인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

요약

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

초록

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

서문

Mice are commonly used for pharmaceutical testing since biomedical research in humans is restricted¹; however, these models are not always useful since they may inaccurately simulate the effects observed in humans. Most drugs in current medical use are metabolized primarily in the liver. However, the same drug can be metabolized into different metabolites in mouse and human livers because of inter-species differences. Thus, it is often difficult to determine during development whether a potential drug poses any risks for clinical applications^2,3.

To address this problem, "humanized" mouse livers have been developed by growing human liver cells inside mice^4-6; these models exhibit drug responses similar to those observed in the human liver. The primary mouse models currently used for humanized liver generation include uroplasminogen activator (uPA+/+) mice^4,7, fumarylacetoacetate hydrolase (Fah−/−) mice⁶, and the recently reported thymidine kinase (TK-NOG) mice.

However, previous reports have shown that transplanted human immature cells or stem cells are less competitive than adult human hepatocytes in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) mouse livers^8-10. Moreover, Fah−/− mice provide a growth advantage only for differentiated hepatocytes and not for immature liver progenitor cells¹¹. The transplantation of human hepatic stem cells (HpSCs) into TK-NOG mice in the lab has been unsuccessful. Hence, no useful mouse model for the efficient engraftment of human immature liver cells currently exists.

Thus, we developed a novel Alb-TRECK/SCID mouse model that could be efficiently repopulated with human immature hepatocytes. This transgenic mouse model expresses human heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptors under the control of a liver cell-specific albumin promoter. Following the administration of diphtheria toxin (DT), these mice develop fulminant hepatitis due to conditional ablation of hepatocytes, enabling donor cell residency and proliferation¹². Although mouse hepatocytes have been successfully transplanted into Alb-TRECK/SCID mice in previous studies^13,14, the generation of a humanized liver using Alb-TRECK/SCID mice has yet to be reported.

In this study, humanized livers were generated in Alb-TRECK/SCID mice via transplantation of HpSCs. This humanized liver provides an in vivo environment for universal stem cell differentiation and the ability to predict human drug metabolism patterns and drug-drug interactions.

프로토콜

모든 동물 실험 절차는 요코하마 시립 대학의 동물 보호 지침에 따라 수행 하였다.

급성 간 손상 마우스 모델 1 세대

1. 1 ㎎ / ㎖ DT 원액을 1 mg을 디프테리아 독소 (DT) 내지 (0.85 % NaCl 용액 100 ㎖에 0.6 g의 페놀) phenolized 0.85 % NaCl 용액 1 ㎖를 추가한다. 주 : 1 밀리그램의 농도 DT는 / ㎖ 3 ° C ~ 8 ° C에서 약 2 년 동안 저장 될 수있다.
2. 직렬 phenolized 0.85 % NaCl 용액에서 0.3 μg의 / ㎖ DT에 1 ㎎ / ㎖ DT 원액을 희석 작업 솔루션으로 0.3 μg의 / ㎖의 DT 용액의 분취 량을 준비합니다. 참고 :이 작업 솔루션은 새로 제조해야한다.
3. 치사 용량 (~ 50 % 치사)를 사용하여 실험을 수행, 8 주령 생쥐에게 DT의 1.5 μg의 / kg 투여 량을 관리.
   1. 지느러미 드러 누움에 마우스를 잡고 DT의 복강 내 주사를 수행하고 needl를 삽입무릎의 굽힘 아래 전자는 왼쪽이나 정중선의 오른쪽. 방광의 침투를 방지하기 위해 중간 선을 피하십시오. 각도 몸에 바늘이 약 45 °.
   2. 인슐린 주사기를 이용하여 마우스의 체중 20g 당 0.3 μg의 새로 제조 / ㎖의 100 ㎕ DT와 마우스를 주입. 예를 들어, 18 g의 마우스는 0.3 μg의 / ㎖의 DT 솔루션의 9​​0 μl를 받아야합니다.
4. 48 시간 후 DT 주입에서는, 혈관을 팽창하기 위해 약 10 분 동안 37 ℃의 수욕 마우스 꼬리 제한 수단에 마우스를 위치시키고 가온하여 꼬리 정맥으로부터 혈액을 수집한다. 그런 다음, 날카로운 메스 블레이드와 함께 끝에서 꼬리 2cm에 1 mm 닉을하고 마이크로 캐 필러 튜브에 혈액을 수집합니다.
   1. 5 분 1,500 XG에서 혈액을 포함하는 마이크로 캐 필러 튜브를 원심 분리기와 뜨는 및 세포 펠렛을 분리하여 혈청을 수집합니다.
5. 1시 20분 희석 마우스 혈청의 피펫 50 μL GOT / AST- 상PIII는 슬라이드. 제조사의 프로토콜에 따라 다목적 건조 화학 자동 분석기를 사용하여 650 nm에서의 반응 생성물 (청색 색소)의 흡광도를 측정한다.
   참고 : 아스 파르 테이트 아미노 전이 효소 (AST)의 판독은 / 글루타민산 옥 살로 트랜스 아미나 제 (GOT) 활동이 자동으로 표시됩니다. 16,000 IU / L 급성 간 손상을 앓고있는 것으로 간주 하였다 - 이일은 DT가 주입, 쥐의 약 60 % 12,000 사이 AST 값을 나타내 게시합니다. 이러한 마우스는 새로운 케이지 전달 및 세포 이식을 사용 하였다.

인간의 간 줄기 세포의 2. 준비

1. CDCP1 + CD90 + CD66- 아군를 얻을 CDCP1, CD90 및 CD66의 세포 항원을 이용한 셀 소터 인간 일차 태아 간세포에서 인간 간 줄기 세포를 분리 한 다음, 콜라겐 IV 코팅 된 배양 접시에 절연 세포군 시드, 앞서 ^{15 일 보도했다.} 배아의 인간의 기본 태아 간 세포를 사용하여주 14과 18 사이의 나이.
2. 배양액을 흡인 100-mm 배양 접시에 90 % 합류 10 ml의 PBS로 세포를 세척 한 후 PBS를 제거 - 80 % 배양 된 간 줄기 세포를 수집한다. 37 ° C에서 5 분 동안 2 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA 용액으로 세포를 Trypsinize. 주 : 세포 분화 쥐 그들의 증식 능력에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 90 % 이상의 세포가 합류 세포 이식에 적합하지 않다.
3. 현미경 하에서 세포의 분산액의 상태를 모니터한다. 세포가 떠하거나 자유롭게 유동 할 때 나타나는 10 % FBS를 함유하는 DMEM / F12 8 ml를 첨가하여 효소 소화를 멈춘다.
4. 천천히 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 세포를 정지하고, 15 mL의 원뿔형 튜브에 세포를 옮긴다. 100 XG에 5 분, 4 ° C를위한 세포를 원심 분리기.
5. 조심스럽게 10 % FBS를 함유하는 10 ㎖의 DMEM / F12에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 현미경 카운팅 챔버를 이용하여 세포 수를 결정한다.
6. 각 마우스 PBS 씩 50 μL 당 1.0 × 10 ⁶ 세포로 세포를 나누어 이식까지 얼음에 저장합니다.

인간의 간 줄기 세포의 3 Intrasplenic 이식

1. 37 ° C 전기 가열 패드에 깨끗한 케이지를 놓습니다.
2. 노즐 아래에 배치하여 - (분당 산소의 2 L에서 1.5 % (부피 / 부피) 1) 마우스 사용 이소 플루 란 흡입 마취. 또한, 이소 플루 란 적신 거즈를 포함하는 튜브를 사용합니다.
   1. 마우스를 가볍게 뒤쪽 발바닥을 곤란하게하여 마취되어 있는지 확인합니다. 무릎 경련이 유발되는 경우, 다시 실에서 마우스를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
3. 전기 면도기를 사용하여 수술 부위를 면도하고 (부피 / 부피) 에탄올 및 포비돈 요오드 소독 할을 70 %를 적용합니다. 그런 다음 절개에 이어 바로 리브의 늑골 테두리 아래 왼쪽 측면에서 1 cm의 피부 절개를 만들복벽뿐만 아니라 복막.
4. 조심스럽게 비장 노출됩니다. 직접 각 마우스의 비장에 50 ㎕의 PBS에 1.0 × ¹⁰⁶ 인간 간 줄기 세포를 주입하기 위해 32-G / 2 인치 바늘 100 μL 미세 주입 주사기를 사용한다. 주입을위한 5 ° 각도로 바늘을 기울입니다.
   1. 주사의 깊이가 비장의 절반 이하 두께 있는지 확인하십시오. 바늘을 한쪽 끝 (헤드)에서 비장을 입력하고, 다른 단부 (꼬리)의 셀을 증착한다.
5. 주입 따라 셀의 누출을 방지하기 위해, 2 분간 부드럽게 손가락을 이용하여 압력을인가하고 바늘을 제거.
6. 다시 마우스 본체에 비장을 놓고 근육과 피부를위한 정상 주행 봉합와 공동을 닫습니다.
7. 즉시 이식 다음 37 ° C 미리 예열 케이지에 쥐를 전송합니다. 마우스를 보장하기는 편안하게 호흡 케이지에 옆에 마우스를 배치 할 수있다케이지 침구 및 수술 부위 사이의 접촉을 무효화.
8. 마취가 봉합 폐쇄 유지하기 위해 오프 착용하고 마우스 조건 수술 전으로 돌아갈 때까지 마우스를 모니터링합니다.
9. 마우스를 확인하는 것은 정상적인 마시는 물과 음식이 제공됩니다. 1 시간 후, 동물 센터의 마우스 방에 케이지를 반환하고 매일 쥐를 모니터링 할 수 있습니다.

