Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

Resumo

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

Resumo

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrP^C) to an abnormal protease resistant isomer called PrP^Res. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrP^Res isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrP^Res formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrP^C, and are often too toxic to use in animal or human subjects.

We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrP^C is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrP^C expression of neurons in the CNS.

Introdução

Os priões são graves doenças neurodegenerativas que afectam o SNC. Doenças de priões, resultar a partir do enrolamento incorrecto da proteína prião celular normal, a PrP ^C, por um chamado isómero infecciosa PrP ^Res. Estas doenças afectam uma grande variedade de espécies, incluindo a encefalopatia espongiforme bovina em vacas, scrapie em ovinos, a doença emaciante crónica dos cervídeos, ea doença de Creutzfeldt-Jakob em humanos ^1-3. Prions causar neurodegeneração que começa com a perda sináptica, e progride para vacuolização, gliose, perda neuronal, e depósitos de placas. Eventualmente, resultando na morte do animal / indivíduo ^4. Durante décadas, os pesquisadores investigaram compostos destinados a retardar ou parar a progressão da doença de príon. No entanto, os investigadores não encontraram qualquer uma terapia bem sucedida ou um veículo eficaz de entrega sistémica.

Endógena expressão da PrP ^C é necessária para o desenvolvimento de doenças provocadas por priões ⁵ . Por isso, diminuindo ou eliminando a expressão da PrP ^C pode resultar num atraso ou melhoria da doença. Vários grupos de ratinhos transgénicos criados com níveis reduzidos de PrP ^C ou lentivectores injectados expressam shRNA directamente no tecido cerebral de murino para investigar o papel dos níveis de expressão da PrP ^C em doenças de prião. Estes investigadores encontraram reduzindo a quantidade de PrP ^C neuronal resultaram em travar a neuropatologia progressiva de doenças provocadas por priões e estendeu a vida dos animais ^6-9. Nós relataram que os resultados do tratamento PrP ^C siRNA na depuração da PrP ^Res em células de rato neuroblastoma ^10. Estes estudos sugerem que o uso de terapias para diminuir os níveis de expressão da PrP ^C, como pequeno ARN interferente (siRNA), que cliva o ARNm, podem suficientemente retardar a progressão de doenças provocadas por priões. No entanto, a maioria das terapias investigados para doenças de prião foram entregues de formas que não seria práticoem um ambiente clínico. Portanto, uma terapia de ARNsi necessita de um sistema de entrega sistémica, que é entregue por via intravenosa e orientada para o SNC.

Os investigadores estudaram a utilização de lipossomas como veículos de entrega de produtos de terapia génica. Os lípidos catiónicos e aniónicos são ambos usados ​​na formação dos lipossomas. Os lípidos catiónicos são mais amplamente utilizados de lípidos aniónicos, porque a diferença de carga entre o lípido catiónico e do ADN / ARN permite o empacotamento eficiente. Outra vantagem de lípidos catiónicos é que eles atravessam a membrana celular mais facilmente do que outros lípidos ^11-14. No entanto, os lípidos catiónicos são mais imunogénicos do que os lípidos aniónicos ^13,14. Portanto, os pesquisadores começaram a mudar de usar catiônico para ani�icos lípidos em lipossomas. Produtos de terapia génica pode ser eficazmente embalado em lipossomas aniónicos, utilizando o sulfato de protamina péptido carregado positivamente, que se condensa moléculas de ADN / ARN ^15-19. Desde Lipi aniônicaDS são menos imunogénicos do que os lípidos catiónicos podem ter tempos de circulação aumentados, e podem ser mais tolerados em modelos animais ^13,14. Os lipossomas são direcionados para os tecidos específicos usando segmentação peptídeos que estão ligados aos lipossomas. O neuropeptídeo RVG-9R, que se liga a receptores nicotínicos da acetilcolina, tem sido utilizado para segmentar siRNA e lipossomas para o SNC ^17-20.

