Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Zusammenfassung

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Zusammenfassung

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrP^C) to an abnormal protease resistant isomer called PrP^Res. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrP^Res isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrP^Res formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrP^C, and are often too toxic to use in animal or human subjects.

We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrP^C is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrP^C expression of neurons in the CNS.

Einleitung

Prionen sind schwere neurodegenerative Erkrankungen, die das ZNS beeinflussen. Prionenkrankheiten ergeben sich aus der Fehlfaltung des normalen zellulären Prionproteins PrP ^C, durch einen infektiösen Isomer genannt PrP ^Res. Diese Krankheiten betreffen eine Vielzahl von Arten , einschließlich der bovinen spongiformen Enzephalopathie bei Rindern, Scrapie bei Schafen, Chronic Wasting Disease bei Hirschartigen, und der Creutzfeldt-Jakob - Krankheit beim Menschen ^1-3. Prionen verursachen Neurodegeneration, die mit synaptischen Verlust beginnt, und zu Vakuolisation fortschreitet, Gliose, Neuronenverlust und Plaque-Ablagerungen. Schließlich, was zum Tod des Tieres / Einzel - ^4. Seit Jahrzehnten haben Forscher untersuchten Verbindungen gemeint, zu verlangsamen oder das Fortschreiten der Prionenerkrankung stoppen. Allerdings haben die Forscher nicht entweder eine erfolgreiche Therapie oder eine wirksame systemische Abgabe Fahrzeug gefunden.

Endogenes PrP ^C Expression für die Entwicklung von Prionenkrankheiten notwendigen ⁵ . Daher Verringern oder Eliminieren PrP ^C - Expression in einer Verzögerung oder Linderung von Krankheiten führen kann. Mehrere Gruppen erstellt transgene Mäuse mit reduzierten Mengen an PrP ^C oder injiziert lentivectors shRNA direkt in murine Hirngewebe exprimiert die Rolle von PrP ^C - Expressionsniveaus in Prion - Krankheit zu untersuchen. Diese Forscher Verringerung der Menge an neuronaler PrP ^C gefunden führte die progressive neuropathology von Prion - Erkrankungen in Anhalten und verlängert die Lebensdauer der Tiere ^6-9. Wir haben in der Clearance von PrP ^Res in Maus - Neuroblastomzellen ¹⁰ , dass PrP ^C siRNA Behandlungsergebnisse berichtet. Diese Studien legen nahe , dass die Verwendung von Therapien PrP ^C Expressionsniveaus, wie small interfering RNA (siRNA), die spaltet mRNA, ausreichend verzögert das Fortschreiten der Prion - Krankheiten können zu verringern. Allerdings sind die meisten Therapien für Prionenerkrankungen untersucht wurden in einer Weise geliefert, die nicht praktikabel wärein einer klinischen Umgebung. Daher muss ein siRNA-Therapie eine systemische Verabreichungssystem, das an das ZNS intravenös und gezielte geliefert wird.

Die Ermittler haben die Verwendung von Liposomen als Abgabevehikel für die Gentherapie Produkte untersucht. Kationische und anionische Lipide zur Bildung von Liposomen verwendet beides. Kationische Lipide sind weiter verbreitet als anionische Lipide verwendet, weil die Ladungsdifferenz zwischen dem kationischen Lipid und DNA / RNA für eine effiziente Verpackung ermöglicht. Ein weiterer Vorteil von kationischen Lipiden ist , dass sie die Zellmembran leichter als andere Lipide ^11-14 kreuzen. Jedoch kationische Lipide sind immunogener als anionische Lipide ^13,14. Daher haben begonnen Forscher unter Verwendung von kationischen zu verschieben Lipiden in Liposomen anionische. Die Gentherapie Produkte effizient in anionische Liposomen verpackt werden , um die positiv geladenen Peptid Protaminsulfat verwendet, die DNA kondensiert / RNA - Moleküle ^15-19. Da anionische lipids sind weniger immunogen als kationische Lipide sie Zirkulationszeiten zugenommen haben kann, und kann in Tiermodellen ^13,14 toleriert werden. Liposome werden auf spezifische Gewebe gezielt Peptide unter Verwendung von Targeting, die an die Liposomen gebunden sind. Die RVG-9R Neuropeptid, das an nikotinische Acetylcholin - Rezeptoren bindet, wurde verwendet, siRNA und Liposomen an das ZNS ^17-20 abzuzielen.

