JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Abstract

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects.

We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

Introduction

פריונים הן מחלות ניווניות קשות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית. מחלות פריון לנבוע misfolding של חלבון הפריון הסלולרי הרגיל, PRP C, על ידי האיזומר זיהומיות בשם PRP מיל. מחלות אלו משפיעים מגוון רחב של מינים, כולל ספגת המוח בפרות, scrapie בכבשים, חולה במחלה ממארת כרונית cervids, ואת מחלת קרויצפלד-יעקב בבני אדם 1-3. פריונים לגרום ניוון מוחיה שמתחיל עם אובדן הסינפטי, ומתקדם כדי vacuolization, דבק, איבוד עצבי, ופיקדונות פלאק. בסופו של דבר, מה שגרם למותם של בעלי החיים / 4 פרט. במשך עשרות שנים, חוקרים חקרו תרכובות אמורות להאט או לעצור את התקדמות מחלת פריון. עם זאת, חוקרים לא מצאו או טיפול מוצלח או רכב משלוח מערכתי אפקטיבי.

ביטוי PRP C אנדוגני נדרש לפיתוח מחלות הפריון 5 . לכן, הפחתה או ביטול ביטוי PRP C עלול לגרום עיכוב או שיפור של מחלה. מספר קבוצות יצרו עכברים טרנסגניים עם רמות נמוכות של PRP C או lentivectors מוזרק המבטא shRNA ישירות לתוך רקמת המוח בעכברים לחקור את התפקיד של רמות הביטוי PRP C במחלת הפריון. חוקרים אלה מצאו הפחתת כמות העצבית PRP C הביא לעצירת בנוירופתולוגיה מתקדמת של מחלות הפריון והאריך את החיים של בעלי החיים 6-9. אנחנו דיווחנו על תוצאות טיפול PRP C siRNA בסילוק של PRP מיל בתאי נוירובלסטומה עכבר 10. מחקרים אלה מראים כי השימוש של טיפולים כדי להפחית את רמות ביטוי PRP C, כמו RNA התערבות הקטן (siRNA), אשר מסלק mRNA, אולי מספיק לעכב את התקדמות מחלות פריון. עם זאת, רוב הטיפולים נחקר למחלות הפריון נמסרו בדרכים לא יהיה מעשיבמסגרת רפואית. לכן, טיפול siRNA צריך מערכת משלוח מערכתית, אשר מועברת דרך וריד וממוקד אל מערכת העצבים המרכזי.

החוקרים חקרו את השימוש ליפוזומים כרכב משלוח למוצרי ריפוי גנטי. שומני קטיוני anionic הוא משמשים ההיווצרות של ליפוזומים. שומני קטיוני משמשים באופן נרחב יותר מאשר שומני anionic כי הבדל התשלום בין שומני קטיוני ה- DNA / RNA מאפשר אריזה יעילה. יתרון נוסף של שומני קטיוני הוא שהם לחצות את קרום התא בקלות רבה יותר מאשר שומנים אחרים 11-14. עם זאת, שומנים קטיוני יותר immunogenic מאשר שומנים anionic 13,14. לכן, החוקרים החלו המעבר משימוש קטיוני כדי anionic שומנים ליפוזומים. ג'ין מוצרי טיפול ניתן לארוז ביעילות לתוך ליפוזומים anionic באמצעות סולפט protamine פפטיד בעלי מטען חשמלי חיובי, אשר מתעבה מולקולות DNA / RNA 15-19. מאז lipi anionicds פחות immunogenic מאשר שומנים קטיוני הם עשויים גדלו פעמים במחזור, ועלול להיות נסבל יותר במודלים של בעלי חיים 13,14. ליפוזומים ממוקדים רקמות ספציפיות באמצעות מיקוד פפטידים מחוברים אל ליפוזומים. ונוירופפטידים RVG-9R, אשר נקשר לקולטנים אצטילכולין ניקוטינית, נעשה שימוש כדי למקד siRNA ו ליפוזומים אל CNS 17-20.

