Génération d'un humanisée foie de souris Utilisation hépatique humaine Cellules souches

Résumé

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Résumé

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Introduction

Mice are commonly used for pharmaceutical testing since biomedical research in humans is restricted¹; however, these models are not always useful since they may inaccurately simulate the effects observed in humans. Most drugs in current medical use are metabolized primarily in the liver. However, the same drug can be metabolized into different metabolites in mouse and human livers because of inter-species differences. Thus, it is often difficult to determine during development whether a potential drug poses any risks for clinical applications^2,3.

To address this problem, "humanized" mouse livers have been developed by growing human liver cells inside mice^4-6; these models exhibit drug responses similar to those observed in the human liver. The primary mouse models currently used for humanized liver generation include uroplasminogen activator (uPA+/+) mice^4,7, fumarylacetoacetate hydrolase (Fah−/−) mice⁶, and the recently reported thymidine kinase (TK-NOG) mice.

However, previous reports have shown that transplanted human immature cells or stem cells are less competitive than adult human hepatocytes in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) mouse livers^8-10. Moreover, Fah−/− mice provide a growth advantage only for differentiated hepatocytes and not for immature liver progenitor cells¹¹. The transplantation of human hepatic stem cells (HpSCs) into TK-NOG mice in the lab has been unsuccessful. Hence, no useful mouse model for the efficient engraftment of human immature liver cells currently exists.

Thus, we developed a novel Alb-TRECK/SCID mouse model that could be efficiently repopulated with human immature hepatocytes. This transgenic mouse model expresses human heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptors under the control of a liver cell-specific albumin promoter. Following the administration of diphtheria toxin (DT), these mice develop fulminant hepatitis due to conditional ablation of hepatocytes, enabling donor cell residency and proliferation¹². Although mouse hepatocytes have been successfully transplanted into Alb-TRECK/SCID mice in previous studies^13,14, the generation of a humanized liver using Alb-TRECK/SCID mice has yet to be reported.

In this study, humanized livers were generated in Alb-TRECK/SCID mice via transplantation of HpSCs. This humanized liver provides an in vivo environment for universal stem cell differentiation and the ability to predict human drug metabolism patterns and drug-drug interactions.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices de protection des animaux de l'Université de Yokohama City.

1. Génération du modèle hépatique aiguë blessures souris

1. Ajouter 1 ml de solution phéniqué 0,85% NaCl (0,6 g de phénol dans 100 ml d'une solution de NaCl à 0,85%) à 1 mg de la toxine diphtérique (DT) pour faire un / ml DT solution mère 1 mg. Remarque: DT à une concentration de 1 mg / ml peut être stocké pendant environ 2 ans à 3 ° C à 8 ° C.
2. Série diluer la solution 1 mg / ml de bouillon DT à 0,3 pg / ml de DT dans phéniqué une solution de NaCl à 0,85% et de préparer une aliquote de la solution DT / ml 0,3 pg comme solution de travail. Remarque: Cette solution de travail doit être fraîchement préparée.
3. Pour effectuer des expériences en utilisant une dose sublétale (~ 50% de létalité), administrer les souris 8 semaines, âgé d'une dose / kg de 1,5 ug de DT.
   1. Effectuer une injection intrapéritonéale de DT en maintenant la souris en décubitus dorsal et insérez le needle ci-dessous le pli des genoux, à gauche ou à droite de la ligne médiane. Éviter la ligne médiane pour empêcher la pénétration de la vessie. Angle l'aiguille à environ 45 ° par rapport au corps.
   2. À l'aide d'une seringue à insuline, l'injection des souris avec 100 pi de fraîchement préparée de 0,3 pg / ml DT par 20 g de poids de souris. Par exemple, une souris de 18 g doit recevoir 90 ul de la solution DT / ml 0,3 ug.
4. À post-injection de DT de 48 heures, un prélèvement de sang de la veine caudale en plaçant la souris dans un dispositif de retenue et en chauffant la queue de la souris dans un bain d'eau à 37 ° C pendant environ 10 minutes pour dilater les vaisseaux sanguins. Ensuite, faire un 1 mm nick dans la queue 2 cm de la pointe avec une lame de scalpel et de recueillir le sang avec un tube microcapillaire.
   1. Centrifuger le tube microcapillaire contenant le sang à 1500 g pendant 5 min et recueillir le sérum en séparant le surnageant et culot cellulaire.
5. Pipette 50 ul de 01h20 sérum de souris diluée sur GOT / AST-PIII glisse. Mesurer l'absorbance du produit de réaction (colorant bleu) à 650 nm en utilisant un analyseur automatique de chimie sèche multi-usages selon le protocole du fabricant.
   NOTE: La température lue de l'aspartate aminotransférase (AST) / activité transaminase glutamique oxaloacétique (GOT) est affiché automatiquement. 2 jours après l'injection DT, environ 60% des souris présentait des valeurs AST entre 12.000 - 16.000 UI / L et ont été considérés comme souffrant de lésions hépatiques aiguës. Ces souris ont été transférées dans une nouvelle cage et utilisés comme receveurs de greffes de cellules.

2. Préparation des hépatiques humains Cellules souches

1. Isoler les cellules souches hépatiques humaines à partir de cellules hépatiques primaires humaines foetales avec un trieur de cellules en utilisant les antigènes cellulaires CDCP1, CD90 et CD66 pour obtenir une sous-population CDCP1 + CD90 + CD66-, puis ensemencer la population de cellules isolées sur des boîtes de culture de collagène IV-enrobés, comme indiqué précédemment ^15. Utiliser des cellules primaires fœtales hépatiques humains d'un embryonâge entre les semaines 14 et 18.
2. Recueillir les cellules souches hépatiques humaines cultivées à 80% - 90% de confluence sur des boîtes de culture de 100 mm, aspirer le milieu de culture, laver les cellules avec 10 ml de PBS, puis retirez le PBS. Trypsiniser les cellules avec une solution de trypsine / EDTA 2 ml 0,05% pendant 5 min à 37 ° C. Note: Les cellules à plus de 90% de la confluence ne conviennent pas pour une transplantation de cellules depuis la différenciation cellulaire peut influencer leur capacité proliférative chez la souris.
3. Surveiller l'état de dispersion des cellules sous un microscope. Lorsque les cellules semblent flotter librement ou coulant, arrêter la digestion enzymatique par addition de 8 ml de DMEM / F12 contenant 10% de FBS.
4. Les cellules en suspension lentement à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml et transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 100 xg et 4 ° C.
5. remise en suspension avec précaution le culot cellulaire dans 10 ml de DMEM / F12 contenant 10% de FBS et déterminer le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage au microscope.
6. Diviser les cellules dans 1,0 x 10 ⁶ cellules par 50 pi de PBS aliquotes pour chaque souris individuelle et de stocker sur la glace jusqu'à la transplantation.

3. intraspléniques transplantation d'hépatiques humains Cellules souches

1. Placez une cage propre sur un 37 ° C coussin chauffant électrique.
2. Anesthésier la souris à l'aide d'isoflurane inhalation (1 - 1,5% (volume / volume) dans 2 litres d'oxygène par minute) en le plaçant au-dessous de la buse. Vous pouvez également utiliser des tubes contenant de la gaze imbibée d'isoflurane.
   1. Assurez-vous que la souris est anesthésiée par pincement légèrement la patte arrière. Si un réflexe est déclenchée, placez la souris en arrière dans la chambre. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
3. Raser le site chirurgical en utilisant une tondeuse électrique et d'appliquer 70% (volume / volume) d'éthanol et de povidone-iode à stériliser. Ensuite, faire une 1 cm incision cutanée dans le flanc gauche juste au-dessous de la frontière costal des côtes, suivie par une incisionla paroi abdominale, ainsi que le péritoine.
4. exposer soigneusement la rate. Utiliser une seringue de microinjection à 100 ul avec une aiguille 32 G 02/01 pouces pour injecter directement 1,0 x 10 ⁶ cellules souches hépatiques humaines dans 50 ul de PBS dans la rate de chaque souris. Inclinez l'aiguille à un angle de 5 ° pour l'injection.
   1. Faire en sorte que la profondeur d'injection est inférieure à la moitié de l'épaisseur de la rate. L'aiguille doit entrer dans la rate à une extrémité (la tête) et déposer les cellules à l'autre extrémité (la queue).
5. Pour éviter les fuites des cellules après l'injection, appliquer doucement la pression avec un doigt pendant 2 minutes puis retirer l'aiguille.
6. Placez la rate dans le corps de la souris et fermer la cavité avec une suture de fonctionnement normal pour la musculature et de la peau.
7. Transférer les souris dans une cage préchauffé à 37 ° C immédiatement après la transplantation. Pour assurer la souris est capable de respirer confortablement, placez la souris sur le côté dans la cage, unannuler le contact entre le lit de la cage et le site de l'intervention chirurgicale.
8. Surveiller les souris jusqu'à ce que l'anesthésie se dissipe pour assurer les sutures restent fermées et les souris retour à des conditions de chirurgie pré.
9. Veiller à la souris sont fournis avec de l'eau potable normale et de la nourriture. Au bout de 1 h, le retour de la cage dans la chambre de souris du centre de l'animal et de suivre les souris quotidiennement.

