Generación de un ratón humanizado hígado uso de células madre hepáticas humanas

Resumen

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Resumen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Introducción

Mice are commonly used for pharmaceutical testing since biomedical research in humans is restricted¹; however, these models are not always useful since they may inaccurately simulate the effects observed in humans. Most drugs in current medical use are metabolized primarily in the liver. However, the same drug can be metabolized into different metabolites in mouse and human livers because of inter-species differences. Thus, it is often difficult to determine during development whether a potential drug poses any risks for clinical applications^2,3.

To address this problem, "humanized" mouse livers have been developed by growing human liver cells inside mice^4-6; these models exhibit drug responses similar to those observed in the human liver. The primary mouse models currently used for humanized liver generation include uroplasminogen activator (uPA+/+) mice^4,7, fumarylacetoacetate hydrolase (Fah−/−) mice⁶, and the recently reported thymidine kinase (TK-NOG) mice.

However, previous reports have shown that transplanted human immature cells or stem cells are less competitive than adult human hepatocytes in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) mouse livers^8-10. Moreover, Fah−/− mice provide a growth advantage only for differentiated hepatocytes and not for immature liver progenitor cells¹¹. The transplantation of human hepatic stem cells (HpSCs) into TK-NOG mice in the lab has been unsuccessful. Hence, no useful mouse model for the efficient engraftment of human immature liver cells currently exists.

Thus, we developed a novel Alb-TRECK/SCID mouse model that could be efficiently repopulated with human immature hepatocytes. This transgenic mouse model expresses human heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptors under the control of a liver cell-specific albumin promoter. Following the administration of diphtheria toxin (DT), these mice develop fulminant hepatitis due to conditional ablation of hepatocytes, enabling donor cell residency and proliferation¹². Although mouse hepatocytes have been successfully transplanted into Alb-TRECK/SCID mice in previous studies^13,14, the generation of a humanized liver using Alb-TRECK/SCID mice has yet to be reported.

In this study, humanized livers were generated in Alb-TRECK/SCID mice via transplantation of HpSCs. This humanized liver provides an in vivo environment for universal stem cell differentiation and the ability to predict human drug metabolism patterns and drug-drug interactions.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices para la Protección de Animales de la Universidad de la ciudad de Yokohama.

1. Generación del modelo de lesión hepática aguda Ratón

1. Añadir 1 ml de solución de NaCl al 0,85% con fenol (0,6 g de fenol en 100 ml de solución de NaCl al 0,85%) a 1 mg toxina de la difteria (DT) para hacer un ml de solución madre 1 mg / DT. Nota: DT a una concentración de 1 mg / ml se puede almacenar durante aproximadamente 2 años a 3 ° C a 8 ° C.
2. En serie diluir la solución de 1 mg / ml de stock DT a 0,3 g / ml DT en solución con fenol 0,85% de NaCl y preparar una alícuota de la solución de DT / ml 0,3 g como una solución de trabajo. Nota: Esta solución de trabajo debe estar recién preparado.
3. Para llevar a cabo experimentos utilizando una dosis subletal (~ 50% de letalidad), administrar ratones de 8 semanas de edad, una dosis / kg 1,5 g de DT.
   1. Realizar una inyección intraperitoneal de DT Manteniendo el ratón en decúbito dorsal e inserte el needle por debajo de la curva de las rodillas, hacia la izquierda o derecha de la línea media. Evitar la línea media para evitar la penetración de la vejiga. Ángulo de la aguja en aproximadamente 45 ° con respecto al cuerpo.
   2. Usando una jeringa de insulina, inyectar a los ratones con 100 l de recién preparada 0,3 g DT / ml por 20 g de peso del ratón. Por ejemplo, un joven de 18 g de ratón debe recibir 90 l de la disolución de TD / ml 0,3 mg.
4. Después de la inyección DT 48 hr, recoger la sangre de la vena de la cola mediante la colocación el ratón en un retenedor y el calentamiento de la cola de ratón en un baño de agua a 37 ° durante aproximadamente 10 min para dilatar los vasos sanguíneos. Luego, haga una de 1 mm incisión en la cola de 2 cm de la punta con una hoja de bisturí afilado y recoger la sangre con un tubo capilar se.
   1. Centrifugar el tubo microcapilar que contiene la sangre a 1.500 xg durante 5 min y se recoge el suero, separando el sobrenadante y las células de pellets.
5. Pipeta de 50 l de suero de ratón 1:20 diluida sobre GOT / AST-PIII se desliza. Se mide la absorbancia del producto de reacción (colorante azul) en 650 nm usando un analizador de química seca automático multiusos según el protocolo del fabricante.
   NOTA: La lectura de la aspartato aminotransferasa (AST) / actividad transaminasa glutámico oxalacético (GOT) se muestra automáticamente. 2 días después de la inyección de DT, aproximadamente el 60% de los ratones exhibieron valores de AST entre 12.000 - 16.000 UI / L y se considera que sufre de daño hepático agudo. Estos ratones se transfirieron a una nueva jaula y se utilizan como receptores de trasplante celular.

2. Preparación de las células madre hepáticas humanas

1. Aislar células madre hepáticas humanas a partir de células de hígado fetal primarios humanos con un clasificador de células usando los antígenos de las células CDCP1, CD90, CD66 y para obtener una subpoblación CD90 + CDCP1 + CD66-, a continuación, sembrar la población de células aisladas en placas de cultivo recubiertas con colágeno IV, como se informó anteriormente ^15. Utilizar células de hígado fetal primarios humanos de una embrionariaedad entre 14 y 18 semanas.
2. Recoger las células madre hepáticas humanas cultivadas a 80% - 90% de confluencia en placas de cultivo de 100 mm, aspirar el medio de cultivo, se lavan las células con 10 ml de PBS, y luego retirar el PBS. Tripsinizar las células con solución de tripsina / EDTA 2 ml 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Nota: Las células en más de un 90% de confluencia no son adecuados para el trasplante de células ya que la diferenciación de células puede influir en su capacidad proliferativa en ratones.
3. Supervisar el estado de dispersión de las células bajo un microscopio. Cuando las células parecen estar flotando o que fluye libremente, detener la digestión enzimática mediante la adición de 8 ml de DMEM / F12 que contiene 10% de FBS.
4. Suspender las células lentamente usando una pipeta serológica de 10 ml y la transferencia de las células en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células durante 5 minutos a 100 x g y 4 ° C.
5. resuspender cuidadosamente el sedimento celular en 10 ml de DMEM / F12 que contiene 10% de FBS y determinar el número de células usando una cámara del microscopio contando.
6. Dividir las células en 1,0 x 10 ⁶ células por 50 l de PBS alícuotas para cada ratón individual y almacenar en hielo hasta el trasplante.

3. intraesplénicos trasplante de células madre hepáticas humanas

1. Colocar una jaula limpia en un 37 ° C almohadilla eléctrica.
2. Anestesiar al ratón usando isoflurano inhalación (1 a 1,5% (vol / vol) en 2 L de oxígeno por min) colocándolo debajo de la boquilla. Alternativamente, utilizar tubos que contienen una gasa empapada con isoflurano.
   1. Asegúrese de que el ratón se anestesia pellizcando suavemente la almohadilla de la pata trasera. Si se provoca un reflejo de la rodilla, coloque el ratón de nuevo en la cámara. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
3. Afeitar el sitio quirúrgico usando una maquinilla eléctrica y aplicar el 70% (/ vol vol) de etanol y povidona yodada para esterilizar. A continuación, hacer una incisión en la piel de 1 cm en el flanco izquierdo justo por debajo del reborde costal de las costillas, seguido de una incisión enla pared abdominal, así como el peritoneo.
4. Descubra con cuidado el bazo. Utilice una jeringa microinyección de 100 l con un 32-G de aguja 1/2-pulgada para inyectar directamente 1,0 x 10 ⁶ células madre hepáticas humanas en 50 l de PBS en el bazo de cada ratón. Inclinar la aguja en un ángulo de 5 ° para inyección.
   1. Asegúrese de que la profundidad de la inyección es menor que la mitad del espesor del bazo. La aguja debe entrar en el bazo en un extremo (la cabeza) y depositar las células en el otro extremo (la cola).
5. Para evitar fugas de las células después de la inyección, aplicar una suave presión con el dedo durante 2 minutos y luego retirar la aguja.
6. Coloque el bazo de nuevo en el cuerpo del ratón y cerrar la cavidad con una sutura continua normal para la musculatura y la piel.
7. La transferencia de los ratones en una jaula de 37 ° C pre-calentado inmediatamente después del trasplante. Para garantizar el ratón es capaz de respirar sin dificultad, colocar el ratón sobre su lado en la jaula, unamiccional contacto entre la ropa de cama de la jaula y el sitio de la cirugía.
8. Monitorear los ratones hasta que el efecto de la anestesia para asegurar las suturas permanecen cerrados y los ratones de regreso a las condiciones pre-cirugía.
9. Asegurar que los ratones se proporcionan con el agua potable normal y alimentos. Después de 1 hora, volver a la jaula para la habitación del ratón del centro de animales y controlar los ratones diariamente.

