Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

Resumo

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Resumo

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Introdução

Mice are commonly used for pharmaceutical testing since biomedical research in humans is restricted¹; however, these models are not always useful since they may inaccurately simulate the effects observed in humans. Most drugs in current medical use are metabolized primarily in the liver. However, the same drug can be metabolized into different metabolites in mouse and human livers because of inter-species differences. Thus, it is often difficult to determine during development whether a potential drug poses any risks for clinical applications^2,3.

To address this problem, "humanized" mouse livers have been developed by growing human liver cells inside mice^4-6; these models exhibit drug responses similar to those observed in the human liver. The primary mouse models currently used for humanized liver generation include uroplasminogen activator (uPA+/+) mice^4,7, fumarylacetoacetate hydrolase (Fah−/−) mice⁶, and the recently reported thymidine kinase (TK-NOG) mice.

However, previous reports have shown that transplanted human immature cells or stem cells are less competitive than adult human hepatocytes in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) mouse livers^8-10. Moreover, Fah−/− mice provide a growth advantage only for differentiated hepatocytes and not for immature liver progenitor cells¹¹. The transplantation of human hepatic stem cells (HpSCs) into TK-NOG mice in the lab has been unsuccessful. Hence, no useful mouse model for the efficient engraftment of human immature liver cells currently exists.

Thus, we developed a novel Alb-TRECK/SCID mouse model that could be efficiently repopulated with human immature hepatocytes. This transgenic mouse model expresses human heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptors under the control of a liver cell-specific albumin promoter. Following the administration of diphtheria toxin (DT), these mice develop fulminant hepatitis due to conditional ablation of hepatocytes, enabling donor cell residency and proliferation¹². Although mouse hepatocytes have been successfully transplanted into Alb-TRECK/SCID mice in previous studies^13,14, the generation of a humanized liver using Alb-TRECK/SCID mice has yet to be reported.

In this study, humanized livers were generated in Alb-TRECK/SCID mice via transplantation of HpSCs. This humanized liver provides an in vivo environment for universal stem cell differentiation and the ability to predict human drug metabolism patterns and drug-drug interactions.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados de acordo com as Diretrizes de Proteção aos Animais de Yokohama City University.

1. geração do modelo Hepática Aguda Lesão Rato

1. Adicionar 1 ml de solução de NaCl a 0,85% de fenol (0,6 g de fenol em 100 ml de solução de NaCl a 0,85%) para 1 mg de toxina da difteria (DT) para fazer um / ml de solução stock de 1 mg DT. Nota: DT a uma concentração de 1 mg / ml pode ser armazenado por cerca de 2 anos a 3 ° C e 8 ° C.
2. Serialmente diluir a solução de 1 mg / ml da DT para 0,3 ug / mL em solução de DT fenol a 0,85% de NaCl e preparar-se uma alíquota da solução de DT / ml 0,3 ug como uma solução de trabalho. Nota: Esta solução de trabalho deve ser preparada.
3. Para realizar experiências utilizando uma dose subletal (~ 50% de letalidade), administrar ratinhos de 8 semanas de idade, um / kg de dose de 1,5 ug de DT.
   1. Realizar uma injeção intraperitoneal de DT, mantendo o rato em decúbito dorsal e inserir o needle abaixo da curva dos joelhos, para a esquerda ou direita da linha média. Evitar a linha média para evitar a penetração da bexiga. Ângulo a agulha em aproximadamente 45 ° em relação ao corpo.
   2. Usando uma seringa de insulina, administrada a ratos com 100 uL de recém-preparados 0,3 ug / ml de DT por 20 g de peso do rato. Por exemplo, um 18-g rato deve recebem 90 ul da solução de DT / ml 0,3 ug.
4. A 48 h após a injecção DT, recolha de sangue a partir da veia da cauda, ​​colocando o rato num limitador e o aquecimento da cauda do rato num banho de água a 37 ° C durante aproximadamente 10 min para dilatar os vasos sanguíneos. Em seguida, fazer uma de 1 mm do entalhe em cauda de 2 cm da ponta com um bisturi afiado da lâmina e recolher o sangue com um tubo microcapilar.
   1. Centrifuga-se o tubo microcapilar contendo o sangue a 1500 xg durante 5 minutos e recolher o soro, separando o sobrenadante e pelete de células.
5. Pipeta 50 ul de 01:20 soro de ratinho diluído Onto GOT / AST-PIII desliza. Medir a absorvância do produto de reacção (corante azul) a 650 nm, utilizando um multi-usos analisador automático de química seca de acordo com o protocolo do fabricante.
   NOTA: A leitura de aspartato aminotransferase (AST) / atividade glutâmico transaminase oxalacética (GOT) é exibido automaticamente. 2 dias após a injecção de DT, cerca de 60% dos ratinhos exibiram valores de AST entre 12.000 - 16.000 UI / L e foram consideradas como sofrendo de lesão hepática aguda. Estes ratos foram transferidos para uma gaiola nova e utilizada como receptores de transplante de células.

