Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

Zusammenfassung

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Zusammenfassung

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Einleitung

Mice are commonly used for pharmaceutical testing since biomedical research in humans is restricted¹; however, these models are not always useful since they may inaccurately simulate the effects observed in humans. Most drugs in current medical use are metabolized primarily in the liver. However, the same drug can be metabolized into different metabolites in mouse and human livers because of inter-species differences. Thus, it is often difficult to determine during development whether a potential drug poses any risks for clinical applications^2,3.

To address this problem, "humanized" mouse livers have been developed by growing human liver cells inside mice^4-6; these models exhibit drug responses similar to those observed in the human liver. The primary mouse models currently used for humanized liver generation include uroplasminogen activator (uPA+/+) mice^4,7, fumarylacetoacetate hydrolase (Fah−/−) mice⁶, and the recently reported thymidine kinase (TK-NOG) mice.

However, previous reports have shown that transplanted human immature cells or stem cells are less competitive than adult human hepatocytes in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) mouse livers^8-10. Moreover, Fah−/− mice provide a growth advantage only for differentiated hepatocytes and not for immature liver progenitor cells¹¹. The transplantation of human hepatic stem cells (HpSCs) into TK-NOG mice in the lab has been unsuccessful. Hence, no useful mouse model for the efficient engraftment of human immature liver cells currently exists.

Thus, we developed a novel Alb-TRECK/SCID mouse model that could be efficiently repopulated with human immature hepatocytes. This transgenic mouse model expresses human heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptors under the control of a liver cell-specific albumin promoter. Following the administration of diphtheria toxin (DT), these mice develop fulminant hepatitis due to conditional ablation of hepatocytes, enabling donor cell residency and proliferation¹². Although mouse hepatocytes have been successfully transplanted into Alb-TRECK/SCID mice in previous studies^13,14, the generation of a humanized liver using Alb-TRECK/SCID mice has yet to be reported.

In this study, humanized livers were generated in Alb-TRECK/SCID mice via transplantation of HpSCs. This humanized liver provides an in vivo environment for universal stem cell differentiation and the ability to predict human drug metabolism patterns and drug-drug interactions.

Protokoll

Alle Tierversuchsverfahren wurden nach den Tierschutzrichtlinien von Yokohama City University durchgeführt.

1. Erzeugung des akuten Leberschädigung Mausmodell

1. 1 ml phenolisiert 0,85% NaCl-Lösung (0,6 g Phenol in 100 ml 0,85% NaCl-Lösung) auf 1 mg Diphtherietoxin (DT), um eine 1 mg / ml Stammlösung DT zu machen. Anmerkung: DT in einer Konzentration von 1 mg / ml für etwa 2 Jahre bei 3 ° C bis 8 ° C gelagert werden.
2. Seriell verdünnt das 1 mg / ml Stammlösung DT bis 0,3 & mgr; g / ml in DT phenolisiert 0,85% NaCl-Lösung und ein Aliquot der 0,3 ug / ml DT Lösung als Arbeitslösung herzustellen. Hinweis: Diese Arbeitslösung sollte frisch zubereitet werden.
3. Zur Durchführung der Versuche einer subletalen Dosis verwendet (~ 50% Letalität), verabreichen 8 Wochen alte Mäuse eine 1,5 & mgr; g / kg Dosis von DT.
   1. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von DT mit der Maus in Rückenlage halten und legen Sie die needle unterhalb der Biegung der Knie, links oder rechts von der Mittellinie. Vermeiden, dass die Mittellinie Eindringen der Blase zu verhindern. Winkel der Nadel bei etwa 45 ° an den Körper.
   2. Verwendung einer Insulinspritze, injizieren die Mäuse mit 100 ul frisch hergestellten 0,3 & mgr; g / ml DT pro 20 g Mausgewicht. Beispielsweise ein 18-g Maus sollte 90 & mgr; l der 0,3 & mgr; g / ml DT-Lösung erhalten.
4. Bei 48 Stunden nach der DT-Injektion, sammeln Blut aus der Schwanzvene mit der Maus in einem Verzögerer platzieren und Erwärmung der Maus Schwanz in einem 37 ° C Wasserbad für ca. 10 min, die Blutgefäße zu erweitern. Dann machen Sie einen 1-mm-nick in den Schwanz 2 cm von der Spitze mit einem scharfen Skalpell und sammeln das Blut mit einem Mikrokapillarröhre.
   1. Zentrifugieren Sie die Mikrokapillarröhre das Blut bei 1.500 × g für 5 min enthält, und sammeln das Serum durch den Überstand und Zellpellet zu trennen.
5. Pipettieren von 50 & mgr; l von 1:20 verdünnt Mausserum auf GOT / AST-PIII gleitet. Messen der Extinktion des Reaktionsprodukts (blauer Farbstoff) bei 650 nm eine Mehrzweck automatische Trockenchemie-Analysesystem unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers.
   HINWEIS: Das Auslesen von Aspartat-Aminotransferase (AST) / Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) -Aktivität wird automatisch angezeigt. 2 Tage Post DT, bei ungefähr 60% der Mäuse AST-Werte zwischen 12.000 ausgestellt - 16.000 IE / l und wurden als von einer akuten Leberschäden zu leiden. Diese Mäuse wurden in einen neuen Käfig übertragen und als Zelltransplantat-Empfängern verwendet.

