autre avantage de lipides cationiques est celle qu'ils traversent la membrane cellulaire plus facilement que d' autres lipides ^11-14. Cependant, les lipides cationiques sont plus immunogènes que les lipides anioniques ^13,14. Par conséquent, les chercheurs ont commencé à passer de l'aide cationique anioniques lipides dans des liposomes. Les produits de thérapie génique peuvent être efficacement emballés dans des liposomes anioniques , en utilisant le sulfate de protamine peptide chargé positivement, qui condense les molécules d' ADN / ARN ^15-19. Depuis lipi anioniqueds sont moins immunogènes que les lipides cationiques , ils peuvent avoir une augmentation des temps de circulation, et peuvent être plus tolérés dans des modèles animaux ^13,14. Les liposomes sont ciblés vers des tissus spécifiques en utilisant des peptides de ciblage qui sont attachés à des liposomes. Neuropeptide RVG-9R, qui se lie à des récepteurs nicotiniques de l' acétylcholine, a été utilisé pour cibler l' ARNsi et des liposomes au système nerveux central ^17-20.

Ce rapport décrit un protocole pour produire trois véhicules de livraison de siRNA et d'emballer et de livrer le siRNA aux cellules neuronales (Figure 1). les complexes liposome-siRNA peptide (LSPCs) sont composées de liposomes avec l'ARNsi et RVG-9R peptide ciblant électrostatiquement fixés sur la surface extérieure du liposome. Peptide thérapeutique encapsulé dans des liposomes adressé siRNA (PALETS) sont composés d'ARNsi et la protamine encapsulé dans le liposome, avec RVG-9R lié de manière covalente à des groupes de lipides PEG. En utilisant les méthodes ci-dessous pour générer LSPCs et PALETS, PrP ^C siRNA diminue PrP ^C expression jusqu'à 90% dans les cellules neuronales, qui détient la promesse énorme pour guérir ou retarder l'apparition de la pathologie de la maladie du prion sensiblement.

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Protocole

Toutes les souris ont été élevées et maintenues au laboratoire des ressources animales, agréés par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International, conformément aux protocoles approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université d'État du Colorado.

1. Préparation de LSPCs

1. En utilisant un mélange 1: 1 DOTAP (1,2-dioléoyl-3-triméthylammonium-propane): Taux de cholestérol pour LSPCs. Pour une préparation de 4 nmol de liposomes, mélanger 2 nmoles de DOTAP et 2 nmoles de cholestérol dans 10 ml d'un mélange 1: solution de méthanol dans un ballon: 1 chloroforme.
2. S'évaporer 9 ml de chloroforme et une solution de methanol en utilisant du _N2 gazeux sous une hotte aspirante. Evaporer les dernières 1 ml de solvant dans une hotte nuit sans gaz. Observer un mince film de lipide sur le fond du flacon.
3. Chauffer 10 ml d'une solution de saccharose à 10% à 55 ° C.
4. Verser la solution de saccharose à 10% chauffé sur le film lipidique mince lentement, soit 1 ml / min, tandis que GEtourbillonnant ntly le ballon. Maintenir le saccharose à 10% et d'un flacon avec les lipides à 55 ° C, de sorte que les molécules de lipides restent dans la phase gel-liquide. Résultats de réhydratation dans des vésicules (MLV) formation multilamellaire.
5. Laisser les lipides se réhydrater à 55 ° C pendant au moins une heure avant le dimensionnement des liposomes.
6. Assembler une extrudeuse selon les instructions du fabricant avec 1,0 um filtres ou utiliser des filtres de seringue 1,0 um pour le dimensionnement.
7. Ajouter 1 ml de la suspension de liposomes chauffé à une des seringues à l'extrudeuse, et passer la suspension entre les deux seringues de 11 fois. Assurez-vous que la suspension est dans la seringue opposée à la seringue de départ après 11 passes.
8. Taille des liposomes à nouveau de 0,45 um puis 0,2 um filtres pour générer de grandes vésicules unilamellaires (LUV). Gardez la suspension de liposomes chauffé pour faciliter le dimensionnement.
9. Incuber 20 ul de 4 nmol suspension de liposomes (200 um) avec 200 ul d'une 20 um (4totale nmol) de solution mère de siRNA pendant 10 min à température ambiante.
10. Incuber 80 ul d'un 500 uM (40 nmol totale) de solution RVG-9r disponible avec la solution / liposome siRNA pendant 10 min à température ambiante. LSPCs doivent être utilisés le plus tôt possible, mais peuvent être utilisés jusqu'à plusieurs heures après la préparation. LSPCs Conserver à 4 ° C pendant plusieurs heures après la préparation.