2. Preparação de células-tronco hepáticas humanas

1. Isolar células estaminais hepáticas humanas a partir de células fetais humanas primárias do fígado, com um classificador de células utilizando os antigénios de células CDCP1, CD90, e CD66 para obter uma subpopulação CDCP1 + CD90 + CD66-, em seguida, propagar a população de células isoladas em placas de cultura de colagénio IV-revestidas, como relatado anteriormente ^15. Use células fetais humanas primárias do fígado de um embriãoidade entre as semanas 14 e 18.
2. Recolher as células estaminais hepáticas humanas cultivadas para 80% - 90% de confluência em placas de cultura de 100 mm, aspirar o meio de cultura, lavar as células com 10 ml de PBS, e em seguida remover o PBS. Tripsinizar as células com solução de tripsina / EDTA a 2 ml de 0,05% durante 5 min a 37 ° C. Nota: As células em mais do que 90% de confluência não são adequados para o transplante de células uma vez que a diferenciação das células pode influenciar a sua capacidade proliferativa em murganhos.
3. Monitorizar o estado de dispersão de células sob um microscópio. Quando as células parecem ser flutuante ou fluindo livremente, parar a digestão enzimática por adição de 8 ml de DMEM / F12 contendo 10% de FBS.
4. Suspender as células lentamente com uma pipeta serológica de 10 ml e transferência das células para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugar as células durante 5 min a 100 xg e 4 ° C.
5. Cuidadosamente ressuspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM / F12 contendo 10% de FBS e determinar o número de células utilizando um microscópio de câmara de contagem.
6. Dividir as células em 1,0 x 10 ⁶ culas por 50 ul de PBS alíquotas para cada ratinho individual e armazenar em gelo até à transplantação.

3. interna do baço transplante de células-tronco hepáticas humanas

1. Coloque uma gaiola limpa em uma temperatura de 37 ° C almofada de aquecimento elétrico.
2. Anestesiar o rato usando isoflurano inalação (1 - 1,5% (vol / vol) em 2 L de oxigénio por minuto), colocando-o por debaixo do bocal. Como alternativa, use tubos contendo gaze embebida com isoflurano.
   1. Certifique-se de que o rato é anestesiado por beliscar levemente na pata traseira. Se um empurrão de joelho é provocada, coloque o mouse de volta na câmara. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
3. Raspar o local da cirurgia usando cortadores elétricos e aplicar 70% (/ vol vol) de etanol e iodopovidona para esterilizar. Em seguida, fazer uma incisão na pele de 1 cm no flanco esquerdo, logo abaixo da borda costal das costelas, seguido por uma incisão naa parede abdominal, bem como o peritoneu.
4. Cuidadosamente expor o baço. Utilize uma seringa microinjecção de 100 ul, com uma agulha de 32 G 1/2-inch de injectar directamente 1,0 x 10 ⁶ células estaminais hepáticas humanas em 50 ul de PBS para o baço de cada rato. Inclinar a agulha com um ângulo de 5 ° para injecção.
   1. Assegure-se que a profundidade de injecção é menos do que metade da espessura do baço. A agulha deve entrar no baço em uma extremidade (cabeça) e depositar as células na outra extremidade (a cauda).
5. Para evitar vazamento das células após a injeção, aplicar suavemente pressão usando um dedo por 2 min e em seguida, remover a agulha.
6. Colocar o baço de volta para dentro do corpo do rato e fechar a cavidade com uma sutura contínua normal para a musculatura e da pele.
7. Transferir os ratos em uma gaiola de 37 ° C pré-aquecido imediatamente após o transplante. Para garantir o mouse é capaz de respirar confortavelmente, coloque o mouse sobre o seu lado na gaiola, umanulando o contacto entre a cama gaiola e no local da cirurgia.
8. Monitorar os ratos até que a anestesia desgasta fora para garantir as suturas permanecem fechados e os ratos regressar às condições-cirurgia pré.
9. Assegurar a ratinhos são fornecidas com água de beber normal e comida. Depois de 1 hora, volte a gaiola para a sala de rato do centro do animal e monitorar os ratos diariamente.

4. Detecção de Transplanted hepática estaminais humanas hepatócitos derivados de células do fígado do rato

Nota: Para os seguintes procedimentos, todos os animais a eutanásia, usando uma overdose de cetamina e xilazina, seguido por deslocação cervical.

