JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Аннотация

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects.

We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

Введение

Прионы тяжелые нейродегенеративные заболевания, которые влияют на центральную нервную систему. Прионные заболевания являются результатом неправильного сворачивания нормального клеточного белка приона, PrP C, инфекционным изомера под названием PrP Res. Эти заболевания влияют на большое разнообразие видов , включая коровьей губчатой ​​энцефалопатии у коров, скрепи у овец, хроническая изнуряющая болезнь в оленевых и болезнь Крейтцфельда-Якоба у человека 1-3. Прионы вызывают нейродегенера-, который начинается с синаптической потери, и переходит к вакуолизации, глиоза, потерю нейронов, а также отложения зубного налета. В конце концов, приводит к смерти животного / индивидуального 4. В течение многих десятилетий, ученые исследовали соединения, предназначенные, чтобы замедлить или остановить прогрессирование заболевания прион. Тем не менее, исследователи не обнаружили ни успешной терапии или эффективное системное средство доставки.

Эндогенной экспрессии PrP С необходим для развития прионовых заболеваний 5 . Таким образом, уменьшение или устранение экспрессии PrP C может привести к задержке или облегчения заболевания. Несколько групп создали трансгенных мышей с пониженным уровнем PrP C или закачивается lentivectors , выражающих shRNA непосредственно в мышиной ткани головного мозга , чтобы исследовать роль уровней экспрессии PrP C в прионовых болезней. Эти исследователи обнаружили уменьшение количества нейронов PrP C привело к остановке прогрессивного невропатологии прионных заболеваний и продлил жизнь животных 6-9. Мы сообщили , что результаты лечения PrP C миРНК в оформлении PrP Res в клетках нейробластомы мыши 10. Эти исследования показали, что использование методов лечения для снижения уровней экспрессии PrP C, как и малых интерферирующих РНК (киРНК), которая расщепляет мРНК, может достаточно задержать прогрессирование прионовых заболеваний. Тем не менее, большинство методов лечения исследованные для прионных заболеваний были поставлены таким образом, что не будет практичнымв клинических условиях. Поэтому миРНК терапия нуждается в системной систему доставки, которая доставляется внутривенно и ориентированные на ЦНС.

Исследователи изучали применение липосом в качестве средств доставки продуктов генной терапии. Катионные и анионные липиды оба используются в формировании липосом. Катионные липиды более широко, чем анионные липиды, так как разность заряда между катионного липида и ДНК / РНК обеспечивает эффективную упаковку. Еще одним преимуществом катионных липидов является то , что они пересекают клеточную мембрану легче , чем другие липиды 11-14 лет. Тем не менее, катионные липиды являются более иммуногенными , чем анионных липидов 13,14. Таким образом, исследователи начали переходить от использования катионные к анионным липидов в липосомах. Продукты генной терапии может быть эффективно упакованы в анионные липосомы с использованием положительно заряженный пептид протамина сульфата, который конденсирует молекулы ДНК / РНК 15-19 лет. Так как анионного липиDS являются менее иммуногенными , чем катионные липиды , они , возможно, к увеличению времени циркуляции, и может быть более терпимы в моделях на животных 13,14. Липосомы предназначены для конкретных тканей с использованием ориентации пептидов, которые присоединены к липосом. РВГ-9R нейропептид, который связывается с никотиновых рецепторов ацетилхолина, использовался для целевой Серна и липосом в ЦНС 17-20.

В настоящем докладе приводится протокол для получения трех средств доставки миРНК, а также для упаковки и доставки миРНК в нервных клеток (рисунок 1). Липосомы-миРНК-пептидных комплексов (LSPCs) состоят из липосом с миРНК и РВГ-9R нацеливание пептид электростатически прикреплен к внешней поверхности липосом. Пептид на имя липосом инкапсулированный терапевтические миРНК (PALETS) состоят из миРНК и протамина, инкапсулированного в липосомы, с РВГ-9R ковалентно связаны с липидного PEG групп. Используя описанные ниже методы для генерации LSPCs и палетS, PrP C миРНК уменьшает экспрессию PrP C до 90% в нервных клетках, который держит огромное обещание вылечить или существенно задержать начало патологии болезни прион.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все мыши были выведены и поддерживаются в Лаборатории животных ресурсов, аккредитованных Ассоциацией по оценке и аккредитации лаборатории Animal Care International, в соответствии с процедурами, утвержденными по уходу и использованию комитета Institutional животных путем в Университете штата Колорадо.