דו"ח זה מתאר פרוטוקול לייצר שלושה כלי רכב משלוח siRNA, וכדי לארוז ולספק את siRNA לתאי נוירונים (איור 1). Liposome-siRNA-פפטיד מתחמי (LSPCs) מורכבים ליפוזומים עם siRNA ואת RVG-9R מיקוד פפטיד אלקטרוסטטי מחובר אל פני השטח החיצוני של liposome. פפטיד התייחס ליפוזום כמוס siRNA (PALETS) טיפוליות מורכבות siRNA ו protamine כמוס בתוך liposome, עם ערובה RVG-9R קוולנטית לקבוצות PEG השומנים. באמצעות השיטות הבאות כדי ליצור LSPCs ו PaletS, PRP C siRNA פוחתת ביטוי PRP C עד 90% ב תאים עצביים, אשר טומן בחובו הבטחה עצומה לרפא או מהותית לעכב את התחלתה של פתולוגיה מחלת הפריון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל העכברים גידלו ומתוחזק על משאבי חיית מעבדה, מוכר על ידי האגודה הערכה וההסמכה של הבינלאומי טיפול בבעלי חיים מעבדה, בהתאם הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת קולורדו.

1. הכנת LSPCs

  1. השתמש 1: DOTAP 1 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-פרופאן): יחס כולסטרול עבור LSPCs. לקבלת הכנה liposome 4 nmole, לערבב 2 nmoles של DOTAP ו -2 nmoles של כולסטרול לתוך 10 מ"ל של 1: פתרון מתנול בבקבוק: כלורופורם 1.
  2. להתאדות 9 מ"ל של כלורופורם: פתרון מתנול באמצעות גז N 2 במנדף. לאדות את 1 מ"ל האחרון של ממס במנדף לילה בלי גז. שים סרט שומנים דק על החלק התחתון של הבקבוק.
  3. מקצה 10 מ"ל של תמיסת סוכרוז 10% ל -55 מעלות צלזיוס.
  4. יוצקים את הפתרון סוכרוז 10% מחומם על הסרט השומנים דק לאט, כלומר 1 מ"ל / דקה, תוך gently מתערבל את הבקבוק. לשמור על 10% סוכרוז בקבוק עם שומנים ב 55 מעלות צלזיוס, כך שמולקולות השומנים להישאר בשלב ג'ל נוזלי. תוצאות Rehydration ב שלפוחית ​​multilamellar היווצרות (MLV).
  5. אפשר שומני רעננותם על 55 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת לפני אומד את ליפוזומים.
  6. להרכיב מכבש לפי הוראות יצרן עם 1.0 מיקרומטר מסננים או להשתמש במסנני מזרק 1.0 מיקרומטר עבור אומדת.
  7. הוסף 1 מ"ל של ההשעיה liposome מחוממת לאחד מזרקים על מכבש, ולהעביר את ההשעיה בין שני מזרקים 11 פעמים. ודא כי ההשעיה היא בתוך המזרק מול מ המזרק המתחילות לאחר 11 המעברים.
  8. את הגודל ליפוזומים שוב דרך 0.45 מיקרומטר אז 0.2 מיקרומטר מסנן כדי ליצור שלפוחית ​​unilamellar גדולה (חביבה). שמור את השעית liposome המחוממת עבור אומדת קלה.
  9. דגירה 20 μl של השעיה liposome 4 nmole (200 מיקרומטר) עם 200 μl של 20 מיקרומטר (4סך nmole) פתרון siRNA מניה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. דגירה 80 μl של 500 מיקרומטר (40 nmole סה"כ) פתרון המניות RVG-9R עם הפתרון siRNA / ליפוזום במשך 10 דקות ב RT. LSPCs אמור לשמש בהקדם האפשרי, אך ניתן להשתמש עד כמה שעות לאחר ההכנה. LSPCs חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות לאחר ההכנה.

2. הכנת PALETS

  1. השתמש 55: 40: יחס טוחנת -5 או DSPE (1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine): כולסטרול: DSPE-PEG או DOTAP: כולסטרול: DSPE-PEG עבור PALETS. לקבלת הכנה liposome 4 nmole, לערבב 2.2 nmoles מאחד DSPE או DOTAP, 1.6 nmoles של כולסטרול, ו -0.2 nmoles של DSPE-PEG לתוך 10 מ"ל של 2: פתרון מתנול בבקבוק: כלורופורם 1.
  2. כן השעית liposome בדיוק כמתואר שלב 1.1 ו -1.2 לעיל. רעננותם ליפוזומים DSPE ב 10 מ"ל של 1x PBS מחומם ל 75 מעלות צלזיוס, הוספת 1 מ"ל / דקה. אפשר שומני רעננותם על 75 מעלות צלזיוס למשך1 לפחות שעה לפני אומדת.
  3. גודל ההשעיה liposome בדיוק כמתואר שלב 1.6-1.8.
  4. Pipet 20 μl של כל אחד 4 nmole (200 מיקרומטר) השעיות liposome לתוך aliquots ליחד לאחר ליפוזומים DOTAP ו DSPE כבר בגודל, ו Lyophilize למשך 30 דקות באמצעות מייבש הקפאה benchtop (איור 2).
  5. דגירה 200 μl של 20 מיקרומטר פתרון siRNA המניה (4 nmole הכל) עם 1.4 μl של סולפט 26.6 מיקרומטר פתרון של protamine במשך 10 דקות ב RT עבור siRNA כי היא להיות במארז לתוך ליפוזומים DSPE PALETS.
  6. רעננותם ליפוזומים DOTAP PALETS עם 200 μl של פתרון המניות 4 nmole של siRNA או רעננותם ליפוזומים DSPE PALETS עם 201.4 μl של פתרון siRNA / protamine. דגירה פתרון liposome / siRNA למשך 10 דקות ב RT.
  7. הוסף 10 μl של hydrochloride carbodiimide 60 מ"מ 1-אתיל-3- (3-dimethylaminopropyl) (EDC) פתרון פתרון liposome / siRNA לשני DOTAP ו DSPE PALETS.
  8. הוסף 10 μl של פתרון 150 מ"מ N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) לפתרון ליפוזום / siRNA לשני DOTAP ו DSPE PALETS.
  9. דגירה EDC ו sulfo-NHS עם ההשעיה siRNA / liposome עבור שעה 2 ב RT.
  10. דגירה 80 μl של 500 מיקרומטר (40 nmole סה"כ) פתרון המניות RVG-9R עם ליפוזום siRNA / crosslinking פתרון במשך 10 דקות ב RT.
    הערה: EDC / sulfo-NHS מאפשר RVG-9R לאיגרת קוולנטית את השומנים PEG. השתמש PALETS בתוך כמה שעות לאחר הכנה. PALETS חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות לאחר ההכנה.
  11. כדי לקבוע את יעילות אנקפסולציה siRNA של PALETS:
    1. למדוד את הריכוז של siRNA לפני ואחרי התוספת של protamine ו ליפוזומים באמצעות ספקטרופוטומטר להגדיר ב 260 ננומטר.
    2. סנן את siRNA unencapsulated מן ההשעיה siRNA ליפוזום / כמוס באמצעות 50 מסננים צנטריפוגלי kDa. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 20 דקות.
    3. למדוד את הריכוז שלsiRNA unencapsulated ב תסנין ואת הריכוז של siRNA הגלום retentate באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר.

3. הזרקת עכברים עם LSPCs או PALETS

  1. לחשוף עכברים למשך 5-10 דקות כדי מנורת חום כדי להרחיב כלי דם.
  2. להרדים עכבר עם חמצן 2-3% isofluorane / לזרום 5-10 דקות לפני ההזרקה, ובמהלך הזריקה. אשר הרדמה כאשר חיים אינם מתנועעים ואת הנשימות האטו על ידי ביצוע קמצוץ בוהן. מניחים את העכבר על גבו או על צידו כדי לגשת וריד הזנב. השתמש במשחת וטרינר על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות לאחר הרדמה.
  3. נגב / לרסס את הזנב עם 70% EtOH ולהזריק 300 μl של LSPCs או PALETS על וריד הזנב של העכבר באמצעות מזרק אינסולין 26 G. התחל הזרקת distally לווריד הזנב ולעבור proximally אם הווריד מתמוטט או קרעים.
  4. מניחים עכבר בכלוב נקי עד שהוא מקיים שכיבה sternal. אל תניח מולהשתמש עם חבריהם לכלוב אחרים, עד שהיא התאוששה לחלוטין. עכברים צריכים להתאושש 5 עד 15 דקות. הם יכולים להיות ממוקמים על כרית חימום או תחת מנורת חום כדי לשמור על טמפרטורת גוף אם ההתאוששות אורכת זמן רב יותר. צריך להיות במעקב עכברים מקרוב כדי להגן מפני התחממות יתר.
  5. לפקח על מספר שעות חיה לאחר הזרקה על מנת להבטיח הרדמה פגה, ואין השפעות שליליות של הטיפול. אפשר LSPCs או PALETS להפיץ לפחות 24 שעות.

