İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi

Özet

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Özet

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Giriş

Mice are commonly used for pharmaceutical testing since biomedical research in humans is restricted¹; however, these models are not always useful since they may inaccurately simulate the effects observed in humans. Most drugs in current medical use are metabolized primarily in the liver. However, the same drug can be metabolized into different metabolites in mouse and human livers because of inter-species differences. Thus, it is often difficult to determine during development whether a potential drug poses any risks for clinical applications^2,3.

To address this problem, "humanized" mouse livers have been developed by growing human liver cells inside mice^4-6; these models exhibit drug responses similar to those observed in the human liver. The primary mouse models currently used for humanized liver generation include uroplasminogen activator (uPA+/+) mice^4,7, fumarylacetoacetate hydrolase (Fah−/−) mice⁶, and the recently reported thymidine kinase (TK-NOG) mice.

However, previous reports have shown that transplanted human immature cells or stem cells are less competitive than adult human hepatocytes in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) mouse livers^8-10. Moreover, Fah−/− mice provide a growth advantage only for differentiated hepatocytes and not for immature liver progenitor cells¹¹. The transplantation of human hepatic stem cells (HpSCs) into TK-NOG mice in the lab has been unsuccessful. Hence, no useful mouse model for the efficient engraftment of human immature liver cells currently exists.

Thus, we developed a novel Alb-TRECK/SCID mouse model that could be efficiently repopulated with human immature hepatocytes. This transgenic mouse model expresses human heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptors under the control of a liver cell-specific albumin promoter. Following the administration of diphtheria toxin (DT), these mice develop fulminant hepatitis due to conditional ablation of hepatocytes, enabling donor cell residency and proliferation¹². Although mouse hepatocytes have been successfully transplanted into Alb-TRECK/SCID mice in previous studies^13,14, the generation of a humanized liver using Alb-TRECK/SCID mice has yet to be reported.

In this study, humanized livers were generated in Alb-TRECK/SCID mice via transplantation of HpSCs. This humanized liver provides an in vivo environment for universal stem cell differentiation and the ability to predict human drug metabolism patterns and drug-drug interactions.

Protokol

Tüm hayvan deney prosedürleri Yokohama City Üniversitesi Hayvanları Koruma düzenlemelerine göre yapılmıştır.

Akut Karaciğer Hasarı Fare Modeli 1. Nesil

1. 1 mg / ml'lik DT stok çözelti yapmak için, 1 mg difteri toksini (DT) ila (% 0.85 NaCI çözeltisi, 100 ml 0.6 g fenol) phenolized% 0.85 NaCl çözeltisi 1 ml. Not: 1 mg bir konsantrasyonda DT / ml 3 ° C ila 8 ° C 'de yaklaşık 2 yıl boyunca saklanabilir.
2. Seri olarak phenolized% 0.85 NaCl çözeltisi içinde 0.3 ug / ml DT 1 mg / ml stok çözelti DT seyreltilmesi ve çalışan bir çözelti olarak 0,3 ug / ml DT çözeltisinin bir bölümü hazırlanır. Not: Bu çalışma çözeltisi taze hazırlanmış olmalıdır.
3. Bir öldürücü doz (~% 50 öldürücü) kullanarak deneyler, 8 haftalık bir farelere DT 1.5 mikrogram / kg dozunu.
   1. sırt yatma fare tutarak DT intraperitoneal gerçekleştirin ve needl eklemekdiz viraj aşağıdaki e, sola veya orta hatta doğru. mesane nüfuz etmesini önlemek için orta hat kaçının. Açı vücuda iğne yaklaşık 45 ° 'dir.
   2. bir insülin şırıngası kullanılarak, fare ağırlığının her 20 gramı başına taze hazırlanmış 0.3 ug / ml DT 100 ul fare enjekte edilir. Örneğin, bir 18-G fare 0.3 ug / ml DT çözeltisi 90 ul almalıdır.
4. 48 saat sonra DT enjeksiyon, kan damarlarını genişletmek için yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde, fare kuyruk süzgeç fare yerleştirilmesi ve ısıtarak kuyruk damarından kan toplamak. Sonra, keskin bir neşter bıçağı ile ucundan kuyruk 2 cm 1 mm nick yapmak ve bir microcapillary tüp kan toplamak.
   1. 5 dakika boyunca 1,500 x g hızında kan içeren Mikro kapiller tüp Santrifüj ve süpernatan ve hücre topağı ayırarak serum toplanır.
5. 1:20 seyreltilmiştir fare serumu pipetle 50 ul GOT / AST üzerinePIII slaytlar. üreticinin protokolüne göre bir çok-amaçlı otomatik kuru bir kimyasal analizör kullanılarak 650 nm'de reaksiyon ürünü (mavi boya) absorbansı ölçülür.
   NOT: aspartat aminotransferaz (AST) okuma-out / glutamik okzalasetik transaminaz (GOT) faaliyet otomatik olarak görüntülenir. 16,000 IU / L ve akut karaciğer hasarı muzdarip kabul edildi - 2 gün DT enjeksiyon, farelerin yaklaşık% 60 12.000 arasında AST değerleri sergiledi sonrası. Bu fareler, yeni bir kafesine aktarılır ve hücre transplantasyon olarak kullanılmıştır.

İnsan Karaciğer Kök Hücre 2. Hazırlık

1. Bir CDCP1 + CD90 + CD66- ICSI'nin elde etmek CDCP1, CD90 ve CD66 hücre antijenleri kullanılarak bir hücre sıralayıcı ile insan birincil cenin karaciğer hücreleri insan karaciğer kök hücreleri izole, daha sonra kolajen IV kaplı kültür kaplarına izole hücre popülasyonunu tohum, daha önce ¹⁵ bildirilmiştir. Bir embriyonik insan primer cenin karaciğer hücreleri kullanarakhaftalarda 14 ve 18 yaş arası.
2. Kültür ortamı aspire, 100 mm kültür tabaklarında 90% izdiham 10 ml PBS ile hücreleri yıkayın ve sonra PBS kaldırmak -% 80 kadar kültürlü insan karaciğer kök hücreleri toplayın. 37 ° C'de 5 dakika boyunca 2 mi% 0.05 tripsin / EDTA solüsyonu ile hücreler tripsinize. Not: Hücre farklılaşması farelerde çoğalma yeteneği etkileyebilir çünkü% 90 daha izdiham hücreler, hücre transplantasyonu için uygun değildir.
3. mikroskop altında hücre dağılım durumunu izlemek. Hücreler kayan veya serbestçe akan gibi göründüğünde,% 10 FBS ihtiva eden DMEM / F12 8 ml ekleyerek ile enzimatik sindirme dur.
4. yavaş yavaş 10 ml serolojik pipet kullanarak hücrelerin askıya alma ve 15 ml konik bir tüp içine hücreleri aktarın. 100 x g'de 5 dakika 4 ° C'de hücreler santrifüj.
5. Dikkatle% 10 FBS içeren 10 ml DMEM / F12 hücre pelletini ve bir mikroskop sayma odacığı kullanılarak hücre sayısı belirlenir.
6. Her fare için PBS alikotları 50 ul başına 1.0 x 10 ⁶ hücre içine hücreleri bölün ve transplantasyon kadar buz üzerinde saklayın.

İnsan Karaciğer Kök Hücre 3. intrasplenik Nakli

1. 37 ° C elektrikli ısıtma yastığı temiz bir kafes yerleştirin.
2. meme altına yerleştirerek - (min başına oksijen 2 L% 1.5 (hacim / hacim) 1) fare kullanılarak izofluran inhalasyon anestezisi. Alternatif olarak, izofluran ile ıslatılmış gazlı bez içeren tüpler kullanın.
   1. Fare hafifçe arka Kapkaççı kısma anestezi olduğundan emin olun. Bir diz refleksi elicited ise, geri odasında fare yerleştirin. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
3. Elektrik kesme makineleri kullanılarak cerrahi siteyi Tıraş ve (hacim / hacim) etanol ve povidon-iyot sterilize etmek için% 70 uygulanır. Sonra bir kesi üzerinde izledi sadece kaburga kaburga sınırında aşağıda soldan içinde 1 cm cilt kesisi, yapmakkarın duvarı yanı sıra periton.
4. Dikkatle dalak maruz kalmaktadır. Doğrudan her fare dalak içine 50 ul PBS içinde 1.0 x 10 ⁶ insan karaciğer kök hücreleri enjekte etmek için bir 32-G 1/2-inç iğne ile 100 ul mikroenjeksiyon şırınga kullanın. enjeksiyon için 5 ° açıyla iğne eğin.
   1. enjeksiyon derinliği dalak yarısından daha az kalınlık olduğundan emin olun. iğne bir ucunda (kafa) de dalak girmek ve diğer ucunda (kuyruk) hücreleri yatırmanız gerekmektedir.
5. enjeksiyonu takiben hücrelerin sızmasını önlemek için, yavaşça 2 dakika süreyle bir parmağınızı kullanarak baskı uygulamak ve daha sonra iğne çıkarılır.
6. geri fare vücuda dalak yerleştirin ve kas ve cilt için normal çalışma dikiş ile boşluğu kapatın.
7. Hemen transplantasyonundan sonra 37 ° C önceden ısıtılmış bir kafes içine fareler aktarın. Fareyi sağlamak için, rahat nefes kafeste yan fare yerleştirmek yapabiliyorkafes yatak ve ameliyat sitede arasındaki teması işeme.
8. Anestezi sütür kapalı kalmasını sağlamak için kapalı giyer ve fareler koşulları ameliyat öncesi dönene kadar fareler izleyin.
9. fareler sağlamak, normal içme suyu ve gıda ile sağlanır. 1 saat sonra, hayvan merkezi fare oda kafes dönüş ve günlük fareler izler.