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll drei siRNA Fahrzeuge zu produzieren und zu verpacken und die siRNA zu neuronalen Zellen (Abbildung 1) zu liefern. Liposom-siRNA-Peptid-Komplexe (LSPCs) bestehen aus Liposomen mit siRNA und die RVG-9R Peptid elektrostatisch an der äußeren Oberfläche des Liposoms Targeting. Peptid gerichtet Liposomen therapeutische siRNA (PALETS) eingekapselt sind, bestehend aus siRNA und Protamin im Liposom verkapselt, mit RVG-9R zu Lipid PEG-Gruppen kovalent gebunden sind. die folgenden Methoden verwenden LSPCs und PALET zu erzeugenS, PrP ^C siRNA verringert PrP ^C Ausdruck zu 90% in neuronalen Zellen auf, die enorme Versprechen hält das Auftreten von Prion - Krankheit Pathologie zu heilen oder erheblich verzögern.

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Protokoll

Alle Mäuse wurden in Labortier Ressourcen gezüchtet und gepflegt, von der Association akkreditiert für Evaluierung und Akkreditierung von Lab Animal Care International, in Übereinstimmung mit den Protokollen von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Colorado State University genehmigt.

1. Herstellung von LSPCs

1. Verwenden Sie ein 1: 1 DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan): Cholesterin-Verhältnis für LSPCs. Für ein 4 nmol Liposom-Zubereitung, Mischung 2 nmol DOTAP und 2 nmol von Cholesterin in 10 ml eines 1: 1 Chloroform: Methanol-Lösung in einem Kolben.
2. Verdunsten 9 ml Chloroform: Methanol - Lösung unter Verwendung von N ₂ -Gas in einer Abzugshaube. Dampft die letzten 1 ml Lösungsmittel in einem Abzug über Nacht ohne Gas. Beobachten eines dünnen Lipidfilm auf dem Boden des Kolbens.
3. Wärme 10 ml einer 10% Saccharose-Lösung auf 55 ° C.
4. Gießen Sie die erhitzte 10% Saccharose - Lösung auf die dünne Lipidfilm langsam, dh 1 ml / min, während gently Schwenken des Kolbens. Aufrechterhaltung der 10% Sucrose und Kolben mit Lipiden bei 55 ° C so, dass die Lipidmoleküle in dem Gel-Flüssigkeits-Phase verbleiben. Rehydrierung Ergebnisse in multilamellare Vesikel (MLV) Bildung.
5. Erlauben Lipide für mindestens eine Stunde bei 55 ° C rehydriert, bevor die Liposomen Größen.
6. Montieren eines Extruders den Anweisungen des Herstellers mit 1,0 & mgr; m-Filter oder verwenden 1,0 um Spritzenfilter für die Dimensionierung.
7. 1 ml der erwärmten Liposomensuspension auf eine der Spritzen auf den Extruder, und passieren die Suspension zwischen den zwei Spritzen 11 mal. Stellen Sie sicher, dass die Suspension in die entgegengesetzte Spritze ist als die Ausgangs Spritze nach den 11 verläuft.
8. Größe die Liposomen wieder durch 0,45 um dann 0,2 um Filter große unilamellare Vesikel (LUV) zu erzeugen. Halten Sie die Liposomensuspension zur einfacheren Dimensionierung erwärmt.
9. Inkubiere 20 ul des 4 nmol Liposom-Suspension (200 & mgr; M) mit 200 & mgr; l einer 20 & mgr; M (4nmol gesamt) Lager siRNA-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
10. Inkubiere 80 ul einer 500 uM (40 nmol Gesamt) stock RVG-9R-Lösung mit der siRNA / Liposom-Lösung für 10 min bei RT. LSPCs sollte so bald wie möglich verwendet werden, sondern kann bis zu mehreren Stunden nach der Herstellung verwendet werden. Store LSPCs bei 4 ° C für mehrere Stunden nach der Zubereitung.