2. Préparation de PALETS

1. Utiliser un 55 ratio molaire 5 de l'une ou l'autre DSPE (1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine): 40 cholestérol: DSPE-PEG ou de DOTAP: cholestérol: DSPE-PEG pour PALETS. Pour une préparation de 4 nmol de liposomes, mélanger 2,2 nmol de chacune DSPE ou DOTAP, 1,6 nmol de cholestérol, et 0,2 nmoles de DSPE-PEG dans 10 ml d'un mélange 2: solution de méthanol dans un ballon: 1 chloroforme.
2. Préparer suspension de liposomes exactement comme décrit à l'étape 1.1 et 1.2 ci-dessus. Réhydrater les liposomes DSPE dans 10 ml de 1 x PBS chauffé à 75 ° C, en ajoutant 1 ml / min. Laisser les lipides se réhydrater à 75 ° C pendant aumoins 1 h avant de dimensionner.
3. Taille de la suspension de liposomes exactement comme décrit à l'étape 1,6-1,8.
4. Pipet 20 pi de chacune des 4 nmole (200 uM) suspensions de liposomes en aliquots à usage unique après DOTAP et DSPE liposomes ont été de taille, et lyophiliser pendant 30 minutes en utilisant un lyophilisateur de paillasse (Figure 2).
5. Incuber 200 pi d'un 20 uM (4 au total nmole) stock solution siRNA avec 1,4 ul d'une solution de 26,6 uM de sulfate de protamine pendant 10 min à température ambiante pendant siRNA qui doit être encapsulé dans des liposomes DSPE Palets.
6. Réhydrater les liposomes DOTAP Palets avec 200 pi d'une solution à 4 actions nmole de siRNA ou réhydrater liposomes DSPE Palets avec 201,4 pi de la solution / protamine siRNA. Incuber la solution / ARNsi de liposomes pendant 10 min à température ambiante.
7. Ajouter 10 ul d'un 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), une solution 60 mM à la solution de liposomes / ARNsi pour les DOTAP et PALETS DSPE.
8. Ajouter 10 ul d'une 150 mM de N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) solution à la solution de liposomes / ARNsi pour les DOTAP et PALETS DSPE.
9. Incuber EDC et sulfo-NHS avec le / suspension de liposomes siRNA pendant 2 heures à la température ambiante.
10. Incuber 80 ul d'un 500 uM (40 nmol totale) de solution RVG-9r actions avec le siRNA / liposome solution pendant 10 min à température ambiante de réticulation.
    NOTE: L'ECD / sulfo-NHS permet au RVG-9r pour lier de manière covalente aux lipides PEG. Utilisez PALETS au sein de plusieurs heures après la préparation. PALETS Conserver à 4 ° C pendant plusieurs heures après la préparation.
11. Pour déterminer siRNA encapsulation efficacité de PALETS:
    1. Mesurer la concentration de l'ARNsi avant et après l'addition de protamine et des liposomes en utilisant un spectrophotomètre réglé à 260 nm.
    2. Filtrer le ARNsi non encapsulée dans le liposome / encapsulée suspension ARNsi en utilisant des filtres centrifuges 50 kDa. Centrifuger à 1000 xg pendant 20 min.
    3. Mesurer la concentration deARNsi non encapsulée dans le filtrat et la concentration de l'ARNsi encapsulé dans le rétentat à l'aide d'un spectrophotomètre à 260 nm.

3. Injecter Souris avec LSPCs ou PALETS

1. Exposer les souris pendant 5 à 10 min à une lampe chauffante pour dilater le système vasculaire.
2. Anesthetize souris avec un 2-3% isofluorane / oxygène flux 5-10 min avant l'injection, et pendant l'injection. Confirmer anesthetization lorsque l'animal est plus ambulant et la respiration ont ralenti en faisant une pincée d'orteil. Placez la souris sur le dos ou sur le côté pour accéder à la veine de la queue. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement sous anesthésie.
3. Essuyez / pulvériser la queue avec 70% EtOH et injecter 300 pi de LSPCs ou PALETS sur la veine de la queue de la souris à l'aide d'une seringue à insuline G 26. Commencer à injecter distalement dans la veine de la queue et de se déplacer proximalement si la veine s'effondre ou ruptures.
4. Placez la souris dans une cage propre jusqu'à ce qu'elle maintient décubitus sternale. Ne placez pas moutiliser avec d'autres compagnons de cage jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré. Les souris doivent récupérer en 5 à 15 min. Ils peuvent être placés sur un coussin chauffant ou sous une lampe de chaleur pour maintenir la température du corps si la récupération prend plus de temps. Les souris doivent être étroitement surveillés pour se protéger contre la surchauffe.
5. Surveiller les animaux plusieurs heures après l'injection pour assurer l'anesthésie se dissipe, et il n'y a pas de mauvais effets du traitement. Permettre aux LSPCs ou PALETS de circuler pendant au moins 24 heures.

