La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi

Riepilogo

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Abstract

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrP^C) to an abnormal protease resistant isomer called PrP^Res. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrP^Res isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrP^Res formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrP^C, and are often too toxic to use in animal or human subjects.

We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrP^C is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrP^C expression of neurons in the CNS.

Introduzione

I prioni sono gravi malattie neurodegenerative che colpiscono il sistema nervoso centrale. Le malattie da prioni risultano dalla misfolding della normale proteina prionica cellulare, PrP ^C, con un isomero infettiva chiamata PrP ^Res. Queste malattie colpiscono una grande varietà di specie, tra cui encefalopatia spongiforme bovina nelle vacche, la scrapie degli ovini, malattia del dimagrimento cronico nei cervidi, e la malattia di Creutzfeldt-Jakob nell'uomo ^1-3. I prioni causano neurodegenerazione che inizia con la perdita sinaptica, e progredisce a vacuolizzazione, gliosi, perdita neuronale, e depositi di placca. Alla fine, con la conseguente morte dell'animale / individuale ^4. Per decenni, i ricercatori hanno studiato i composti destinati a rallentare o arrestare la progressione della malattia da prioni. Tuttavia, i ricercatori non hanno trovato né una terapia di successo o un efficace veicolo di consegna sistemica.

Endogena espressione PrP ^C è necessario per lo sviluppo di malattie da prioni ⁵ . Pertanto, ridurre o eliminare espressione PrP ^C può provocare un ritardo o miglioramento della malattia. Diversi gruppi creati topi transgenici con ridotti livelli di PrP ^C o lentivectors iniettati esprimono shRNA direttamente nel tessuto cerebrale murino per studiare il ruolo dei livelli di espressione PrP ^C nelle malattie da prioni. Questi ricercatori hanno scoperto riducendo la quantità di neuroni PrP ^C provocato arrestare la progressiva neuropatologia delle malattie da prioni e esteso la vita degli animali ^6-9. Ci hanno riferito che i risultati del trattamento PrP ^C siRNA a distanza di PrP ^Res nelle cellule di topo neuroblastoma ^10. Questi studi suggeriscono che l'uso di terapie per diminuire i livelli di espressione PrP ^C, come small interfering RNA (siRNA), che scinde mRNA, può sufficientemente ritardare la progressione delle malattie da prioni. Tuttavia, la maggior parte delle terapie indagati per malattie da prioni sono stati consegnati in un modo che non sarebbe praticoin un ambiente clinico. Pertanto, una terapia siRNA bisogno di un sistema di erogazione sistemica, che viene trasportato via endovenosa e mirata al SNC.

Gli investigatori hanno studiato l'uso di liposomi come veicoli di consegna per i prodotti di terapia genica. lipidi cationici e anionici sono entrambi utilizzati nella formazione di liposomi. lipidi cationici sono più ampiamente usati di lipidi anionici perché la differenza di carica tra i lipidi cationici e il DNA / RNA permette di confezionamento efficiente. Un altro vantaggio di lipidi cationici è che attraversano la membrana cellulare più facilmente di altri lipidi ^11-14. Tuttavia, lipidi cationici sono più immunogenico di lipidi anionici ^13,14. Pertanto, i ricercatori hanno cominciato a spostarsi da utilizzare cationico per anionica lipidi nei liposomi. Prodotti per la terapia genica possono essere confezionati in modo efficiente nei liposomi anionici utilizzando la carica positiva solfato di protamina peptide, che condensa le molecole di DNA / RNA ^15-19. Dal momento che Lipi anionicods sono meno immunizzanti lipidi cationici che possono avere un aumento dei tempi di circolazione, e possono essere più tollerati in modelli animali ^13,14. I liposomi sono mirati a specifici tessuti utilizzando il targeting peptidi che sono attaccati ai liposomi. Il neuropeptide RVG-9r, che si lega ai recettori nicotinici, è stato utilizzato per indirizzare siRNA e liposomi al SNC ^17-20.