1. Получение LSPCs

  1. Используйте 1: 1 DOTAP (1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан): соотношение холестерина для LSPCs. Для 4 нмоль приготовления липосом, смешать 2 нмоль ДОТАП и 2 нмоль холестерина в 10 мл 1: 1 хлороформ: метанол раствор в колбе.
  2. Выпаривают 9 мл хлороформ: метанол раствора с использованием N 2 газа в вытяжном шкафу. Упаривают Последние 1 мл растворителя в вытяжном шкафу в течение ночи без газа. Обратите внимание тонкой липидной пленки на дне колбы.
  3. Тепло 10 мл 10% раствора сахарозы до 55 ° С.
  4. Налейте нагретого 10% раствора сахарозы на тонкой липидной пленки медленно, т.е. 1 мл / мин, в то время как Геntly взбалтывая колбу. Поддерживают 10% сахарозы и колбу с липидами при 55 ° С, так что липидные молекулы остаются в гелевой фазе-жидкость. Результаты Регидратационные в везикул формирования многопластинчатой ​​(MLV).
  5. Разрешить липиды регидрировать при 55 ° С в течение по меньшей мере одного часа до того размера липосом.
  6. Собрать экструдер в соответствии с инструкциями изготовителя с фильтрами 1,0 мкм или использовать шприцевые фильтры 1,0 мкм для проклейки.
  7. Добавить 1 мл суспензии липосом, нагретой до одной из шприцев на экструдере, и передать приостановку между двумя шприцами 11 раз. Убедитесь, что подвеска в противоположном шприц, чем исходный шприца после 11 проходов.
  8. Размер липосом снова через 0,45 мкм затем 0,2 мкм фильтры для генерации больших однослойных везикул (БУВ). Хранить суспензию липосом с подогревом для облегчения калибровки.
  9. Выдержите 20 мкл 4 нмоль суспензии липосом (200 мкм) с 200 мкл 20 мкМ (4нмоль всего) запас миРНК раствор в течение 10 мин при комнатной температуре.
  10. Инкубируют 80 мкл 500 мкМ (40 нмоль всего) маточного раствора РВГ-9R с раствором / липосом миРНК в течение 10 мин при комнатной температуре. LSPCs следует использовать как можно скорее, но может использоваться до нескольких часов после приготовления. Храните LSPCs при 4 ° С в течение нескольких часов после приготовления.

2. Получение PALETS

  1. Используйте 55: молярное соотношение 5 либо DspE (1,2-дистеароил-зп-глицеро-3-фосфоэтаноламин):: 40 холестерина: DspE-ПЭГ или DOTAP: холестерин: DspE-PEG для PALETS. Для 4 нмоль приготовления липосом, смешайте 2,2 нмоль либо DspE или ДОТАП, 1,6 нмоль холестерина и 0,2 нмоль ДСФЭ-ПЭГ в 10 мл 2: 1 хлороформ: метанол раствор в колбе.
  2. Приготовьте суспензию липосом в точности, как описано в шаге 1.1 и 1.2 выше. Увлажняет DspE липосом в 10 мл 1x PBS нагревали до 75 ° С, при добавлении 1 мл / мин. Разрешить липиды регидрировать при 75 ° С в течение поне менее 1 ч перед определением.
  3. Размер суспензию липосом точно так, как описано в шаге 1,6-1,8.
  4. Пипеткой 20 мкл каждого из 4 нмоль (200 мкМ) липосомных суспензий в отдельных аликвот после использования DOTAP и DspE Липосомы размера, и лиофилизации в течение 30 мин с помощью сублимационной сушки настольном (Рисунок 2).
  5. Инкубируют 200 мкл 20 мкМ (4 нмоль) общего исходного раствора киРНК с 1,4 мкл 26,6 мкМ раствора сульфата протамина в течение 10 мин при комнатной температуре миРНК, который должен быть воплощен в DSPE PALETS липосом.
  6. Увлажняет липосом ДОТАП PALETS с 200 мкл 4 нмоль исходного раствора киРНК или регидратации DSPE PALETS липосом с 201,4 мкл раствора / протамин-миРНК. Выдержите раствора липосом / миРНК в течение 10 мин при комнатной температуре.
  7. Добавьте 10 мкл (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) раствор 3--1-этил-60 мМ к раствору липосом / миРНК для обоих ДОТАП и ДСФЭ PALETS.
  8. Добавляют 10 мкл раствора 150 мМ N-hydroxysulfosuccinimide (сульфо-NHS) к раствору липосом / миРНК для обоих ДОТАП и ДСФЭ PALETS.
  9. Выдержите EDC и сульфо-NHS ​​с / суспензии липосом миРНК в течение 2 ч при комнатной температуре.
  10. Инкубируют 80 мкл 500 мкМ (40 нмоль всего) маточного раствора РВГ-9R с миРНК / липосом раствор в течение 10 мин при комнатной температуре сшивание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: EDC / сульфо-NHS ​​позволяет RVG-9R ковалентно связываться с липидами ПЭГ. Используйте PALETS в течение нескольких часов после приготовления. Храните PALETS при 4 ° С в течение нескольких часов после приготовления.
  11. Для определения эффективности миРНК инкапсуляции PALETS:
    1. Измерить концентрацию миРНК до и после добавления протамина и липосом с использованием спектрофотометра установки при длине волны 260 нм.
    2. Фильтр неинкапсулированной миРНК из липосом / инкапсулированного миРНК суспензии с использованием 50 кДа центробежных фильтров. Центрифуга при 1000 х г в течение 20 мин.
    3. Измерьте концентрациюнекапсулированного миРНК в фильтрате и концентрация инкапсулированного миРНК в концентрате с использованием спектрофотометра при длине волны 260 нм.

3. Инъекционное Мыши с LSPCs или PALETS

  1. Expose мышей в течение 5-10 мин до тепла лампы, чтобы расширить сосудистую сеть.
  2. Обезболить мышь с 2-3% изофлуораном / кислород потока 5-10 мин до инъекции, а также во время инъекции. Подтверждение не обезболивание, когда животное уже не передвигающихся и дыханий замедлилось, делая ног крайнем случае. Поместите мышь на спине или на боку, чтобы получить доступ к хвостовой вены. Используйте ветеринара мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание в то время как под наркозом.
  3. Wipe / спрей хвост с 70% этанола и вводят 300 мкл LSPCs или PALETS на хвостовую вену мыши с помощью 26 G инсулиновый шприц. Начало инъекции дистально в хвостовую вену и двигаться в проксимальном направлении, если вены разрушается или разрывается.
  4. Поместите мышь в чистой клетке, пока она не поддерживает грудины лежачее. Не оставляйте моиспользовать с другими клетке товарищей, пока не будет полностью восстановлена. Мыши должны восстанавливаться в 5 до 15 мин. Они могут быть размещены на грелку или под лампой тепло для поддержания температуры тела, если восстановление занимает больше времени. Мыши следует пристально следить для защиты от перегрева.
  5. Наблюдение за несколько часов после инъекции животных, чтобы обеспечить обезболивание смягчается, и нет никаких болезненных эффектов лечения. Разрешить LSPCs или PALETS циркулировать в течение по крайней мере 24 часов.

4. Анализ экспрессии белка с помощью проточной цитометрии

  1. Эвтаназии мышей с 20% скорости потока СО 2 в течение 15 мин.
  2. Рассеките из половину полушарие мозга путем срезания кожи и череп мыши с помощью ножниц. Отслаиваться половину полушарие мозга от черепа с помощью щипчиков или конец пары ножниц.
  3. Нажмите половину полушарие мозга от каждой мыши через сито меш ячейки 40 мкм с использованием 2,5 мл буфера FACS (1x; PBS, 1% фетальной бычьей сыворотки, 10 мМ ЭДТА) в чашке Петри с поршнем шприца.
  4. Промыть фильтр грубой очистки клеток и чашки Петри с дополнительными 2,5 мл буфера FACS. Помещенный одноклеточной суспензии в конической трубе 15 мл на льду.
  5. Пипеткой 100 мкл 5 мл суспензии отдельных клеток в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуге в течение 5 мин при 350 х г. Выбросите осадок клеток супернатант и ресуспендируют в 1 мл буфера FACS. Спин при 350 мкг в течение 5 мин. Повторите с другой 1 мл буфера FACS. Держите клеточной суспензии на льду.
  6. Инкубируйте клетки в 100 мкл 1: 100 разбавление 0,5 мг / мл анти-мышиных Fc блока в буфере FACS в течение 30-60 мин на льду. Гранул и промыть клетки, как в шаге 4.5. Держите клеточной суспензии на льду.
  7. Инкубацию клеток в 100 мкл 20 мкг / мл флюоресцирующих антител против мышиного PrP С в 7% мышиной сыворотки в буфере FACS на льду в течение 30-60 мин. Гранул и промыть клетки, как в шаге 4.5. Держите клеточной суспензиина льду.
  8. Пелле и вновь приостановить клеток в 1 мл буфера для лизиса эритроцитов (1x PBS, 155 мМ NH 4 Cl, 12 мМ NaHCO 3, 0,1 мМ ЭДТА) в течение 1 мин. Гранула, как на стадии 4.5, и клетки вновь суспендируют в 1 мл буфера FACS. Держите клеточной суспензии на льду.
  9. Анализ экспрессии PrP C с использованием проточного цитометра как описано выше 10. Ворота живые клетки от общей популяции клеток. Ворота PrP C + клеток из популяции живых клеток для определения MFI (медиана интенсивности флуоресценции).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для повышения эффективности киРНК герметизацию в анионных PALETS, киРНК смешивали с протамина. Для определения наилучшей концентрации протамина для миРНК, киРНК смешивали с различными концентрациями протамина, от 1: 1 до 2: 1 (фиг.3А). Был 60-65% миРНК Эффективность ин...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот отчет описывает протокол для создания двух целевых систем доставки, которые эффективно транспортирует миРНК в ЦНС. Предыдущие способы доставки миРНК в ЦНС включены инъекционные векторы миРНК / shRNA непосредственно в мозг, внутривенные инъекции целевого миРНК или внутривенной инъ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

We would like to acknowledge the following funding sources: the CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) and the NIH research grant program (R01 NS075214-01A1). We would like to thank the Telling lab for the use of their monoclonal antibody PRC5. We would also like to thank the Dow lab for DOTAP liposomes, and for sharing their expertise in generating liposomes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DOTAP lipidAvanti Lipids890890
CholesterolAvanti Lipids700000
DSPEAvanti Lipids850715
DSPE-PEGAvanti Lipids880125
ChloroformFisher ScientificAC268320010
MethanolEMD Millipore113351
N2 GasAirGas
SucroseFisher ScientificS5-500
ExtruderAvanti Lipids610023
1.0, 0.4, and 0.2 μm filtersAvanti Lipids610010, 610007, 610006
PBSLife Technologies70011-044
Protamine sulfateFisher ScientificICN10275205
EDCThermo Scientific22980Aliquoted for single use
Sulfo-NHSThermo Scientific24510Aliquoted for single use
40 μm Cell StrainerFisher Scientific08-771-1
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc blockBD Pharmigen553141
Anti-PrP antibody (PRC5)Proprietary - PRC

Ссылки

  1. Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
  2. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  3. Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
  5. Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
  6. Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
  7. White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
  8. Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
  9. Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
  10. Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
  11. Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).
  12. Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
  13. Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
  14. Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
  15. Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
  16. Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  17. Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
  18. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  19. Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
  20. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  21. Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
  22. Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
  23. Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
  24. Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
  25. Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
  26. Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
  27. Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
  28. Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
  29. Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
  30. Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

113Therapeutics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены