ヒト肝幹細胞を用いたヒト化マウス肝臓の生成

要約

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

要約

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

概要

Mice are commonly used for pharmaceutical testing since biomedical research in humans is restricted¹; however, these models are not always useful since they may inaccurately simulate the effects observed in humans. Most drugs in current medical use are metabolized primarily in the liver. However, the same drug can be metabolized into different metabolites in mouse and human livers because of inter-species differences. Thus, it is often difficult to determine during development whether a potential drug poses any risks for clinical applications^2,3.

To address this problem, "humanized" mouse livers have been developed by growing human liver cells inside mice^4-6; these models exhibit drug responses similar to those observed in the human liver. The primary mouse models currently used for humanized liver generation include uroplasminogen activator (uPA+/+) mice^4,7, fumarylacetoacetate hydrolase (Fah−/−) mice⁶, and the recently reported thymidine kinase (TK-NOG) mice.

However, previous reports have shown that transplanted human immature cells or stem cells are less competitive than adult human hepatocytes in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) mouse livers^8-10. Moreover, Fah−/− mice provide a growth advantage only for differentiated hepatocytes and not for immature liver progenitor cells¹¹. The transplantation of human hepatic stem cells (HpSCs) into TK-NOG mice in the lab has been unsuccessful. Hence, no useful mouse model for the efficient engraftment of human immature liver cells currently exists.

Thus, we developed a novel Alb-TRECK/SCID mouse model that could be efficiently repopulated with human immature hepatocytes. This transgenic mouse model expresses human heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptors under the control of a liver cell-specific albumin promoter. Following the administration of diphtheria toxin (DT), these mice develop fulminant hepatitis due to conditional ablation of hepatocytes, enabling donor cell residency and proliferation¹². Although mouse hepatocytes have been successfully transplanted into Alb-TRECK/SCID mice in previous studies^13,14, the generation of a humanized liver using Alb-TRECK/SCID mice has yet to be reported.

In this study, humanized livers were generated in Alb-TRECK/SCID mice via transplantation of HpSCs. This humanized liver provides an in vivo environment for universal stem cell differentiation and the ability to predict human drug metabolism patterns and drug-drug interactions.

プロトコル

全ての動物実験手順は、横浜市立大学の動物保護ガイドラインに従って行いました。

急性肝障害モデルマウスの1世代

1. 1mg / mlのDTストック溶液を作製するために1mgのジフテリア毒素（DT）から（0.85％のNaCl溶液100 mlの0.6グラムフェノール）フェノール化0.85％のNaCl溶液1mlを加えます。注：1ミリグラムの濃度のDT / mlで8℃に3℃で約2年間保存することができます。
2. シリアルフェノール化0.85％NaCl溶液中0.3 / mlのDTに1mg / mlのDTストック溶液を希釈し、作業溶液として0.3 / mlのDT溶液のアリコートを準備します。注：この作業溶液を新たに準備する必要があります。
3. 致死未満量（〜50％の致死率）を使用して実験を行うために、8週齢のマウスにDT1.5μgの/ kgの用量を投与します。
   1. 背側横臥位でマウスを保持することによって、DTの腹腔内注射を行い、needlを挿入膝の曲げ下のeは、左または正中線の右側。膀胱の浸透を防止するために、正中線を避けてください。角度身体への針は約45°です。
   2. インスリン注射器を用いて、マウス体重20gのあたり新たに調製した0.3 / mlのDTを100μlをマウスに注射します。例えば、18-グラムのマウスには、0.3 / mlのDTの溶液を90μLを受けるべきです。
4. 48時間後DT注射で、血管を拡張するために、約10分間37℃の水浴中でマウスの尾の拘束にマウスを置き、温めて尾静脈から血液を収集します。そして、鋭いメスの刃で先端から尾2センチメートルに1ミリニックを行い、マイクロキャピラリーチューブに血液を収集します。
   1. 5分間1500×gで血液を含むマイクロキャピラリーチューブを遠心し、上清および細胞ペレットを分離することにより血清を収集します。
5. GOT / AST-上に1：20希釈したマウス血清のピペットを50μlPIIIはスライドします。製造業者のプロトコルに従って多目的自動乾式化学分析装置を用いて650nmで反応生成物（青色色素）の吸光度を測定します。
   注：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）の読み出しは、/グルタミン酸オキサロトランスアミナーゼ（GOT）活性が自動的に表示されます。 2日は、DTの注射後、マウスの約60％は12,000の間でAST値を示した - 16,000 IU / Lと急性肝障害を患っていると考えられました。これらのマウスは、新しいケージに移し、細胞移植のレシピエントとして使用しました。