Este relatório descreve um protocolo para produzir três veículos de entrega de siRNA, e para empacotar e entregar o siRNA para as células neuronais (Figura 1). complexos de siRNA-lipossoma-péptido (LSPCs) são compostos de lipossomas com o siRNA e RVG-9R peptídeo alvo electrostaticamente ligado à superfície exterior do lipossoma. Péptido dirigida lipossoma encapsulado terapêuticos siRNA (PALETS) são compostos de siRNA e protamina encapsulado no interior do lipossoma, com RVG-9R covalentemente ligado a grupos de PEG lípido. Usando os métodos abaixo para gerar LSPCs e PALETS, PrP ^C siARN diminui a expressão da PrP ^C até 90% em células neuronais, o que possui tremendo potencial para curar ou retardar o aparecimento da patologia da doença do prião substancialmente.

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Protocolo

Todos os ratos foram criados e mantidos no laboratório de Recursos Animais, credenciados pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório de Animal Care International, em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Estadual do Colorado.

1. Preparação de LSPCs

1. Utilize uma mistura 1: 1 de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamónio-propano): proporção de colesterol para LSPCs. Para obter uma preparação de lipossomas nmole 4, misturar 2 nmoles de DOTAP e 2 nmol de colesterol em 10 ml de uma solução 1: metanol num balão: clorofórmio 1.
2. Evapora-se 9 ml de clorofórmio: metanol solução usando _N2 gasoso numa hotte. Evaporaram-se os últimos 1 ml de solvente em um exaustor durante a noite sem gás. Observar uma película fina de lípidos no fundo do frasco.
3. Calor 10 ml de uma solução de sacarose a 10% a 55 ° C.
4. Verter a solução de sacarose a 10% aquecida sobre a película fina de lípidos lentamente, isto é, 1 ml / min, enquanto a GEntly agitando o frasco. Manter a sacarose a 10% e com o balão de lípidos a 55 ° C, de modo que as moléculas de lípidos permanecem na fase de gel-líquido. De re-hidratação resulta em formação de vesículas multilamelares (MLV).
5. Permitir lípidos para re-hidratar a 55 ° C durante pelo menos uma hora antes de dimensionar os lipossomas.
6. Montar uma extrusora de acordo com as instruções do fabricante com 1,0 uM filtros ou usar filtros de seringa de 1,0 um para o dimensionamento.
7. Adicionar 1 ml da suspensão de lipossomas aquecida para uma das seringas sobre o extrusor, e passar a suspensão entre as duas seringas 11 vezes. Certifique-se de que a suspensão se encontra na seringa oposto do que a seringa começando depois dos 11 passes.
8. Tamanho dos lipossomas de novo através de 0,45 um 0,2 um, em seguida, filtros para gerar grandes vesículas unilamelares (LUV). Manter a suspensão de lipossomas aquecida para o dimensionamento mais fácil.
9. Incubar 20 ul da suspensão de lipossomas de 4 nmol (200 uM) com 200 ul de uma solução 20 uM (4total de nmole) solução stock de ARNsi durante 10 min à temperatura ambiente.
10. Incubar 80 ul de uma 500 uM (40 Total nmole) solução estoque RVG-9R com a solução / lipossoma ARNsi durante 10 min à TA. LSPCs deve ser utilizado o mais cedo possível, mas pode ser utilizado até várias horas após a preparação. LSPCs armazenar a 4 ° C, durante várias horas após a preparação.