ניתוח 4. ביטוי חלבון באמצעות cytometry הזרימה

  1. להרדים עכברים עם קצב זרימה 20% CO 2 במשך 15 דקות.
  2. לנתח את חצי חצי כדור של המוח על ידי חיתוך משם את עור הגולגולת של העכבר באמצעות מספריים. לקלף חצי חצי כדור של המוח מן הגולגולת באמצעות מלקחיים או סוף זוג מספריים.
  3. חצי לחצו חצי כדור של המוח מפני כל עכבר דרך מסננת תא רשת 40 מיקרומטר באמצעות 2.5 מ"ל של חיץ FACS (1x; PBS, 1% בסרום שור עוברי, 10 EDTA מ"מ) בצלחת פטרי עם הבוכנה של מזרק.
  4. יש לשטוף את מסננת תא צלחת פטרי עם מאגר 2.5 מיליליטר נוסף של FACS. שים את ההשעיה תא בודד בתוך שפופרת חרוטי 15 מ"ל על הקרח.
  5. Pipet 100 μl של ההשעיה תא 5 מ"ל יחיד לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 x ז. מחק את התא גלולה supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של חיץ FACS. ספין ב 350 XG במשך 5 דקות. חזור עם עוד 1 מ"ל של חיץ FACS. שמור על השעיית התא על קרח.
  6. דגירה התאים ב 100 μl של 1: 100 דילול של חיץ 0.5 מ"ג / מ"ל ​​עכברוש אנטי עכבר Fc לחסום FACS 30-60 דקות על הקרח. גלולה לשטוף את התאים כמו בשלב 4.5. שמור על השעיית התא על קרח.
  7. דגירה התאים ב 100 μl של נוגדן פלורסנט 20 מיקרוגרם / מ"ל נגד העכבר PRP C בסרום העכבר 7% חיץ FACS על קרח למשך 30-60 דקות. גלולה לשטוף את התאים כמו בשלב 4.5. שמור את ההשעיה תאעל קרח.
  8. גלולה מחדש להשעות את התאים 1 מ"ל של חיץ תמוגה RBC (PBS 1x, 155 מ"מ NH 4 Cl, 12 מ"מ NaHCO 3, 0.1 EDTA מ"מ) 1 דקות. גלולה כמו בשלב 4.5 ו resuspend התאים 1 מ"ל של חיץ FACS. שמור על השעיית התא על קרח.
  9. לנתח ביטוי PRP C באמצעות cytometer זרימה כפי שתואר לעיל 10. שער לחיות על תאים מפני אוכלוסיית תא כוללת. שער PRP C + תאי אוכלוסיית תא חי לקבוע MFI (עוצמת פלורסנט החציוני).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי להגביר את היעילות של אנקפסולציה siRNA בתוך PALETS anionic, את siRNA נמהלה protamine. כדי לקבוע את הריכוז protamine הטוב ביותר עבור siRNA, את siRNA עורבב עם ריכוזים שונים של protamine, מ -1: 1 עד 2: 1 (איור 3 א). היתה יעילות אנקפסולציה 60-65% siRNA ב ליפוזומים anionic ללא שימוש protamine. ד?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

דו"ח זה מתאר פרוטוקול ליצור שתי מערכות אספקת ממוקדות שמעבירה siRNA ביעילות אל מערכת העצבים המרכזית. שיטות קודמות של אספקת siRNA אל מערכת העצבים המרכזיים כללו הזרקת וקטורי siRNA / shRNA ישירות לתוך המוח, הזרקה תוך ורידית של siRNA הממוקד, או הזרקה תוך ורידית של מתחמים ליפוזום-siRNA ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

We would like to acknowledge the following funding sources: the CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) and the NIH research grant program (R01 NS075214-01A1). We would like to thank the Telling lab for the use of their monoclonal antibody PRC5. We would also like to thank the Dow lab for DOTAP liposomes, and for sharing their expertise in generating liposomes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DOTAP lipidAvanti Lipids890890
CholesterolAvanti Lipids700000
DSPEAvanti Lipids850715
DSPE-PEGAvanti Lipids880125
ChloroformFisher ScientificAC268320010
MethanolEMD Millipore113351
N2 GasAirGas
SucroseFisher ScientificS5-500
ExtruderAvanti Lipids610023
1.0, 0.4, and 0.2 μm filtersAvanti Lipids610010, 610007, 610006
PBSLife Technologies70011-044
Protamine sulfateFisher ScientificICN10275205
EDCThermo Scientific22980Aliquoted for single use
Sulfo-NHSThermo Scientific24510Aliquoted for single use
40 μm Cell StrainerFisher Scientific08-771-1
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc blockBD Pharmigen553141
Anti-PrP antibody (PRC5)Proprietary - PRC

References

  1. Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
  2. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  3. Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
  5. Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
  6. Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
  7. White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
  8. Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
  9. Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
  10. Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
  11. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).
  12. Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
  13. Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
  14. Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
  15. Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
  16. Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  17. Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
  18. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  19. Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
  20. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  21. Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
  22. Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  23. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  24. Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
  25. Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
  26. Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
  27. Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
  28. Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
  29. Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
  30. Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering113siRNAprotamine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved