דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

Summary

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Abstract

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Introduction

Mice are commonly used for pharmaceutical testing since biomedical research in humans is restricted¹; however, these models are not always useful since they may inaccurately simulate the effects observed in humans. Most drugs in current medical use are metabolized primarily in the liver. However, the same drug can be metabolized into different metabolites in mouse and human livers because of inter-species differences. Thus, it is often difficult to determine during development whether a potential drug poses any risks for clinical applications^2,3.

To address this problem, "humanized" mouse livers have been developed by growing human liver cells inside mice^4-6; these models exhibit drug responses similar to those observed in the human liver. The primary mouse models currently used for humanized liver generation include uroplasminogen activator (uPA+/+) mice^4,7, fumarylacetoacetate hydrolase (Fah−/−) mice⁶, and the recently reported thymidine kinase (TK-NOG) mice.

However, previous reports have shown that transplanted human immature cells or stem cells are less competitive than adult human hepatocytes in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) mouse livers^8-10. Moreover, Fah−/− mice provide a growth advantage only for differentiated hepatocytes and not for immature liver progenitor cells¹¹. The transplantation of human hepatic stem cells (HpSCs) into TK-NOG mice in the lab has been unsuccessful. Hence, no useful mouse model for the efficient engraftment of human immature liver cells currently exists.

Thus, we developed a novel Alb-TRECK/SCID mouse model that could be efficiently repopulated with human immature hepatocytes. This transgenic mouse model expresses human heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptors under the control of a liver cell-specific albumin promoter. Following the administration of diphtheria toxin (DT), these mice develop fulminant hepatitis due to conditional ablation of hepatocytes, enabling donor cell residency and proliferation¹². Although mouse hepatocytes have been successfully transplanted into Alb-TRECK/SCID mice in previous studies^13,14, the generation of a humanized liver using Alb-TRECK/SCID mice has yet to be reported.

In this study, humanized livers were generated in Alb-TRECK/SCID mice via transplantation of HpSCs. This humanized liver provides an in vivo environment for universal stem cell differentiation and the ability to predict human drug metabolism patterns and drug-drug interactions.

Protocol

כל הפרוצדורות בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות צער בעלי חיים של אוניברסיטת העיר יוקוהמה.

1. דור של במודל העכבר הפגיע בכבד החריף

1. הוסף 1 מ"ל של תמיסת 0.85% NaCl phenolized (פנול 0.6 גרם ב 100 מ"ל של תמיסת 0.85% NaCl) עד 1 רעלן דיפתריה מ"ג (DT) כדי להפוך פתרון מניות 1 מ"ג / מ"ל ​​DT. הערה: DT בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ​​ניתן לאחסן כ 2 שנים 3 מעלות צלזיוס עד 8 מעלות צלזיוס.
2. סדרתי לדלל את פתרון מניות 1 מ"ג / מיליליטר DT 0.3 מיקרוגרם / מיליליטר DT בתמיסת phenolized 0.85% NaCl ולהכין aliquot של פתרון DT 0.3 מיקרוגרם / מיליליטר כפתרון עבודה. הערה: הפתרון עובד זה אמור להיות מוכן טרי.
3. כדי לערוך ניסויים שימוש במינון sublethal (~ 50 הקטלניות%), לנהל עכברים 8 שבועות בן מנה 1.5 מיקרוגרם / ק"ג של DT.
   1. בצע זריקה intraperitoneal של DT ידי החזקת העכבר שכיבה על הגב והכנס את needlה להלן העיקול של הברכיים, שמאלה או ימינה של קו האמצע. הימנע קו האמצע כדי למנוע חדירה של שלפוחית ​​השתן. זווית את המחט על כ 45 מעלות לגוף.
   2. באמצעות מזרק אינסולין, להזריק עכברים עם 100 μl של המוכן טרי 0.3 מיקרוגרם / מ"ל ​​DT לכל 20 גרם של משקל העכבר. לדוגמה, עכבר 18 גרם צריך לקבל 90 μl של פתרון DT 0.3 מיקרוגרם / מ"ל.
4. בשעה 48 הזרקת שעות שלאחר DT, לאסוף דם מווריד הזנב על ידי הצבת העכבר בתוך עוצר ומחמם הזנב העכבר באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך כ 10 דקות כדי להרחיב את כלי הדם. לאחר מכן, לבצע ניק 1-מ"מ ס"מ הזנב 2 מהקצה עם להב אזמל חד לאסוף את הדם עם צינור microcapillary.
   1. צנטריפוגה צינור microcapillary המכיל את הדם ב 1500 XG במשך 5 דקות לאסוף את הסרום על ידי הפרדת גלולת supernatant ותא.
5. פיפטה 50 μl של 1:20 סרום עכבר מדולל על GOT / AST-PIII מחליק. מדוד את הספיגה של מוצר התגובה (צבע כחול) ב 650 ננומטר באמצעות נתח רב תכליתי אוטומטית יבשה-כימיה על פי הפרוטוקול של היצרן.
   הערה: מתוך לקריאה של aminotransferase aspartate (AST) / transaminase oxaloacetic גלוטמית (GOT) פעילות מוצגת באופן אוטומטי. 2 ימים שלאחר DT זריקה, כ -60% מהעכברים הציג ערכים AST בין 12,000 - 16,000 IU / L ונחשבו סובל מנזק כבד חריפה. עכברים אלו הועברו לכלוב חדש ומשומש כמקבל השתלה תאית.

2. הכנה בתאי גזע אנושית כבדיה

1. לבודד תאי גזע בכבד אדם מתאי כבד עוברי עיקרי אדם עם סדרן תא באמצעות CDCP1, CD90, ו אנטיגנים תא CD66 להשיג subpopulation CDCP1 + CD90 + CD66-, אז זרע אוכלוסיית התאים המבודדת על קולגן תרבות מנות IV-מצופות, כפי שדווח בעבר ^15. השתמש בתאים בכבד עובר עיקריים אדם של עובריגיל בין שבועות 14 ו -18.
2. אסוף בתאי גזע כבד אנושיים תרבותיים עד 80% - מפגש 90% על תרבות מנות 100 מ"מימ, לשאוב את מדיום התרבות, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS, ולאחר מכן להסיר את PBS. Trypsinize את התאים עם פתרון 0.05% טריפסין / EDTA 2 מ"ל במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: תאים בבית יותר מ 90 מפגש% אינם מתאימים השתלת תאים מאז התמיינות תאים עשויה להשפיע יכולת השגשוג שלהם בעכברים.
3. לפקח על מצב של פיזור התאים תחת מיקרוסקופ. כאשר התאים מופיעים בריחוף או לזרום בחופשיות, לעצור את העיכול אנזימטי על ידי הוספת 8 מיליליטר של DMEM / F12 המכיל 10% FBS.
4. להשעות את התאים לאט בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל ולהעביר את התאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 100 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
5. בזהירות resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל DMEM / F12 המכיל 10% FBS ולקבוע מספרים סלולריים באמצעות תא ספירה מיקרוסקופ.
6. מחלקים את התאים לתוך 1.0 x 10 ⁶ תאים לכל 50 μl של aliquots PBS עבור כל עכבר הפרט ולאחסן על הקרח עד להשתלה.

3. השתלת Intrasplenic של תאי גזע אנושי כבדיה

1. מניחים לכלוב נקי על כרית חימום חשמלי 37 ° C.
2. להרדים את שאיפת isoflurane באמצעות העכבר (1 - 1.5% (כרך / כרך) ב 2 ליטר של חמצן לדקה) על ידי הצבתו מתחת זרבובית. לחלופין, השתמש צינורות המכילים גזה ספוגה isoflurane.
   1. ודא כי העכבר הוא מורדם על ידי צובט את השודד האחורי בקלילות. אם אידיוט ברך מתקבל, למקם את העכבר בחזרה לתא. השתמש במשחת וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
3. לגלח את האתר כירורגית באמצעות קוצץ חשמלי ולהחיל 70% (כרך / כרך) אתנול povidone יוד לעקר. ואז לעשות חתך בעור 1-ס"מ בכנף שמאל ממש מתחת לגבול costal של הצלעות, ואחריו חתך עלדופן הבטן, כמו גם את הצפק.
4. בזהירות לחשוף את הטחול. השתמש במזרק microinjection 100 μl עם מחט 32-G 1/2-inch להזריק ישירות 1.0 x 10 ⁶ בתאי גזע בכבד האדם 50 μl PBS לתוך הטחול של כל עכבר. הטה את המחט בזווית 5 מעלות להזרקה.
   1. ודא כי ועומק הזרקה הוא פחות ממחצית עובי של הטחול. המחט צריכה להיכנס הטחול בקצה אחד (ראש) וכן להפקיד את התאים בקצה השני (הזנב).
5. כדי למנוע דליפה של התאים לאחר ההזרקה, להפעיל לחץ בעדינות בעזרת האצבע למשך 2 דקות ולאחר מכן להסיר את המחט.
6. מניח את הטחול בחזרה לתוך גוף העכבר ולסגור את החלל עם תפר ריצה נורמלי השרירים והעור.
7. מעבירים את העכברים לכלוב מחומם מראש 37 ° C מיד לאחר ההשתלה. כדי להבטיח את העכבר הוא מסוגל לנשום בנוחות, הצב את העכבר על צדו בכלוב,רקת קשר בין מצעי כלוב באתר של ניתוח.
8. צג העכברים עד ההרדמה פגה כדי להבטיח את התפרים נשארים סגורות העכברים לחזור טרום ניתוח תנאים.
9. ודא העכברים מסופקים עם מים ומזון שתייה רגילים. אחרי השעה 1, להחזיר את הכלוב לחדר העכבר של מרכז בעלי החיים לפקח על העכברים יומיים.

4. איתור של מושתלי האדם כבדית גזע hepatocytes נגזר-Cell בכבד העכבר

הערה: ההליכים הבאים, להרדים כל בעלי החיים באמצעות מנת יתר של קטמין ו xylazine ואחריו נקע בצוואר הרחם.

1. ב 4 - 6 שבועות לפרסם ההשתלה, להרדים את העכברים ולפתוח את חלל הבטן על ידי חיתוך cutis בו זמנית fascia באמצעות מספריים כירורגיות.
2. לנתח את רקמת החיבור מעל הצפק, באמצעות מספריים כמו מפזר, וחתך את הצפק לאורך alba Linea כדי לפתוח את הצפקחָלָל.
3. הרם את החזה עם מלקחיים, לנקב את הסרעפת, ולחתוך בכל צד של עצם החזה עד דרך אבנט צוואר הרחם.
4. לנתק את הווריד הנבוב בצד החזה של הכבד ולמשוך הוושט דרך הכבד לכיוון הקדמי. הסר את הסרעפת על מנת להסיר את הכבד.
   הערה: הקפד לשמור את קצות מספריים הצביע כלפי מעלה על מנת למנוע כל נזק לאיברים החזה מתחת. התימוס יש נטייה להיצמד מדי פעם בצד הגבי של החזה וזה יש להימנע בזהירות.
5. באמצעות הסרעפת כידית, מתחיל ללחוץ על הכבד מתוך חלל הבטן. הווריד הנבוב הפנים יקיים כבד במקום. חותכים את הווריד הנבוב פנים; להיזהר שלא לשחרר את הכליה התקינה בטרם עת.
   הערה: יש עכברים כבדים ארבעה אונות מורכב אונת חציון, באונה שמאלית, אונה ימנית, ואונת caudate. את כיס המרה מושעה ב הסתעפות קטנה שלאונת החציון.
6. הפרד את האונות אחד מהשני בצומת והטמעת אותם בטמפרטורת חיתוך אופטימלי מתחמת (אוקטובר) על פי הפרוטוקול של היצרן. Freeze ב- OCT המכיל את רקמת הכבד של רשתות מתכת על cryostat.
7. חותכים חלקים מדגם בעובי של 5 מיקרומטר באמצעות cryostat ב C -18 ° ולעגן אותם בשקופיות מיקרוסקופ RT. אחסן את המניה ב -80 ° C. הכן את השקופיות עבור hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים immunofluorescence פי נהלים שדווח בעבר ^16.

5. איתור של הפרשת אלבומין אדם חישוב שיעור Chimeric

1. כדי למדוד כינון מחדש כבד אנושי, לבצע אלבומין האנושי ELISA שימוש בסרום וערכת ELISA אדם אלבומין פי הוראות היצרן.
2. חשב את שיעור כימרי הכבד האנושי על ידי בזמן אמת ניתוח PCR של רמות ביטוי בכבד השלם-אנושי. קבע את האקס יחסיתpression יחס רמה תקטין אדם ספציפי כדי יקטין צלב אדם ועכבר (1 יחס) והיחס של אקטין ספציפי בעכבר כדי יקטין צלב אדם ועכבר (יחס 2). שיעור כימרי מחושב כיחס 1 / (יחס 1 + יחס 2).

תוצאות

Alb-TRECK / hepatocytes עכברי SCID המבטא את גן HB-EGF קולטן DT אדם בשליטת אמרגן אלבומין ולהציג השפעות ציטוטוקסיות הבאים DT ממשל ^12. כדי להעריך את ההשפעות של טיפול DT על פגיעה בכבד, מינונים DT של 1.5 מיקרוגרם / ק"ג הוזרקו בן 8 שבועות Alb-TRECK / SCID עכברים ואת שינויים פתולו...

Discussion

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הכבד העכבר ניתן אוכלס מחדש עם hepatocytes אדם, כולל hepatocytes מבוגר בתאי גזע בכבד שגשוג ^17. כבדי אוכלס מחדש אלה שימשו דגמים ניסיוניים פרה-קליניים עבור בדיקות סמים מטבוליזם גילוי ופיתוח תרופות ^18; בנוסף, סיפקו להם בסביבה vivo עבור התבגר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human albumin	Sigma	A6684	Mouse
Human CK19	Dako	M088801	Mouse
Human nuclei	Millipore	MAB1281	Mouse
Human CK8/18	Progen	GP11	Guinea pig
CDCP1	Biolegend	324006	Mouse
CD90	BD	559869	Mouse
CD66	BD	551479	Mouse
GOT/AST-PIII	Fujifilm	14A2X10004000009
DMEM/F-12	Gibco	11320-033
FBS	Biowest	S1520
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Diphtheria Toxin	Sigma	D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit	Bethyl Laboratories	E88-129
Syringe (1 ml)	Terumo	SS-01T
32G 1/2" needle	TSK	PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)	Sakura Finetek Japan	4583
MoFlo high-speed cell sorter	Beckman Coulter	B25982
DRI-CHEM 7000	Fujifilm	14B2X10002000046