4. Detección de Trasplantados hepática hepatocitos humanos de células madre derivadas de células en el hígado de ratón

Nota: Para los siguientes procedimientos, la eutanasia a todos los animales utilizando una sobredosis de ketamina y xilazina seguido por dislocación cervical.

1. A los 4 - 6 semanas después del trasplante, la eutanasia a los ratones y abrir la cavidad abdominal mediante la reducción simultánea del cutis y la fascia utilizando tijeras quirúrgicas.
2. Diseccionar el tejido conectivo por encima del peritoneo, con las tijeras como un esparcidor, y cortar el peritoneo a lo largo de la línea alba para abrir el peritonealcavidad.
3. Levantar el esternón con fórceps, perforar el diafragma, y ​​cortar a través de cada lado del esternón a través de la faja cervical.
4. Cortar la vena cava en el lado dorsal del hígado y tire del esófago a través del hígado en la dirección anterior. Retire el diafragma a fin de eliminar el hígado.
   Nota: Tenga cuidado de mantener la punta de las tijeras apuntando hacia arriba con el fin de evitar cualquier daño a los órganos torácicos debajo. El timo tiene una tendencia a aferrarse de vez en cuando en el lado dorsal del esternón y esto debe evitarse cuidadosamente.
5. El uso de la membrana como un mango, empezar a tirar el hígado fuera de la cavidad abdominal. La vena cava interior estará llevando a cabo el hígado en su lugar. Cortar el interior de la vena cava; tener cuidado de no liberar prematuramente la suprarrenal derecha.
   Nota: Los ratones tienen un hígado de cuatro lóbulos que consiste en un lóbulo medio, lóbulo izquierdo, lóbulo derecho y el lóbulo caudado. La vesícula biliar se suspende en la pequeña bifurcación deel lóbulo medio.
6. Separar los lóbulos de uno al otro en las uniones e integrarlos en el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Congelar los PTU que contiene el tejido hepático en las rejillas de metal en el criostato.
7. Cortar secciones de la muestra de 5 micras de grosor usando un criostato a -18 ° C y montarlos en portaobjetos de microscopio RT. Guarde el archivo a -80 ° C. Preparar los portaobjetos para hematoxilina y eosina (H & E) y tinción de inmunofluorescencia de acuerdo con procedimientos previamente reportados ^16.

5. Detección de Albúmina Humana secreción y cálculo de la tasa quimérico

1. Para medir la reconstitución de hígado humano, realizar albúmina humana ELISA utilizando suero y una albúmina ELISA kit humano de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Calcular la tasa de hígado quimérico humanizado por tiempo real PCR análisis de los niveles de expresión en todo el hígado humanizado. Determinar el ex relativarelación de nivel pression de actina humano específico para cruz actina humano-ratón (relación 1) y la relación de actina de ratón específico para cruz actina humano-ratón (relación 2). La tasa quimérico se calcula como cociente / 1 (relación 1 + relación de 2).

Resultados

Alb-Treck / hepatocitos ratones SCID expresan el receptor de DT gen HB-EGF humano bajo el control de un promotor de albúmina y exhiben efectos citotóxicos después de la administración DT ^12. Para evaluar los efectos del tratamiento DT sobre la lesión hepática, dosis de DT de 1,5 g / kg se inyectaron en ratones SCID de 8 semanas de edad, Alb-Treck / y los cambios patológicos en la administración DT h después de hígado 48 fueron evaluados histológicamente. En comparac...

Discusión

Estudios recientes han demostrado que el hígado de ratón se puede repoblada con hepatocitos humanos, incluidos los hepatocitos adultos y células madre hepáticas proliferativas ^17. Estos hígados repobladas han sido utilizados como modelos experimentales preclínicos para las pruebas de metabolismo de fármacos y el descubrimiento y el desarrollo ¹⁸ de drogas; Además, han proporcionado un entorno in vivo para la maduración y la diferenciación celular ^19. El principal objet...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human albumin	Sigma	A6684	Mouse
Human CK19	Dako	M088801	Mouse
Human nuclei	Millipore	MAB1281	Mouse
Human CK8/18	Progen	GP11	Guinea pig
CDCP1	Biolegend	324006	Mouse
CD90	BD	559869	Mouse
CD66	BD	551479	Mouse
GOT/AST-PIII	Fujifilm	14A2X10004000009
DMEM/F-12	Gibco	11320-033
FBS	Biowest	S1520
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Diphtheria Toxin	Sigma	D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit	Bethyl Laboratories	E88-129
Syringe (1 ml)	Terumo	SS-01T
32G 1/2" needle	TSK	PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)	Sakura Finetek Japan	4583
MoFlo high-speed cell sorter	Beckman Coulter	B25982
DRI-CHEM 7000	Fujifilm	14B2X10002000046