2. Herstellung von PALETS

1. Verwenden, um eine 55: 40: 5 Molverhältnis von entweder DSPE (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin): Cholesterin: DSPE-PEG oder DOTAP: Cholesterin: DSPE-PEG für PALETS. Für ein 4 nmol Liposom-Zubereitung, Mischung 2,2 nmol entweder DSPE oder DOTAP, 1,6 nMol von Cholesterin und 0,2 nmol von DSPE-PEG in 10 ml eines 2: 1 Chloroform: Methanol-Lösung in einem Kolben.
2. Bereiten Sie Liposomensuspension genau wie in Schritt 1.1 und 1.2 oben beschrieben. Rehydrieren DSPE-Liposomen in 10 ml 1x PBS erhitzt auf 75ºC, Zugabe von 1 ml / min. Erlauben Lipiden bei 75 ° C rehydriert zuminmindestens 1 Stunde vor dem Kalibrieren.
3. Größe der Liposomensuspension genau wie in Schritt 1.6-1.8 beschrieben.
4. Pipettieren 20 ul jeder der 4 nmol (200 uM) Liposomensuspensionen in einzelne Aliquots nach DOTAP und DSPE Liposomen Größe gewesen, und für 30 min lyophilisieren ein Benchtop - Gefriertrockner (Abbildung 2).
5. Inkubieren 200 ul einer 20 uM (4 nmol Gesamt) stock siRNA-Lösung mit 1,4 ul einer 26,6 & mgr; M Lösung von Protaminsulfat für 10 min bei RT für siRNA, die in DSPE PALETS Liposomen verkapselt werden soll.
6. Rehydratisieren die DOTAP PALETS Liposomen mit 200 ul einer 4 nmol Stammlösung von siRNA oder DSPE PALETS Liposomen mit 201,4 & mgr; l der siRNA / Protamin Lösung rehydratisiert. Inkubieren Liposom / siRNA-Lösung für 10 min bei RT.
7. Werden 10 ul einer 60 mM 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) Lösung der Liposomen / siRNA Lösung sowohl DOTAP und DSPE PALETS.
8. Werden 10 ul einer 150 mM N-Hydroxysulfosuccinimid (sulfo-NHS) Lösung der Liposomen / siRNA Lösung sowohl DOTAP und DSPE PALETS.
9. Inkubieren des EDC und sulfo-NHS mit der siRNA / Liposomen-Suspension für 2 h bei RT.
10. Inkubiere 80 ul einer 500 uM (40 nmol Gesamt) stock RVG-9R-Lösung mit der siRNA / Liposom-Vernetzungslösung für 10 min bei RT.
    HINWEIS: Die EDC / Sulfo-NHS die RVG-9R zu kovalent an die PEG-Lipide ermöglicht. Verwenden Sie PALETS innerhalb von mehreren Stunden nach der Vorbereitung. Store PALETS bei 4 ° C für mehrere Stunden nach der Zubereitung.
11. Um siRNA Verkapselungswirksamkeit von PALETS bestimmen:
    1. Messen der Konzentration von siRNA vor und nach der Zugabe von Protamin und Liposomen unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 260 nm eingestellt.
    2. Filtern Sie die nicht eingekapselten siRNA aus dem Liposom / verkapselt siRNA Suspension mit 50 kDa Zentrifugalfilter. Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min.
    3. Messen der Konzentration vonunverkapselte siRNA im Filtrat und der Konzentration an verkapseltem siRNA im Retentat eines Spektrophotometers bei 260 nm verwendet wird.

3. Injizierender Mäuse mit LSPCs oder PALETS

1. Expose Mäuse für 5-10 min einer Wärmelampe Gefäß aufzuweiten.
2. Anesthetize Maus mit einem 2-3% Isofluran / Sauerstoff fließen 5-10 min vor der Injektion und während der Injektion. Bestätigen anesthetization wenn Tier ist nicht mehr ambulanter und Respiration verlangsamt haben durch eine Zehe Prise zu tun. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken oder der Seite, um die Schwanzvene zugreifen. Verwenden Sie vet Salbe auf die Augen der Maus Austrocknen zu verhindern, während sie unter Narkose.
3. Wischen / Spray den Schwanz mit 70% EtOH und injizieren 300 ul LSPCs oder PALETS auf die Schwanzvene der Maus eine 26 G Insulin-Spritze. Beginnen Sie distal in die Schwanzvene Injektion und proximal zu bewegen, wenn die Vene oder Brüche zusammenbricht.
4. Bewegen Sie die Maus in einem sauberen Käfig, bis sie Brustlage beibehält. Stellen Sie keine moverwenden, um mit anderen Käfiggenossen, bis sie vollständig erholt hat. Die Mäuse sollten in 5 bis 15 min zu erholen. Sie können auf einem Heizkissen oder unter einer Heizlampe angeordnet werden Körpertemperatur zu halten, wenn Erholung länger braucht. Die Mäuse sollten genau überwacht werden, um Schutz vor Überhitzung.
5. Überwachen Sie die Tier mehrere Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, Anästhesie nachlässt, und es gibt keine negativen Auswirkungen der Behandlung. Lassen Sie die LSPCs oder PALETS für mindestens 24 Stunden zirkulieren zu lassen.