4. 감지 이식 인간의 간 마우스 간에서 세포 유래 간세포 줄기

주 : 다음 절차는 자궁 경부 전위 다음 케타민과 자일 라진의 과다 복용을 사용하여 모든 동물을 안락사.

1. 4시 - 육주, 이식을 게시 쥐를 안락사 동시에 커티스 절단 및 밴드 수술 가위를 사용하여 복강을 엽니 다.
2. , 복막 위의 결합 조직을 해부 확산기로 가위를 사용하고 복막을 열 수있는 원격 교육 알바 함께 복막을 잘라공동.
3. , 집게로 흉골을 들어 올려 다이어프램에 구멍 및 자궁 거들을 통해 흉골의 각면을 잘라.
4. 간 흉부 측의 대정 맥을 절단하고, 앞쪽 방향으로 간을 통해 식도를 당깁니다. 간을 제거하기 위하여 진동판을 제거한다.
   참고 : 위의 팁은 아래의 흉부 장기의 손상을 방지하기 위해 위쪽으로 지적 유지하기 위해주의해야합니다. 흉선은 때때로 흉골의 지느러미 측면에 집착하는 경향이있다이 조심스럽게 피해야한다.
5. 핸들로 진동판을 사용하여, 복강 내에서 간 당기는 시작한다. 내부 대정맥은 장소에 간을 개최합니다. 내부 대정 맥을 잘라; 중간에 오른쪽 부신을 해방 않도록주의하십시오.
   참고 : 마우스가 중간 엽으로 구성된 네 잎 모양 간, 왼쪽 엽, 우엽과 미상 로브 있습니다. 담낭은 작은 분기에 현탁중간 엽.
6. 접합에서 서로의 로브를 분리하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물을 포함. 그라 이오 스탯의 금속 격자의 간 조직을 포함 OCT를 고정.
7. -18 ° C에서 그라 이오 스탯을 사용하여 5 μm의 두께 샘플 부분을 잘라 RT 현미경 슬라이드에 그들을 탑재합니다. -80 ° C에서 주식을 저장합니다. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)과 이전에보고 절차 ^(16)에 따라 면역 형광 염색법에 대한 슬라이드를 준비합니다.

5. 인간 알부민 분비의 탐지 및 키메라 비율​​의 계산

1. 인간 간 재구성을 측정하기 위해, 혈청 및 제조자의 지시에 따라 인간 알부민 ELISA 키트를 사용하여 인간 알부민 ELISA 수행한다.
2. 전체 - 인간화 간에서 실시간으로 발현의 PCR 분석을 인간형 키메라 간 비율을 계산한다. 상대 예를 결정인간의 마우스 크로스 굴지 인간 고유의 굴지의 Pression의 수준 비율 (비율 1) 인간 - 마우스 크로스 굴지에 마우스 특정 굴지의 비율 (비율 2). 키메라 비율​​은 비율이 1 /로 (비율 1 + 비율 2)를 계산한다.

결과

장백의-트렉 / SCID 쥐 간세포는 알부민 프로모터의 조절 하에서 인간 DT 수용체 HB-EGF 유전자를 발현하고 DT 정부 ⁽¹²⁾ 아래의 세포 독성 효과를 나타낸다. 간 손상에 DT 치료의 효과를 평가하기 위해, 1.5 μg의 / kg의 DT의 용량은 8 주령 장백의 - 트렉 / SCID 마우스에 주입하고 간 48 시간 포스트 DT 관리의 병리학 적 변화는 조직 학적으로 평가 하였다. (DT하지 처리) 대조군 ...

토론

최근의 연구는 마우스 간 성인 간세포 증식 및 간 줄기 세포 ^(17)를 포함하여 인간 간세포 증식을 할 수 있음을 보여 주었다. 이 다시 채워 간 약물 대사 시험 및 신약 개발 ¹⁸ 전임상 실험 모델로 사용되고있다; 뿐만 아니라, 그들은 세포 성숙과 분화 ^(19)에 대한 생체 내 환경을 제공하고 있습니다. 본 연구의 주된 목적은 약물 대사 활동의 획득을 위해, 인간 미성숙 간...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human albumin	Sigma	A6684	Mouse
Human CK19	Dako	M088801	Mouse
Human nuclei	Millipore	MAB1281	Mouse
Human CK8/18	Progen	GP11	Guinea pig
CDCP1	Biolegend	324006	Mouse
CD90	BD	559869	Mouse
CD66	BD	551479	Mouse
GOT/AST-PIII	Fujifilm	14A2X10004000009
DMEM/F-12	Gibco	11320-033
FBS	Biowest	S1520
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Diphtheria Toxin	Sigma	D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit	Bethyl Laboratories	E88-129
Syringe (1 ml)	Terumo	SS-01T
32G 1/2" needle	TSK	PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)	Sakura Finetek Japan	4583
MoFlo high-speed cell sorter	Beckman Coulter	B25982
DRI-CHEM 7000	Fujifilm	14B2X10002000046