2. Herstellung von menschlichen Leberstammzellen

1. Isolieren der menschlichen Leber Stammzellen aus menschlichen primären fötalen Leberzellen mit einem Zellsortierer mit den CDCP1, CD90 und CD66 Zell-Antigene eine CDCP1 + CD90 + CD66- Subpopulation zu erhalten, dann Samen der isolierten Zellpopulation auf Kollagen IV-beschichteten Kulturschalen, wie zuvor berichtet ^15. Verwenden menschliche primäre fetale Leberzellen eines embryonalenAlter zwischen 14 und 18 Wochen.
2. Sammeln der menschlichen Leber Stammzellen kultiviert auf 80% - 90% Konfluenz auf 100-mm-Kulturschalen, die das Kulturmedium anzusaugen, wasche die Zellen mit 10 ml PBS und anschließend die PBS zu entfernen. Trypsinize die Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C. Anmerkung: Die Zellen mit mehr als 90% Konfluenz für die Zelltransplantation nicht geeignet sind, da die Zelldifferenzierung ihre Proliferationsfähigkeit bei Mäusen beeinflussen.
3. Überwachen Sie den Status der Zelldispersion unter einem Mikroskop. Wenn die Zellen frei zu schweben oder fließenden erscheinen, durch Hinzufügen von 8 ml DMEM / F12, enthaltend 10% FBS, die enzymatische Verdauung zu stoppen.
4. Suspend die Zellen langsam eine 10-ml serologische Pipette und übertragen Sie die Zellen in einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 100 xg und 4 ° C.
5. resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 10 ml DMEM / F12 10% FBS enthält, und zu bestimmen, die Zellzahlen ein Mikroskop Zählkammer verwenden.
6. Teilen Sie die Zellen in 1,0 x 10 ⁶ Zellen pro 50 ul PBS Aliquots für jede einzelne Maus und speichern auf Eis bis zur Transplantation.

3. intralienale Transplantation von menschlichen Leberstammzellen

1. Einen sauberen Käfig auf einem 37 ° C elektrische Heizkissen.
2. Anästhesieren der Maus Isofluran Inhalation (1 - 1,5% (vol / vol) in 2 l Sauerstoff pro min), indem sie unterhalb des Düsen platzieren. Alternativ können Sie Rohre Gaze mit Isofluran getränkt enthält.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Maus leicht betäubt durch den hinteren Fußballen Kneifen. Wenn ein Kniereflex ausgelöst wird, legen Sie die Maus wieder in der Kammer. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
3. Rasur die Operationsstelle mit elektrischen Haarschneidemaschine und wenden 70% (vol / vol) Ethanol und Povidon-Iod zu sterilisieren. Dann machen Sie eine 1-cm Hautschnitt in der linken Flanke knapp unterhalb der Costal Grenze der Rippen, durch einen Einschnitt folgte aufdie Bauchdecke sowie das Peritoneum.
4. aussetzen vorsichtig die Milz. Verwenden eine 100-ul Mikroinjektionsspritze mit einer 32-G 1/2-Zoll - Nadel zu injizieren direkt 1,0 x 10 ⁶ menschliche Leberstammzellen in 50 & mgr; l PBS in die Milz jeder Maus. Kippen Sie die Nadel in einem Winkel von 5 ° zur Injektion.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Tiefe der Injektion ist weniger als die Hälfte der Dicke der Milz. Die Nadel sollte die Milz an einem Ende (der Kopf) und deponieren die Zellen am anderen Ende (der Schwanz) eingeben.
5. Um ein Auslaufen der Zellen verhindern Injektion folgende, leicht anzuwenden Druck einen Finger für 2 min und anschließend die Nadel entfernen.
6. Legen Sie die Milz wieder in die Maus Körper und schließen Sie den Hohlraum mit einer normalen Lauf Naht für die Muskulatur und die Haut.
7. Übertragen Sie die Mäuse in eine 37 ° C vorgewärmten Käfig unmittelbar nach der Transplantation. Um die Maus sorgen in der Lage, bequem zu atmen, legen Sie die Maus auf die Seite in den Käfig einMiktion Kontakt zwischen dem Käfig Betten und der Operationsstelle.
8. Überwachen Sie die Mäuse, bis die Betäubung die Nähte zu gewährleisten nachlässt bleiben geschlossen und die Mäuse wieder in Vorchirurgischer Bedingungen.
9. Sicherstellen, dass die Mäuse mit normalem Trinkwasser und Lebensmittel zur Verfügung gestellt. Nach 1 Stunde, bringen Sie den Käfig an der Maus Raum des Tieres Zentrum und die Mäuse täglich überwachen.