Questo rapporto delinea un protocollo per la produzione di tre veicoli di consegna siRNA, e di confezionare e consegnare il siRNA per le cellule neuronali (Figura 1). complessi liposoma-siRNA-peptide (LSPCs) sono costituiti da liposomi con siRNA e RVG-9r di targeting peptide elettrostaticamente attaccati alla superficie esterna del liposoma. Peptide indirizzata incapsulata in liposomi terapeutici siRNA (PALETS) sono composte da siRNA e protamina incapsulato all'interno della liposomi, con RVG-9r covalentemente legato a gruppi di lipidi PEG. Utilizzando i metodi indicati per generare LSPCs e PALETS, PrP ^C siRNA riduce espressione PrP ^C fino al 90% in cellule neuronali, che detiene tremenda promessa per curare o sostanzialmente ritardare l'insorgenza della patologia malattia da prioni.

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Protocollo

Tutti i topi sono stati allevati e mantenuti in laboratorio le risorse animali, accreditati dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care International, secondo protocolli approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali presso la Colorado State University.

1. Preparazione di LSPCs

1. Utilizzare un 1: 1 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimetilammonio-propano): rapporto di colesterolo per LSPCs. Per una preparazione nmole liposoma 4, mescolare 2 nmoli di DOTAP e 2 nmoli di colesterolo in 10 ml di una miscela 1: 1 di cloroformio: metanolo soluzione in un pallone.
2. Far evaporare 9 ml di cloroformio: soluzione di metanolo con N ₂ gas in una cappa aspirante. Evaporare ultimi 1 ml di solvente in una cappa aspirante notte senza gas. Osservare un sottile film lipidico sul fondo del pallone.
3. Calore 10 ml di una soluzione di saccarosio al 10% a 55 ° C.
4. Versare la soluzione di saccarosio al 10% riscaldato sul sottile film lipidico lentamente, vale a dire 1 ml / min, mentre la gente roteare il pallone. Mantenere il saccarosio 10% e pallone con lipidi a 55 ° C in modo che le molecole lipidiche rimangono nella fase gel-liquido. risultati di reidratazione in vescicole (MLV) formazione multilamellare.
5. Consentire lipidi reidratare a 55 ° C per almeno un ora prima dimensionamento dei liposomi.
6. Assemblare un estrusore secondo le istruzioni del produttore con 1,0 micron filtri o utilizzare filtri per siringa 1,0 micron per il dimensionamento.
7. Aggiungere 1 ml della sospensione di liposomi riscaldato a una delle siringhe sul estrusore, e passare la sospensione tra le due siringhe 11 volte. Assicurarsi che la sospensione è nella siringa opposta rispetto alla siringa di partenza dopo le 11 passate.
8. Dimensione liposomi nuovo attraverso 0,45 micron poi 0,2 micron filtri per generare grandi vescicole unilamellari (luvs). Mantenere la sospensione di liposomi riscaldato per facilitare dimensionamento.
9. Incubare 20 microlitri della sospensione di liposomi 4 nmole (200 mM) con 200 ml di a 20 pM (4totale nmole) soluzione di riserva siRNA per 10 minuti a temperatura ambiente.
10. Incubare 80 microlitri di una 500 micron (40 nmole totale) stock soluzione RVG-9r con la soluzione / liposomi siRNA per 10 minuti a temperatura ambiente. LSPCs devono essere utilizzati al più presto possibile, ma possono essere utilizzati fino a diverse ore dopo la preparazione. LSPCs Conservare a 4 ° C per diverse ore dopo la preparazione.