ヒト肝幹細胞の調製

1. CDCP1 + CD90 + CD66-の亜集団を得ることがCDCP1、CD90、およびCD66細胞抗原を使用して、セルソーターでヒト初代胎児肝細胞からのヒト肝幹細胞を分離し、その後、コラーゲンIVでコーティングした培養皿上で単離された細胞集団をシード、以前に^15を報告^しました 。胚性のヒト初代胎児肝細胞を使用してください週14と18の間の年齢。
2. 、100 mmの培養皿上で90％コンフルエンス培地を吸引、10mlのPBSで細胞を洗浄し、その後PBSを削除 - 80％まで培養したヒト肝幹細胞を収集します。 37℃で5分間2mlの0.05％トリプシン/ EDTA溶液で細胞をトリプシン処理。注：細胞分化マウスにおけるそれらの増殖能に影響を与えることができるので、90％以上のコンフルエンスの細胞を、細胞移植に適していません。
3. 顕微鏡下で細胞分散の状態を監視します。細胞が浮遊または自由に流れるように見える場合には、10％FBSを含むDMEM / F12を8mlを添加することにより酵素消化を停止します。
4. ゆっくりと10-mlの血清学的ピペットを用いて細胞を懸濁し、15 mLコニカルチューブに細胞を移します。 100×gで5分間、4℃のための細胞を遠心します。
5. 慎重に10％FBSを含む10 mlのDMEM / F12中で細胞ペレットを再懸濁し、顕微鏡計数チャンバーを用いて細胞数を決定します。
6. 各個々のマウスのためのPBSのアリコート50μlのあたり1.0×10 ⁶細胞に細胞を分割し、移植まで氷上で保存します。

ヒト肝幹細胞の3脾臓内移植

1. 37°C電気加熱パッドの上にきれいなケージを置きます。
2. ノズルの下に置くことによって - （分当たりの酸素の2 Lで1.5％（体積/体積）1）イソフルラン吸入を用いてマウスを麻酔。また、イソフルランに浸したガーゼを含むチューブを使用します。
   1. マウスは軽くリアフットパッドをつまんで麻酔されていることを確認してください。膝ジャークが誘発されている場合は、バックチャンバー内にマウスを置きます。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
3. 電気バリカンを使用して手術部位を剃るし、滅菌するために70％（体積/体積）エタノール及びポビドンヨードを適用します。その後、切開に続いてちょうど肋骨の肋骨境界線下の左脇腹に1 cmの皮膚切開を作ります腹壁、ならびに腹膜。
4. 慎重に脾臓を露出させます。直接各マウスの脾臓に50μlのPBS中に1.0×10 ^6個のヒト肝幹細胞を注入するために32-G、1/2インチの針で100μlのマイクロインジェクションのシリンジを使用してください。注射のための5°の角度で針を傾けます。
   1. 注入の深さは脾臓の半分以下の厚さであることを確認してください。針は、一方の端部（ヘッド）で脾臓を入力し、もう一方の端（テール）で細胞を付着させる必要があります。
5. 注射後の細胞の漏れを防止するために、穏やかに2分間の指を使って圧力を適用し、針を取り除きます。
6. バックマウス本体に脾臓を置き、筋肉組織や皮膚のための通常走行縫合糸で空洞を閉じます。
7. すぐに移植後37℃で予熱したケージにマウスを転送します。マウスを確保するために、快適に息をケージにその側にマウスを配置することができ、ケージ寝具、手術の部位との間の接触が無効になります。
8. 麻酔は、縫合糸は閉じたままとマウスは、手術前の状態に戻り確実にするために切れるまでマウスを監視します。
9. マウスを確認し、通常の飲料水と食料が設けられています。 1時間後、動物中央のマウスの部屋にケージを返し、毎日マウスを監視します。