2. Preparação de PALETS

1. Usar um 55: 5 proporção molar de ambos os DSPE (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina):: 40 colesterol: DSPE-PEG ou DOTAP: colesterol: DSPE-PEG para PALETS. Para obter uma preparação de lipossomas nmole 4, misturar 2,2 nmoles de qualquer DSPE ou DOTAP, 1,6 nmol de colesterol e 0,2 nmoles de DSPE-PEG em 10 ml de uma solução 2: metanol num balão: clorofórmio 1.
2. Prepare a suspensão de lipossomas exactamente como descrito no passo 1.1 e 1.2 acima. Rehidratar lipossomas DSPE em 10 ml de PBS 1x aquecida a 75 ° C, adição de 1 ml / min. Permitir lípidos para re-hidratar a 75 ° C durante pelomenos de 1 hora antes da calibragem.
3. Tamanho da suspensão de lipossomas exactamente como descrito no Passo 1,6-1,8.
4. Pipetar 20 ul de cada uma das suspensões de liposomas 4 nmol (200 ^ M) em alíquotas de uso único após DOTAP e DSPE lipossomas foram dimensionados, e liofilizar durante 30 min usando um secador de congelação de bancada (Figura 2).
5. Incubar 200 ul de uma solução 20 uM de siRNA estoque (4 TOTAL nmole) com 1,4 mL de uma solução 26,6 M de sulfato de protamina durante 10 min à TA durante siARN que é para ser encapsulada em lipossomas DSPE paletes.
6. Re-hidratar os lipossomas DOTAP PALETS com 200 ul de uma solução stock de 4 nmol de lipossomas re-hidratados ou siRNA DSPE PALETS com 201,4 ul da solução de / protamina siARN. Incubar solução de lipossoma / ARNsi durante 10 min à TA.
7. Adicionam-se 10 ul de uma (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), solução de ácido 3- 1-etil-60 mM à solução de lipossoma / siRNA para tanto DOTAP e DSPE PALETS.
8. Adicionam-se 10 ul de uma solução 150 mM de N-hidroxissulf (sulfo-NHS) para a solução de lipossomas / siRNA para tanto DOTAP e DSPE PALETS.
9. Incubar o EDC e sulfo-NHS com a suspensão / lipossoma ARNsi durante 2 h à TA.
10. Incubar 80 ul de uma 500 uM (40 Total nmole) solução estoque RVG-9R com o siRNA / lipossoma solução durante 10 min a RT de reticulação.
    NOTA: A EDC / sulfo-NHS permite que o RVG-9R a ligação covalente aos lipídeos PEG. Use PALETS dentro de várias horas após a preparação. PALETS armazenar a 4 ° C, durante várias horas após a preparação.
11. Para determinar a eficiência de encapsulação de siRNA PALETS:
    1. Medir a concentração de ARNsi antes e após a adição de protamina e lipossomas utilizando um espectrofotómetro ajustado a 260 nm.
    2. Filtra-se o siARN não encapsulado a partir da suspensão de lipossomas siRNA / encapsulado utilizando filtros centrífugos de 50 kDa. Centrifugar a 1000 xg durante 20 min.
    3. Medir a concentração desiRNA não encapsulado no filtrado, e a concentração de ARNsi encapsulado no retentado usando um espectrofotómetro a 260 nm.

3. injectando ratinhos com LSPCs ou PALETS

1. Expor os ratos para 5-10 min a uma lâmpada de calor para dilatar vasos.
2. Anestesiar rato com um 2-3% isoflurano / oxigênio fluir 5-10 min antes da injeção, e durante a injeção. Confirmar anesthetization em que os animais não é mais ambulante e respirações ter abrandado, fazendo uma pitada dedo do pé. Posicione o mouse sobre as suas costas ou de lado para acessar a veia da cauda. Use pomada veterinário nos olhos de rato para evitar a secagem sob anestesia.
3. Limpe / pulverização, a cauda, ​​com 70% de EtOH e injectar 300 ul de LSPCs ou PALETS na veia da cauda do rato utilizando uma seringa de 26 L de insulina. Começam a injectar de modo distal para dentro da veia da cauda e mova proximalmente se a veia colapsos ou rupturas.
4. Coloque rato em uma gaiola limpa até que ele mantém decúbito esternal. Não coloque mousar com outros companheiros de gaiola até que ele se recuperou totalmente. Ratos deve se recuperar em 5 a 15 min. Eles podem ser colocados sobre uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor para manter a temperatura corporal, se a recuperação é mais demorada. Os ratos devem ser cuidadosamente monitorizados para proteger contra sobre-aquecimento.
5. Monitorar os animais de várias horas após a injeção para garantir a anestesia desgasta fora, e não há efeitos nocivos do tratamento. Permitir que as LSPCs ou PALETS a circular por pelo menos 24 horas.