2. Preparazione di PALETS

1. Utilizzare un 55: rapporto di 5 molare di entrambi DSPE (1,2-distearoil-sn-glycero-3-fosfoetanolamina):: 40 colesterolo: DSPE-PEG o DOTAP: colesterolo: DSPE-PEG per PALETS. Per una preparazione nmole liposoma 4, mescolare 2,2 nmoli di entrambi DSPE o DOTAP, 1,6 nmoli di colesterolo, e 0,2 nmoli di DSPE-PEG in 10 ml di 2: 1 di cloroformio: metanolo soluzione in un pallone.
2. Preparare sospensione di liposomi esattamente come descritto al punto 1.1 e 1.2 di cui sopra. Reidratare liposomi DSPE in 10 ml di PBS 1x riscaldata a 75 ° C, aggiungendo 1 ml / min. Consentire lipidi per reidratare a 75 ° C peralmeno 1 ora prima del dimensionamento.
3. Dimensioni della sospensione di liposomi esattamente come descritto al punto 1,6-1,8.
4. Dispensare 20 l di ciascuno dei 4 nmole (200 micron) sospensioni di liposomi in singole aliquote usare dopo DOTAP e DSPE liposomi sono stati di dimensioni, e liofilizzare per 30 minuti utilizzando un essiccatore da banco congelamento (Figura 2).
5. Incubare 200 ml di a 20 micron (4 in totale nmole) stock soluzione siRNA con 1,4 ml di una soluzione 26,6 micron di solfato di protamina per 10 minuti a temperatura ambiente per siRNA che deve essere incapsulata nei liposomi DSPE pallets.
6. Reidratare il liposomi DOTAP Palets con 200 ml di una soluzione madre nmole 4 di siRNA o reidratare liposomi DSPE pallets con 201,4 ml di soluzione / protamina siRNA. Incubare liposomi soluzione / siRNA per 10 minuti a temperatura ambiente.
7. Aggiungere 10 ml di una soluzione 60 mM-etil-1 3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) al / soluzione siRNA liposomi sia per DOTAP e DSPE PALETS.
8. Aggiungere 10 ml di una soluzione 150 mM N-hydroxysulfosuccinimide (solfo-NHS) alla / soluzione siRNA liposomi sia per DOTAP e DSPE PALETS.
9. Incubare la EDC e solfo-NHS con la sospensione / liposomi siRNA per 2 ore a temperatura ambiente.
10. Incubare 80 microlitri di una 500 micron (40 nmole totale) stock soluzione RVG-9r con il siRNA / liposomi reticolazione soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: L'EDC / solfo-NHS permette al RVG-9r al legame covalente ai lipidi PEG. Utilizzare PALETS all'interno di diverse ore dopo la preparazione. PALETS Conservare a 4 ° C per diverse ore dopo la preparazione.
11. Per determinare siRNA efficienza di incapsulamento di PALETS:
    1. Misurare la concentrazione di siRNA prima e dopo l'aggiunta di protamina e liposomi utilizzando uno spettrofotometro regolato a 260 nm.
    2. Filtrare il non incapsulata siRNA dal liposomi / sospensione siRNA incapsulato con 50 kDa filtri centrifughe. Centrifugare a 1000 xg per 20 min.
    3. Misurare la concentrazione disiRNA non incapsulata nel filtrato e la concentrazione dei incapsulato siRNA nel retentato utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm.

3. L'iniezione di topi con LSPCs o PALETS

1. Esporre i topi per 5-10 minuti ad una lampada di calore per dilatare vascolare.
2. Anestetizzare mouse con un isofluorano / ossigeno 2-3% fluire 5-10 minuti prima dell'iniezione, e durante l'iniezione. Confermare anestesia quando animale non è più ambulatoriale e respirazioni hanno rallentato facendo un pizzico dito del piede. Posizionare il mouse sulla sua schiena o di lato per accedere alla vena della coda. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi del topo per evitare l'essiccazione mentre sotto anestesia.
3. Pulire / spruzzare la coda con il 70% EtOH e iniettare 300 ml di LSPCs o PALETS sulla vena della coda del mouse utilizzando una siringa da 26 G di insulina. Inizia iniettando distalmente nella vena della coda e spostare prossimale se la vena collassa o rotture.
4. Posizionare il mouse in una gabbia pulita fino mantiene decubito sternale. Non posizionare moutilizzare con altri compagni di gabbia fino a quando non ha pienamente recuperato. I topi dovrebbero recuperare in 5 a 15 min. Essi possono essere collocati su una piastra elettrica o sotto una lampada di calore per mantenere la temperatura corporea se il recupero richiede più tempo. I topi devono essere monitorati attentamente per salvaguardare contro il surriscaldamento.
5. Monitorare le diverse ore dopo l'iniezione di animali al fine di garantire l'anestesia svanisce, e non ci sono effetti negativi del trattamento. Lasciare le LSPCs o PALETS di circolare per almeno 24 ore.

4. Analisi dell'espressione proteica tramite citometria a flusso

1. Euthanize topi con una portata di 20% di CO ₂ per 15 min.
2. Sezionare la metà un emisfero del cervello, tagliando via la pelle e il cranio del mouse con le forbici. Peel via metà un emisfero cerebrale distanza dal cranio con pinze o la fine di un paio di forbici.
3. Press mezzo emisfero del cervello di ogni mouse attraverso un colino 40 micron cella mesh con 2,5 ml di tampone FACS (1x, PBS, 1% di siero fetale bovino, 10 mM EDTA) in una capsula di Petri con lo stantuffo di una siringa.
4. Risciacquare il filtro cellulare e piastra di Petri con un ulteriore 2,5 ml di tampone FACS. Mettere la sospensione singola cellula in una provetta conica da 15 ml su ghiaccio.
5. Pipettare 100 ml di sospensione di cellule singole 5 ml in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e centrifugare per 5 min a 350 x g. Eliminare il surnatante e risospendere pellet di cellule in 1 ml di tampone FACS. Spin a 350 g per 5 min. Ripetere con un altro 1 ml di tampone FACS. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
6. Incubare le cellule in 100 microlitri di diluizione 1: 100 di 0,5 mg / ml di ratto blocco anti-topo Fc in tampone FACS per 30-60 min in ghiaccio. Pellet e lavare le cellule come al punto 4.5. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
7. Incubare le cellule in 100 microlitri di una / anticorpo 20 mg ml fluorescente contro topo PrP ^C in 7% siero di topo in tampone FACS in ghiaccio per 30-60 min. Pellet e lavare le cellule come al punto 4.5. Mantenere la sospensione cellularesul ghiaccio.
8. Pellet e risospendere le cellule in 1 ml di tampone di lisi RBC (1x PBS, 155 mm NH ₄ Cl, 12 mm NaHCO _3, 0.1 mM EDTA) per 1 min. Pellet come al punto 4.5 e risospendere le cellule in 1 ml di tampone FACS. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio.
9. Analizzare l'espressione PrP ^C utilizzando un citofluorimetro come descritto in precedenza ^10. Porta di vivere le cellule dalla popolazione cellulare totale. Porta PrP ^C + cellule dalla popolazione di cellule in diretta per determinare MFI (intensità di fluorescenza mediana).

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Risultati

Per aumentare l'efficienza di siRNA incapsulamento all'interno PALETS anionici, il siRNA è stato mescolato con protamina. Per determinare la migliore concentrazione protamina per la siRNA, il siRNA è stato mescolato con diverse concentrazioni di protamina, da 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). C'era una efficienza di incapsulamento siRNA 60-65% in liposomi anionici senza l'uso di protamina. I campioni con protamina: siRNA rapporti molari da 1: 1 a 1,5: 1 (133-266...

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Discussione

Questo rapporto descrive un protocollo per creare due sistemi di somministrazione mirata che trasporta in modo efficiente siRNA al sistema nervoso centrale. Precedenti metodi di somministrazione siRNA al SNC inclusi l'iniezione di vettori siRNA / shRNA direttamente nel cervello, iniezione endovenosa di mirati siRNA, o iniezione endovenosa di complessi liposomi-siRNA non mirati. L'iniezione di siRNA / shRNA vettori nel sistema nervoso centrale non provoca una diminuzione dei livelli di espressione della proteina ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
Cholesterol	Avanti Lipids	700000
DSPE	Avanti Lipids	850715
DSPE-PEG	Avanti Lipids	880125
Chloroform	Fisher Scientific	AC268320010
Methanol	EMD Millipore	113351
N2 Gas	AirGas
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Extruder	Avanti Lipids	610023
1.0, 0.4, and 0.2 μm filters	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006
PBS	Life Technologies	70011-044
Protamine sulfate	Fisher Scientific	ICN10275205
EDC	Thermo Scientific	22980	Aliquoted for single use
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510	Aliquoted for single use
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block	BD Pharmigen	553141
Anti-PrP antibody (PRC5)	Proprietary - PRC