4. Analyse der Proteinexpression über Durchflusszytometrie

1. Euthanize Mäuse mit einer 20% CO ₂ Durchflussrate für 15 min.
2. Präparieren aus einem halben Hemisphäre des Gehirns durch Schneiden der Haut und Schädel der Maus mit einer Schere entfernt. Peel weg halben Hemisphäre des Gehirns aus dem Schädel entfernt Zangen oder das Ende einer Schere.
3. Press halben Hemisphäre des Gehirns von jeder Maus durch ein 40 & mgr; m mesh Zellsieb 2,5 ml FACS Puffer (1x; PBS, 1% fötalem Rinderserum, 10 mM EDTA) in einer Petrischale mit dem Kolben einer Spritze.
4. Spülen Sie die Zelle Sieb und Petrischale mit einem zusätzlichen 2,5 ml FACS-Puffer. Legen Sie die Einzelzellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis.
5. Jeweils 100 ul der 5 ml Einzelzellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 350 x g. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer. Spin bei 350 xg für 5 min. Wiederholen Sie mit weiteren 1 ml FACS-Puffer. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
6. Inkubieren der Zellen in 100 ul 1: 100-Verdünnung einer 0,5 mg / ml Ratten-anti-Maus-Fc-Block in FACS-Puffer für 30-60 min auf Eis. Pelletieren, und die Zellen wie in Schritt 4.5 waschen. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
7. Inkubieren der Zellen in 100 ul einer 20 ug / ml Fluoreszenz - Antikörper gegen Maus - PrP ^C in 7% Mausserum in FACS - Puffer auf Eis für 30-60 min. Pelletieren, und die Zellen wie in Schritt 4.5 waschen. Halten Sie die Zellsuspensionauf Eis.
8. Pellet und die Zellen in 1 ml RBC - Lyse - Puffer (1x PBS, 155 mM NH ₄ Cl, 12 mM NaHCO _3, 0,1 mM EDTA) für 1 min resuspendieren. Pellet wie in Schritt 4.5 und die Zellen in 1 ml FACS-Puffer resuspendieren. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
9. Analysieren PrP ^C - Ausdruck ein Durchflusszytometer unter Verwendung von wie zuvor ¹⁰ beschrieben. Tor lebende Zellen aus Gesamtzellpopulation. Tor PrP ^C + Zellen von lebenden Zellpopulation MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) zu bestimmen.

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Ergebnisse

Um die Effizienz der siRNA Die Verkapselung in anionischer PALETS erhöhen, wurde die siRNA mit Protamin gemischt. Um die beste Protamin Konzentration für die siRNA bestimmen, wurde die siRNA mit verschiedenen Konzentrationen von Protamin gemischt, von 1: 1 bis 2: 1 (3A). Es gab eine 60-65% siRNA Verkapselungseffizienz in anionischen Liposomen ohne Verwendung von Protamin. Proben mit Protamin: siRNA Molverhältnissen von 1: 1 bis 1,5: 1 (133-266 nM) hatten 80-90% siRNA ...

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Diskussion

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll, das zwei Systeme zur gezielten Verabreichung zu schaffen, die effizient siRNA zum ZNS transportiert. Frühere Verfahren zur enthalten siRNA zum ZNS Liefern Injizieren siRNA / shRNA Vektoren direkt in das Gehirn, intravenöse Injektion von gezielten siRNA oder intravenöse Injektion von nicht-zielgerichteten Liposomen-siRNA-Komplexe. Injektion von siRNA / shRNA Vektoren in das ZNS verursacht eine Abnahme der Zielprotein-Expressionsniveaus. Jedoch die siRNA / shRNA diffundiert nich...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
Cholesterol	Avanti Lipids	700000
DSPE	Avanti Lipids	850715
DSPE-PEG	Avanti Lipids	880125
Chloroform	Fisher Scientific	AC268320010
Methanol	EMD Millipore	113351
N2 Gas	AirGas
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Extruder	Avanti Lipids	610023
1.0, 0.4, and 0.2 μm filters	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006
PBS	Life Technologies	70011-044
Protamine sulfate	Fisher Scientific	ICN10275205
EDC	Thermo Scientific	22980	Aliquoted for single use
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510	Aliquoted for single use
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block	BD Pharmigen	553141
Anti-PrP antibody (PRC5)	Proprietary - PRC