Generazione di un umanizzato mouse Fegato Utilizzando epatici umani cellule staminali

Riepilogo

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Abstract

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Introduzione

Mice are commonly used for pharmaceutical testing since biomedical research in humans is restricted¹; however, these models are not always useful since they may inaccurately simulate the effects observed in humans. Most drugs in current medical use are metabolized primarily in the liver. However, the same drug can be metabolized into different metabolites in mouse and human livers because of inter-species differences. Thus, it is often difficult to determine during development whether a potential drug poses any risks for clinical applications^2,3.

To address this problem, "humanized" mouse livers have been developed by growing human liver cells inside mice^4-6; these models exhibit drug responses similar to those observed in the human liver. The primary mouse models currently used for humanized liver generation include uroplasminogen activator (uPA+/+) mice^4,7, fumarylacetoacetate hydrolase (Fah−/−) mice⁶, and the recently reported thymidine kinase (TK-NOG) mice.

However, previous reports have shown that transplanted human immature cells or stem cells are less competitive than adult human hepatocytes in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) mouse livers^8-10. Moreover, Fah−/− mice provide a growth advantage only for differentiated hepatocytes and not for immature liver progenitor cells¹¹. The transplantation of human hepatic stem cells (HpSCs) into TK-NOG mice in the lab has been unsuccessful. Hence, no useful mouse model for the efficient engraftment of human immature liver cells currently exists.

Thus, we developed a novel Alb-TRECK/SCID mouse model that could be efficiently repopulated with human immature hepatocytes. This transgenic mouse model expresses human heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptors under the control of a liver cell-specific albumin promoter. Following the administration of diphtheria toxin (DT), these mice develop fulminant hepatitis due to conditional ablation of hepatocytes, enabling donor cell residency and proliferation¹². Although mouse hepatocytes have been successfully transplanted into Alb-TRECK/SCID mice in previous studies^13,14, the generation of a humanized liver using Alb-TRECK/SCID mice has yet to be reported.

In this study, humanized livers were generated in Alb-TRECK/SCID mice via transplantation of HpSCs. This humanized liver provides an in vivo environment for universal stem cell differentiation and the ability to predict human drug metabolism patterns and drug-drug interactions.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida protezione degli animali di Yokohama City University.

1. generazione del modello Acute Liver Injury mouse

1. Aggiungere 1 ml di soluzione di NaCl 0,85% fenicato (0,6 g di fenolo in 100 ml di soluzione 0,85% di NaCl) a 1 mg tossina difterica (DT) per fare un / ml di soluzione DT 1 mg. Nota: DT ad una concentrazione di 1 mg / ml può essere conservato per circa 2 anni 3 ° C e 8 ° C.
2. In serie diluire la soluzione 1 mg / ml DT stock da 0,3 mg / ml in DT 0,85% soluzione fenicato NaCl e preparare una aliquota della soluzione DT / ml 0,3 mg come soluzione di lavoro. Nota: Questa soluzione di lavoro deve essere preparata.
3. Per condurre esperimenti utilizzando una dose subletale (~ 50% di mortalità), amministrare 8 settimane di età topi una dose / kg 1,5 mg di DT.
   1. Eseguire un'iniezione intraperitoneale di DT Tenendo premuto il mouse in decubito dorsale e inserire il needle sotto la curva del ginocchio, a sinistra oa destra della linea mediana. Evitare la linea mediana per impedire la penetrazione della vescica. Angolo l'ago di circa 45 ° rispetto al corpo.
   2. Utilizzando una siringa da insulina, iniettare i topi con 100 ml di appena preparato 0,3 mcg / ml DT per 20 g di peso mouse. Ad esempio, un 18-g mouse dovrebbe ricevere 90 microlitri della soluzione DT / ml 0,3 mg.
4. A iniezione alberino DT 48 hr, raccogliere il sangue dalla vena della coda posizionando il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e riscaldando la coda di topo in un bagno d'acqua a 37 ° C per circa 10 minuti per dilatare i vasi sanguigni. Poi, fare un 1 mm nick nella coda due centimetri dalla punta con una lama di bisturi tagliente e raccogliere il sangue con un microcapillare.
   1. Centrifugare la microcapillare contenente il sangue a 1500 xg per 5 minuti e raccogliere il siero separando il surnatante e cellule pellet.
5. Pipettare 50 ml di siero di topo 1:20 diluito Onto GOT / AST-PIII scivola. Misurare l'assorbanza del prodotto di reazione (colorante blu) a 650 nm utilizzando un multi-purpose analizzatore automatico di chimica a secco secondo il protocollo del produttore.
   NOTA: Il read-out di aspartato aminotransferasi (AST) / glutammico attività transaminasi ossalacetica (GOT) viene visualizzato automaticamente. 2 giorni dopo l'iniezione DT, circa il 60% dei topi esposti valori AST tra 12.000 - 16.000 IU / L e sono stati considerati di essere affetti da danni al fegato acuto. Questi topi sono stati trasferiti ad una nuova gabbia e utilizzati come trapianto di cellule.

2. Preparazione di epatici umani cellule staminali

1. Isolare le cellule staminali epatiche umane da cellule di fegato umano primario fetale con un cell sorter utilizzando gli antigeni cellulari CDCP1, CD90, CD66 e di ottenere una sottopopolazione CDCP1 + CD90 + CD66-, poi seminare la popolazione di cellule isolato su piatti della cultura collagene IV-rivestiti, come riportato in precedenza ^15. Uso primario cellule epatiche fetali umane di un embrioneetà tra le settimane 14 e 18.
2. Raccogliere le cellule staminali epatiche umane in coltura al 80% - 90% di confluenza su piastre di coltura da 100 mm, aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule con 10 ml di PBS, e quindi rimuovere il PBS. Trypsinize le cellule con soluzione di tripsina / EDTA 2 ml 0,05% per 5 min a 37 ° C. Nota: Le celle a maggiore del 90% di confluenza non sono adatti per il trapianto di cellule dal differenziamento cellulare può influenzare la loro capacità proliferativa nei topi.
3. Monitorare lo stato di dispersione di cellule al microscopio. Quando le cellule sembrano essere flottante o scorre liberamente, fermare la digestione enzimatica aggiungendo 8 ml di DMEM / F12 contenente 10% FBS.
4. Sospendere le cellule lentamente utilizzando una pipetta sierologica 10 ml e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare le cellule per 5 min a 100 xg e 4 ° C.
5. risospendere delicatamente il pellet cellulare in 10 ml DMEM / F12 contenente il 10% FBS e determinare il numero di cellule utilizzando una camera di conteggio microscopio.
6. Dividere le cellule in 1,0 x 10 ⁶ cellule per 50 ml di PBS aliquote per ogni singolo mouse e memorizzare in ghiaccio fino trapianto.

3. intrasplenico Il trapianto di cellule staminali epatiche umane

1. Posizionare una gabbia pulita su una C rilievo di riscaldamento elettrico 37 °.
2. Anestetizzare il mouse con isoflurano inalazione (1 - 1,5% (vol / vol) in 2 L di ossigeno per min) ponendolo sotto l'ugello. In alternativa, utilizzare provette contenenti garza imbevuta con isoflurano.
   1. Assicurarsi che il mouse è anestetizzato con una leggera pizzicando la zampa posteriore. Se un coglione ginocchio è suscitato, posizionare il mouse di nuovo nella camera. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
3. Shave il sito chirurgico utilizzando cesoie elettriche e applicare il 70% (/ vol vol) di etanolo e iodopovidone per sterilizzare. Poi fare un 1-cm incisione cutanea nel fianco sinistro appena sotto il bordo costiera delle nervature, seguita da un'incisionela parete addominale, così come il peritoneo.
4. esporre con cura la milza. Utilizzare una siringa microiniezione da 100 ml con una 32-ago G 1/2-inch per iniettare direttamente 1,0 x 10 ⁶ cellule staminali epatiche umane in 50 microlitri di PBS nella milza di ogni mouse. Inclinare l'ago con un angolo di 5 ° per l'iniezione.
   1. Assicurarsi che la profondità di iniezione è inferiore alla metà dello spessore della milza. L'ago deve entrare milza ad una estremità (testa) e depositare le cellule all'altra estremità (coda).
5. Per evitare perdite delle cellule dopo l'iniezione, applicare delicatamente pressione con un dito per 2 minuti e poi rimuovere l'ago.
6. Posizionare la milza nuovamente dentro il corpo del mouse e chiudere la cavità con un normale sutura continua per la muscolatura e la pelle.
7. Trasferire i topi in una gabbia di 37 ° C pre-riscaldato subito dopo il trapianto. Per assicurare il mouse è in grado di respirare comodamente, posizionare il mouse sul lato nella gabbia, uninvalidare contatto tra la biancheria gabbia e il sito chirurgico.
8. Monitorare i topi fino a quando l'anestesia svanisce per garantire le suture rimangono chiusi e topi tornare al pre-chirurgia condizioni.
9. Assicurarsi che i topi sono dotati di normale acqua potabile e cibo. Dopo 1 ora, tornare la gabbia alla stanza del mouse del centro animale e monitorare i topi al giorno.