4. Analyse de l'expression des protéines par l'intermédiaire de cytométrie en flux

1. Euthanasier souris avec un débit de 20% de CO ₂ pendant 15 min.
2. Disséquer un demi-hémisphère du cerveau en coupant la peau et le crâne de la souris à l'aide de ciseaux. Peler la moitié d'un hémisphère de cerveau loin du crâne à l'aide de pinces ou la fin d'une paire de ciseaux.
3. Presser la moitié d'un hémisphère de cerveau de chaque souris à travers un tamis de maille 40 um en utilisant 2,5 ml de tampon FACS (1x; Du PBS, 1% de sérum bovin fœtal, 10 mM d'EDTA) dans une boîte de Petri avec le piston d'une seringue.
4. Rincer la crépine cellulaire et boîte de Pétri avec un 2,5 ml supplémentaires de tampon FACS. Mettre la suspension monocellulaire dans un tube conique de 15 ml sur de la glace.
5. Distribuer 100 ul de 5 ml seule suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml et centrifuger pendant 5 min à 350 x g. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 1 ml de tampon FACS. Spin à 350 g pendant 5 min. Répéter l'opération avec un autre 1 ml de tampon FACS. Gardez la suspension de cellules sur la glace.
6. Incuber les cellules dans 100 ul de dilution 1: 100 d'une solution à 0,5 mg / ml de rat bloc Fc anti-souris dans un tampon de FACS pendant 30 à 60 minutes sur de la glace. Pellet et laver les cellules comme dans l'étape 4.5. Gardez la suspension de cellules sur la glace.
7. Incuber les cellules dans 100 ul d'une 20 pg / ml d' anticorps fluorescent contre les souris PrP ^C dans le sérum de la souris 7% dans un tampon FACS sur la glace pendant 30 à 60 min. Pellet et laver les cellules comme dans l'étape 4.5. Gardez la suspension cellulairesur la glace.
8. Pellet et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse RBC (1x PBS, 155 mM NH ₄ Cl, 12 mM NaHCO _3, EDTA 0,1 mM) pendant 1 min. Pellet à l'étape 4.5 et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon FACS. Gardez la suspension de cellules sur la glace.
9. Analyser la ^PrPc expression en utilisant un cytomètre en flux comme décrit précédemment ^10. Porte cellules de la population cellulaire totale vit. Porte PrP ^C + cellules de la population de cellules vivantes pour déterminer MFI (intensité de fluorescence de la médiane).

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Résultats

Pour augmenter l'efficacité de l'ARNsi à l'intérieur de l'encapsulation PALETS anioniques, l'ARNic a été mélangé avec de la protamine. Pour déterminer la meilleure concentration de protamine pour l'ARNsi, l'ARNic a été mélangé avec différentes concentrations de protamine, de 1: 1 à 2: 1 (figure 3A). Il y avait un rendement d'encapsulation ARNsi de 60 à 65% dans des liposomes anioniques sans l'utilisation de la protamine....

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Discussion

Ce rapport décrit un protocole pour créer deux systèmes d'administration ciblés qui transporte efficacement siRNA au SNC. Les procédés antérieurs de prestation ARNsi au système nerveux central inclus l'injection des vecteurs de siRNA / shRNA directement dans le cerveau, l'injection intraveineuse de siRNA ciblé, ou injection intraveineuse de complexes de liposomes ARNsi non ciblées. Injection de vecteurs de siRNA / shRNA dans le système nerveux central ne provoque une diminution du taux d'expre...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
Cholesterol	Avanti Lipids	700000
DSPE	Avanti Lipids	850715
DSPE-PEG	Avanti Lipids	880125
Chloroform	Fisher Scientific	AC268320010
Methanol	EMD Millipore	113351
N2 Gas	AirGas
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Extruder	Avanti Lipids	610023
1.0, 0.4, and 0.2 μm filters	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006
PBS	Life Technologies	70011-044
Protamine sulfate	Fisher Scientific	ICN10275205
EDC	Thermo Scientific	22980	Aliquoted for single use
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510	Aliquoted for single use
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block	BD Pharmigen	553141
Anti-PrP antibody (PRC5)	Proprietary - PRC