1. Aos 4 - 6 semanas após o transplante, eutanásia os ratos e abrir a cavidade abdominal, cortando simultaneamente, a cútis e fáscia usando uma tesoura cirúrgica.
2. Dissecar o tecido conjuntivo acima do peritônio, usando a tesoura como um difusor, e cortar o peritônio ao longo da linha alba para abrir o peritonealcavidade.
3. Levante o esterno com uma pinça, perfurar o diafragma, e cortar cada lado do esterno-se através do cinto de colo do útero.
4. Cortar a veia cava do lado torácica do fígado e puxar o esófago através do fígado na direcção anterior. Remover o diafragma, a fim de remover o fígado.
   Nota: Tenha cuidado para manter as pontas das tesouras apontou para cima, a fim de evitar qualquer dano aos órgãos torácicos embaixo. O timo tem uma tendência a agarrar-se ocasionalmente para o lado dorsal do esterno e isso deve ser evitado com cuidado.
5. Usando o diafragma como uma pega, começam a puxar o fígado para fora da cavidade abdominal. A veia cava interior vai realizar o fígado no lugar. Corte o interior da veia cava; ter cuidado para não libertar prematuramente da adrenal direita.
   Nota: Os ratos têm um fígado de quatro lóbulos consistindo de um lobo médio, lobo esquerdo, lobo direito e do lobo caudado. A vesícula é suspenso na pequena bifurcaçãoo lobo mediano.
6. Separa-se os lóbulos de cada outro nas junções e incorporá-los no composto óptima temperatura de corte (OCT), de acordo com o protocolo do fabricante. Congelar o OCT contendo o tecido do fígado nas grades de metal do criostato.
7. Cortar secções de amostra de 5 um de espessura, utilizando um criostato a -18 ° C e montá-los em lâminas de microscópio RT. Armazenar o estoque a -80 ° C. Preparar as lâminas para hematoxilina e eosina (H & E) e imunofluorescência de acordo com os procedimentos relatados anteriormente ^16.

5. Detecção de albumina humana e Secreção Cálculo da proteína quimérica Classificação

1. Para medir a reconstituição de fígado humano, albumina humana realizar ELISA utilizando soro de albumina e um kit de ELISA humano de acordo com as instruções do fabricante.
2. Calcula-se a taxa de fígado quimérico humanizado por em tempo real A análise de PCR dos níveis de expressão no todo-o fígado humanizado. Determine o ex relativapression rácio nível de actina específicos de humano para cruz actina de ratinho-humano (razão 1) e a razão entre actina específica-rato a cruz actina de ratinho-humano (razão 2). A taxa quimérica é calculado como a relação 1 / (proporção de 1 +, entre 2).

Resultados

Alb-TRECK / hepatócitos ratos SCID expressam o receptor DT gene HB-EGF humano sob o controlo de um promotor de albumina e exibem efeitos citotóxicos após a administração DT ^12. Para avaliar os efeitos do tratamento sobre a lesão hepática DT, DT doses de 1,5 ug / kg foram injectadas em ratinhos SCID de 8 semanas de idade, Alb-TRECK / e as alterações patológicas no administração DT hr pós fígado 48 foram avaliados histologicamente. Em comparação com ratos de cont...

Discussão

Estudos recentes têm mostrado que o fígado do rato podem ser repovoada com hepatócitos humanos, incluindo hepatócitos e células estaminais adultas hepáticas proliferativas ^17. Estes repopulated fígados foram utilizados como modelos experimentais pré-clínicos para drogas de teste do metabolismo e da descoberta e desenvolvimento de medicamentos ^18; Além disso, eles têm proporcionado um ambiente in vivo para a maturação e diferenciação celular ^19. O principal objetiv...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human albumin	Sigma	A6684	Mouse
Human CK19	Dako	M088801	Mouse
Human nuclei	Millipore	MAB1281	Mouse
Human CK8/18	Progen	GP11	Guinea pig
CDCP1	Biolegend	324006	Mouse
CD90	BD	559869	Mouse
CD66	BD	551479	Mouse
GOT/AST-PIII	Fujifilm	14A2X10004000009
DMEM/F-12	Gibco	11320-033
FBS	Biowest	S1520
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Diphtheria Toxin	Sigma	D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit	Bethyl Laboratories	E88-129
Syringe (1 ml)	Terumo	SS-01T
32G 1/2" needle	TSK	PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)	Sakura Finetek Japan	4583
MoFlo high-speed cell sorter	Beckman Coulter	B25982
DRI-CHEM 7000	Fujifilm	14B2X10002000046