4. Análise da expressão proteica através de Citometria de Fluxo

1. Eutanásia ratos com uma taxa de fluxo de 20% de CO ₂ durante 15 min.
2. Dissecar metade de um hemisfério do cérebro, cortando a pele e crânio do rato com uma tesoura. Descascar metade de um hemisfério cerebral longe do crânio usando uma pinça ou o fim de um par de tesouras.
3. Pressione metade de um hemisfério do cérebro de cada ratinho através de um filtro de células de malha de 40 um, usando 2,5 ml de tampão FACS (1x; PBS, 1% de soro bovino fetal, 10 mM de EDTA) num prato de Petri com o êmbolo de uma seringa.
4. Lavar o filtro de células e uma placa de Petri com um adicional de 2,5 mL de tampão de FACS. Coloque a única suspensão celular num tubo cónico de 15 ml em gelo.
5. Pipete 100 pi da suspensão de células únicas de 5 mL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugar durante 5 minutos a 350 x g. Desprezar o pelete de células sobrenadante e ressuspender em 1 ml de tampão de FACS. Girar a 350 g durante 5 min. Repetir com mais 1 ml de tampão de FACS. Manter a suspensão de células em gelo.
6. Incubar as células em 100 ul de 1: 100 de diluição de uma solução a 0,5 mg / ml de rato bloco anti-rato Fc em tampão FACS durante 30-60 min em gelo. Sedimentar as células e lava-se como na etapa 4.5. Manter a suspensão de células em gelo.
7. Incubar as células em 100 ul de uma / 20 ug de anticorpo fluorescente contra ml rato PrP ^C em soro de ratinho a 7% em tampão de SCAF em gelo durante 30-60 min. Sedimentar as células e lava-se como na etapa 4.5. Manter a suspensão de célulasno gelo.
8. Pellet e re-suspender as células em 1 ml de tampão de lise de RBC (1x PBS, 155 mM de _NH4Cl, 12 mM _{de NaHCO3,} 0,1 mM de EDTA) durante 1 min. Pellet como no passo 4.5 e ressuspender as células em 1 ml de tampão de FACS. Manter a suspensão de células em gelo.
9. Analisar a expressão da PrP ^C utilizando um citómetro de fluxo, conforme descrito anteriormente ^10. Portão de células a partir da população total de células viver. Portão PrP ^C + células a partir da população de células vivas para determinar IMF (intensidade de fluorescência mediana).

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Resultados

Para aumentar a eficiência de encapsulação dentro de siRNA PALETS aniónicos, o siARN foi misturado com protamina. Para determinar a melhor concentração de protamina para o ARNip, o siARN foi misturado com diferentes concentrações de protamina, a partir de 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). Houve um 60-65% siARN eficiência de encapsulação em lipos somas aniónicos, sem a utilização de protamina. As amostras com protamina: razões molares de ARNsi de 1: 1 a 1,5: 1 (133-...

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Discussão

Este relatório descreve um protocolo para criar dois sistemas de administração específicas que transporta de forma eficiente siRNA para o SNC. Os métodos anteriores de entrega de siRNA para o SNC incluíram injecção de vectores de ARNsi / shRNA directamente para o cérebro, a injecção intravenosa de siRNA alvo, ou injecção intravenosa de complexos lipossoma-siRNA não-alvo. A injecção de vectores de ARNsi / shRNA no SNC não causar uma diminuição nos níveis de expressão da proteína alvo. No entanto, o ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
Cholesterol	Avanti Lipids	700000
DSPE	Avanti Lipids	850715
DSPE-PEG	Avanti Lipids	880125
Chloroform	Fisher Scientific	AC268320010
Methanol	EMD Millipore	113351
N2 Gas	AirGas
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Extruder	Avanti Lipids	610023
1.0, 0.4, and 0.2 μm filters	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006
PBS	Life Technologies	70011-044
Protamine sulfate	Fisher Scientific	ICN10275205
EDC	Thermo Scientific	22980	Aliquoted for single use
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510	Aliquoted for single use
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block	BD Pharmigen	553141
Anti-PrP antibody (PRC5)	Proprietary - PRC