4. Détection de transplanté hépatique humaine souches hépatocytes cellulaires dérivées dans le foie de souris

Remarque: Pour les procédures suivantes, euthanasier tous les animaux à l'aide d'une surdose de kétamine et de xylazine suivie par dislocation cervicale.

1. A 4 - 6 semaines après la transplantation, euthanasier les souris et ouvrir la cavité abdominale en coupant simultanément le derme et le fascia en utilisant des ciseaux chirurgicaux.
2. Disséquer le tissu conjonctif au-dessus du péritoine, en utilisant les ciseaux comme un épandeur, et couper le péritoine le long de la ligne blanche pour ouvrir le péritonéalecavité.
3. Soulevez le sternum avec une pince, percer le diaphragme, et couper à travers chaque côté du sternum à travers la ceinture cervicale.
4. Sectionner la veine cave inférieure sur la face dorsale du foie et de tirer l'oesophage par le foie dans la direction antérieure. Retirer le diaphragme afin d'éliminer le foie.
   Remarque: Veillez à garder les pointes des ciseaux étaient à la hausse afin d'éviter tout dommage aux organes thoraciques dessous. Le thymus a une tendance à se cramponner de temps en temps à la face dorsale du sternum et ceci doit être soigneusement évité.
5. Utiliser le diaphragme comme une poignée, commencer à tirer le foie hors de la cavité abdominale. La veine cave intérieure tiendra le foie en place. Couper la veine cave intérieure; veillez à ne pas libérer prématurément le droit surrénale.
   Remarque: Les souris ont un foie à quatre lobes constitué d'un lobe médian, lobe gauche, lobe droit et le lobe caudé. La vésicule biliaire est suspendue dans la petite bifurcationle lobe médian.
6. Séparer les lobes de l'autre au niveau des jonctions et les incorporer dans la température optimale de coupe (OCT) Composé selon le protocole du fabricant. Congeler les PTOM contenant le tissu hépatique dans les grilles métalliques sur le cryostat.
7. Couper des échantillons de sections 5 um d'épaisseur à l'aide d'un cryostat à -18 ° C et les monter sur des lames de microscope RT. Conserver le stock à -80 ° C. Préparer les lames de l' hématoxyline et de l' éosine (H & E) et coloration par immunofluorescence selon des procédés rapportés précédemment ^16.

5. Détection de Human Albumine Sécrétion et calcul du taux chimériques

1. Pour mesurer la reconstitution du foie humain, effectuer l'albumine humaine ELISA en utilisant du sérum et un kit ELISA humain d'albumine selon les instructions du fabricant.
2. Calculer le taux chimérique du foie humanisé par analyse en temps réel PCR des niveaux d'expression dans l'ensemble-humanisé foie. Déterminer l'ex relatifpressure ratio de niveau d'actine humain spécifique à l'humain-souris de croix actine (rapport 1) et le rapport de l'actine de la souris spécifique à l'humain-souris de croix actine (rapport de 2). Le taux chimérique est calculé comme le rapport 1 / (rapport 1 + rapport 2).

Résultats

Alb-Treck / SCID hépatocytes de souris expriment le récepteur DT gène humain HB-EGF sous le contrôle d'un promoteur de l' albumine et présentent des effets cytotoxiques après l' administration de DT ^12. Pour évaluer les effets du traitement DT sur les lésions du foie, des doses DT de 1,5 ug / kg ont été injectées dans des souris SCID 8 semaines vieux Alb-Treck / et les changements pathologiques dans l'h après administration du foie 48 DT ont été h...

Discussion

Des études récentes ont montré que le foie de souris peut être repeuplée avec des hépatocytes humains, y compris les hépatocytes adultes et des cellules souches hépatiques proliferatives ^17. Ces foies repeuplés ont été utilisés comme modèles expérimentaux précliniques pour les tests de métabolisme des médicaments et de la découverte et le développement ¹⁸ médicaments; en outre, ils ont fourni un environnement in vivo pour la maturation et la différenciation cellulaire ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human albumin	Sigma	A6684	Mouse
Human CK19	Dako	M088801	Mouse
Human nuclei	Millipore	MAB1281	Mouse
Human CK8/18	Progen	GP11	Guinea pig
CDCP1	Biolegend	324006	Mouse
CD90	BD	559869	Mouse
CD66	BD	551479	Mouse
GOT/AST-PIII	Fujifilm	14A2X10004000009
DMEM/F-12	Gibco	11320-033
FBS	Biowest	S1520
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Diphtheria Toxin	Sigma	D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit	Bethyl Laboratories	E88-129
Syringe (1 ml)	Terumo	SS-01T
32G 1/2" needle	TSK	PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)	Sakura Finetek Japan	4583
MoFlo high-speed cell sorter	Beckman Coulter	B25982
DRI-CHEM 7000	Fujifilm	14B2X10002000046