移植されたヒト肝4.検出は、マウス肝臓における細胞由来肝細胞を幹

注：以下の手順については、頸椎脱臼が続くケタミンとキシラジンの過剰摂取を使用して、すべての動物を安楽死させます。

1. 4時 - 6週間、移植後、マウスを安楽死させると同時に、手術用はさみを使用して真皮と筋膜を切断して腹腔を開きます。
2. スプレッダーとしてハサミを使用して、腹膜上記の結合組織を解剖し、腹膜を開くには、白線に沿って腹膜をカット空洞。
3. 鉗子で胸骨を持ち上げ、横隔膜に穴を開け、最大子宮頸ガードルを介して胸骨の両側を切断。
4. 肝臓の胸部側の大静脈を切断し、前方方向に肝臓を通って食道を引っ張ります。肝臓を除去するために、振動板を取り外します。
   注：はさみのヒントを出さないように注意してください下に胸部臓器の損傷を防止するために、上向きに指摘しました。胸腺は時折胸骨の背側にしがみつく傾向があり、これは慎重に避けなければなりません。
5. ハンドルとしてダイヤフラムを使用して、腹腔から肝臓を引っ張って開始します。インテリア大静脈は、所定の位置に肝臓を開催します。インテリア大静脈をカット。途中で右副腎を解放しないように注意してください。
   注：マウスは中葉、左葉、右葉、および尾状​​葉からなる4ローブ肝臓を持っています。胆嚢はの小さな分岐に懸濁されます中葉。
6. 接合部で互いにローブを分離し、製造業者のプロトコルに応じて最適な切削温度（OCT）化合物でそれらを埋め込みます。クライオスタット上の金属グリッドでの肝臓組織を含む10月をフリーズします。
7. -18℃でクライオスタットを用いて5μmの厚さのサンプルのセクションをカットし、RT顕微鏡スライド上にマウントします。 -80℃での在庫を保管してください。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）と以前に報告された手順¹⁶に従って、免疫蛍光染色のためのスライドを準備します。

5.ヒトアルブミンの分泌の検出とキメラ率の計算

1. ヒト肝臓の再構成を測定するために、製造業者の指示に従って血清およびヒトアルブミンELISAキットを用いてヒトアルブミンELISAを行います。
2. 全ヒト肝臓における発現レベルのリアルタイムPCR分析によりヒト肝キメラ率を計算します。相対元を決定しますヒト - マウスクロスアクチンに対するヒト特異的アクチンのPRESSIONレベル比（比1）、ヒト - マウスクロスアクチンに対するマウス特異的アクチンの比率（比率2）。キメラ率は、比1 /ように（比1 +比2）で算出されます。

結果

ALB-トレック/ SCIDマウスの肝細胞は、アルブミンプロモーターの制御下で、ヒトDT受容体HB-EGF遺伝子を発現し、DT投与¹²以下の細胞毒性効果を発揮します。肝障害に対するDT処置の効果を評価するために、1.5μgの/キロのDT投与量は、8週齢のアルプ・トレック/ SCIDマウスに注射し、肝臓48時間後のDT投与の病理学的変化を組織学的に評価しました。 （いないDTで処?...

ディスカッション

最近の研究は、マウスの肝臓は、成人肝細胞および増殖性肝幹細胞^17を含むヒト肝細胞で再増殖することができることを示しています。これらの再増殖した肝臓は薬物代謝試験および薬物の発見と開発¹⁸のための前臨床実験モデルとして使用されています。加えて、それらは、細胞成熟および分化¹⁹のためのインビボ環境を提供しています。本研究の主要な目的?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human albumin	Sigma	A6684	Mouse
Human CK19	Dako	M088801	Mouse
Human nuclei	Millipore	MAB1281	Mouse
Human CK8/18	Progen	GP11	Guinea pig
CDCP1	Biolegend	324006	Mouse
CD90	BD	559869	Mouse
CD66	BD	551479	Mouse
GOT/AST-PIII	Fujifilm	14A2X10004000009
DMEM/F-12	Gibco	11320-033
FBS	Biowest	S1520
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Diphtheria Toxin	Sigma	D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit	Bethyl Laboratories	E88-129
Syringe (1 ml)	Terumo	SS-01T
32G 1/2" needle	TSK	PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)	Sakura Finetek Japan	4583
MoFlo high-speed cell sorter	Beckman Coulter	B25982
DRI-CHEM 7000	Fujifilm	14B2X10002000046