4. Tespit Nakledilen İnsan Karaciğer Fare Karaciğer, Hücre-Türetilmiş hepatositlerde Kök

Not: Aşağıdaki işlemler için, servikal dislokasyon tarafından takip ketamin ve ksilizin aşırı dozda kullanan tüm hayvanları euthanize.

1. 4 at - 6 hafta, transplantasyon sonrası fareler euthanize ve aynı zamanda kutis kesme ve fasya cerrahi makas kullanarak karın boşluğuna açın.
2. , Periton üzerinde bağ dokusu teşrih bir serpme olarak makas kullanılarak ve Peritoneal açmak için linea alba boyunca periton kestikavite.
3. , Forseps ile sternum kaldırın diyafram delinme ve servikal kuşak boyunca yukarı sternum her tarafında kesti.
4. Karaciğerin göğüs tarafında vena kava Sever ve anterior yönde karaciğer yoluyla yemek borusu çekin. karaciğer kaldırmak için diyafram çıkarın.
   Not: makas uçları altında göğüs organlara zarar vermemek için yukarı çekti tutmak için dikkatli olun. Timus bazen sternum dorsal tarafına tutunacak bir eğilimi vardır ve bu özenle kaçınılmalıdır.
5. Bir kolu olarak diyafram kullanarak, karın boşluğundan dışarı karaciğer çekerek başlayın. İç vena kava yerinde karaciğer tutan olacaktır. İç vena kava kesti; erken sağ adrenal kurtarmak için dikkatli olun.
   Not: Fareler bir medyan lobun oluşan dört loblu karaciğer, sol lob, sağ lob ve kaudat lobu var. Safra kesesi küçük bifurkasyonunda askıya alınırmedyan lobu.
6. kavşaklarda birbirinden lobları ayırın ve üreticinin protokolüne uygun olarak uygun kesme ısısı (OCT), bileşik bunları yerleştirin. kriyostat metal ızgaralar karaciğer doku içeren OCT dondurun.
7. -18 ° C'de bir Kriyostat kullanarak 5-mikron kalınlığında örnek bölümleri kesmek ve RT mikroskop slaytlar onları monte edin. -80 ° C de stok saklayın. Hematoksilin ve eosin (H & E) ile, daha önce rapor edilen prosedürlere ^16'ya göre immünofloresan boyama için slaytlar hazırlayın.

5. İnsan Albumin salgısını Algılama ve Kimerik Oranı Hesaplama

1. İnsan karaciğer sulandırma ölçmek için, serum ve üretici talimatlarına göre bir insan albümini ELISA kiti kullanılarak insan albümini ELISA'yı gerçekleştirmek.
2. tam hümanize karaciğerde gerçek zamanlı ifade düzeylerinin PCR analizi insanlaştırılmış karaciğer kimerik oranını hesaplar. göreceli eski belirleyininsan, fare çapraz aktine insana özgü aktin pression seviyesi oranı (oran 1) ve insan-fare çapraz aktin fare özgü aktin oranı (oran 2). Kimerik hız oranı 1 / olarak (oran 1 + oranı 2) hesaplanır.

Sonuçlar

Alb-Treck / SCID fareleri hepatositler bir albümin promotörü kontrolü altında insan DT reseptörü, HB-EGF genini ifade DT tatbikat ^12, aşağıdaki sitotoksik etki gösterir. Karaciğer hasarı üzerine DT tedavinin etkilerini değerlendirmek için, 1,5 mikrogram / kg DT dozları 8 haftalık Alb-Treck / SCID farelere enjekte edildi ve karaciğer 48 saat sonrası DT yönetimindeki patolojik değişiklikler histolojik olarak değerlendirildi. (Değil DT ile muamele edilmi?...

Tartışmalar

Son çalışmalar, fare karaciğer yetişkin hepatositlerin ve proliferatif hepatik kök hücreleri ¹⁷ de dahil olmak üzere insan hepatositleri ile yeniden yerleştirilmesi göstermiştir. Bu repopulated karaciğer ilaç metabolizması test ve ilaç keşfi ve geliştirilmesi için ¹⁸ klinik öncesi deneysel model olarak kullanılmıştır; Buna ek olarak, hücre olgunlaşması ve farklılaşması ¹⁹ için bir in vivo ortamda sağladı. Bu çalışmanın temel amacı ilaç metab...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human albumin	Sigma	A6684	Mouse
Human CK19	Dako	M088801	Mouse
Human nuclei	Millipore	MAB1281	Mouse
Human CK8/18	Progen	GP11	Guinea pig
CDCP1	Biolegend	324006	Mouse
CD90	BD	559869	Mouse
CD66	BD	551479	Mouse
GOT/AST-PIII	Fujifilm	14A2X10004000009
DMEM/F-12	Gibco	11320-033
FBS	Biowest	S1520
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Diphtheria Toxin	Sigma	D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit	Bethyl Laboratories	E88-129
Syringe (1 ml)	Terumo	SS-01T
32G 1/2" needle	TSK	PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)	Sakura Finetek Japan	4583
MoFlo high-speed cell sorter	Beckman Coulter	B25982
DRI-CHEM 7000	Fujifilm	14B2X10002000046