4. Individuazione di trapiantati epatici umani staminali epatociti derivati ​​dalle cellule del fegato di topo

Nota: Per le seguenti procedure, eutanasia tutti gli animali che utilizzano una overdose di ketamina e xilazina seguita da dislocazione cervicale.

1. A 4 - 6 settimane dopo il trapianto, i topi eutanasia e aprire la cavità addominale, tagliando contemporaneamente la cute e la fascia con le forbici chirurgiche.
2. Sezionare il tessuto connettivo sopra il peritoneo, usando le forbici come un diffusore, e tagliare il peritoneo lungo la linea alba per aprire la peritonealecavità.
3. Sollevare lo sterno con una pinza, forare la membrana, e tagliare ogni lato dello sterno attraverso la cintura cervicale.
4. Sever vena cava sul lato toracica del fegato e tirare l'esofago attraverso il fegato in direzione anteriore. Rimuovere il diaframma per rimuovere il fegato.
   Nota: Fare attenzione a tenere le punte delle forbici puntate verso l'alto al fine di prevenire eventuali danni agli organi toracici sotto. Il timo ha la tendenza ad aggrapparsi occasionalmente lato dorsale dello sterno e questo deve essere evitato con attenzione.
5. Usando il diaframma come maniglia, inizia a tirare il fegato fuori della cavità addominale. La vena cava interno terrà il fegato a posto. Tagliare la vena cava interno; fare attenzione a non liberare prematuramente il surrene destro.
   Nota: I topi hanno un fegato quadrilobata costituito da un lobo mediano, lobo sinistro, lobo destro, e il lobo caudato. La cistifellea è sospeso nella piccola biforcazione dilobo mediano.
6. Separare i lobi gli uni dagli altri alle giunzioni e incorporarli in mescola ottimale temperatura di taglio (OCT) secondo il protocollo del produttore. Congelare personalizzazione di Office che contiene il tessuto epatico nelle griglie metalliche sulla criostato.
7. Tagliare le sezioni di esempio 5-micron di spessore con un criostato a -18 ° C e montarli su vetrini da microscopio RT. Conservare lo stock a -80 ° C. Preparare i vetrini per ematossilina e eosina (H & E) e immunofluorescenza secondo le procedure precedentemente riportati ^16.

5. Individuazione di Human Albumina secrezione e il calcolo del tasso chimerico

1. Per misurare la ricostituzione fegato umano, eseguire albumina umana ELISA utilizzando siero e albumina umana kit ELISA secondo le istruzioni del produttore.
2. Calcolare il fegato tasso chimerico umanizzato da analisi in tempo reale PCR dei livelli di espressione di tutta-umanizzato fegato. Determinare il relativo exrapporto del livello di pressione di actina specifico umano a umano-topo croce actina (rapporto 1) e il rapporto di actina specifiche mouse umano-topo croce actina (rapporto 2). Il tasso chimerico viene calcolato come rapporto 1 / (rapporto 1 + rapporto 2).

Risultati

Alb-treck / epatociti topi SCID esprimono il recettore DT HB-EGF gene umano sotto il controllo di un promotore di albumina e mostrano effetti citotossici in seguito alla somministrazione DT ^12. Per valutare gli effetti del trattamento DT sul danno epatico, DT dosi di 1,5 mcg / kg sono state iniettate in 8 settimane di età Alb-Treck / topi SCID e le alterazioni patologiche nel hr postale amministrazione DT fegato 48 sono stati valutati istologicamente. Rispetto ai topi di cont...

Discussione

Recenti studi hanno dimostrato che il fegato del mouse può essere ripopolata con epatociti umani, tra cui epatociti adulte e cellule staminali epatiche proliferative ^17. Questi fegati ripopolati sono stati utilizzati come modelli sperimentali preclinici per i test metabolismo dei farmaci e scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo ^18; Inoltre, essi hanno fornito un ambiente in vivo per la maturazione delle cellule e differenziazione ^19. Il principale obiettivo di questo studio è...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human albumin	Sigma	A6684	Mouse
Human CK19	Dako	M088801	Mouse
Human nuclei	Millipore	MAB1281	Mouse
Human CK8/18	Progen	GP11	Guinea pig
CDCP1	Biolegend	324006	Mouse
CD90	BD	559869	Mouse
CD66	BD	551479	Mouse
GOT/AST-PIII	Fujifilm	14A2X10004000009
DMEM/F-12	Gibco	11320-033
FBS	Biowest	S1520
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Diphtheria Toxin	Sigma	D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit	Bethyl Laboratories	E88-129
Syringe (1 ml)	Terumo	SS-01T
32G 1/2" needle	TSK	PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)	Sakura Finetek Japan	4583
MoFlo high-speed cell sorter	Beckman Coulter	B25982
DRI-CHEM 7000	Fujifilm	14B2X10002000046