4. Nachweis von transplantierten menschlichen Leber-Zellen abgeleiteten Hepatozyten in der Mausleber Stem

Hinweis: Für die folgenden Verfahren, einschläfern alle Tiere eine Überdosis von Ketamin und Xylazin durch Genickbruch gefolgt werden.

1. Bei 4 - 6 Wochen nach der Transplantation, einschläfern die Mäuse und öffnen Sie die Bauchhöhle, indem Sie gleichzeitig die Kutis Schneiden und Faszien mit chirurgische Scheren.
2. Präparieren Sie das Bindegewebe über dem Peritoneum, mit der Schere als Spreizer, und schneiden Sie das Peritoneum entlang der linea alba die Peritonealdialyse zu öffnenHohlraum.
3. Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette, die Membran durchstechen, und schneiden Sie durch jede Seite des Brustbeins nach oben durch den Gebärmutterhals-Gürtel.
4. Sever die Hohlvene auf der Brustseite der Leber und ziehen Sie die Speiseröhre durch die Leber in der vorderen Richtung. Entfernen Sie die Membran, um die Leber zu entfernen.
   Hinweis: Achten Sie darauf, die Spitzen der Schere zu halten nach oben gerichtet, um unter eine Beschädigung der Brustorgane zu verhindern. Der Thymus hat eine Tendenz, gelegentlich an der dorsalen Seite des Sternums klammern und diese sorgfältig vermieden werden müssen.
5. Verwendung der Membran als Griff, beginnen die Leber aus der Bauchhöhle herausziehen. Das Innere Hohlvene wird die Leber an Ort und Stelle zu halten. Schneiden Sie das Innere Hohlvene; nicht vorzeitig zu befreien, die rechte Neben vorsichtig sein.
   Hinweis: Die Mäuse haben ein vier-lappigen Leber, bestehend aus einem Mittellappen, linken Lappen, rechten Lappen und den Lobus caudatus. Die Gallenblase ist in der kleinen Gabelung suspendiertendie Mittellappen.
6. Trennen Sie die Lappen voneinander an den Übergängen und betten sie in optimale Schnitttemperatur (OAT) Verbindung nach dem Protokoll des Herstellers. Frieren Sie das OAT das Lebergewebe in den Metallgittern auf dem Kryostaten enthält.
7. Schneiden Sie 5 um dicke Probenabschnitte einen Kryostat bei -18 ° C unter Verwendung und montieren sie auf RT Mikroskop-Objektträger. Lagern Sie die Lager bei -80 ° C. Bereiten Sie die Folien für Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Immunfluoreszenzanfärbung nach zuvor berichteten Verfahren ^16.

5. Nachweis von Humanalbumin-Sekretion und Berechnung der Rate Chimäre

1. Menschliche Leber Rekonstitution messen, führen Humanalbumin ELISA unter Verwendung von Serum und einer menschlichen Albumin-ELISA-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Berechnen Sie die humanisierte Leber chimären Rate von real-time PCR-Analyse der Expressionsniveaus in der gesamten-humanisiert Leber. Zur Ermittlung der relativen expression Pegelverhältnis von human-spezifischen Aktin zu Mensch-Maus Quer Aktin (Verhältnis 1) und das Verhältnis von Maus-spezifischen Aktin an Mensch-Maus Quer Aktin (Verhältnis 2). Die chimären Rate wird als Verhältnis 1 / (Verhältnis 1 + Verhältnis 2) berechnet.

Ergebnisse

Alb-TRECK / SCID - Mäuse - Hepatozyten exprimieren das menschliche DT Rezeptor HB-EGF - Gen unter der Kontrolle eines Albumin - Promotor und nach Verabreichung DT ¹² cytotoxische Effekte aufweisen. Um die Auswirkungen der DT-Behandlung auf eine Leberschädigung, DT-Dosen von 1,5 & mgr; g / kg zu bewerten, wurden in injizierten 8 Wochen alte Alb-TRECK / SCID-Mäuse und die pathologischen Veränderungen in der Leber 48 h nach Verabreichung DT wurden histologisch untersucht....

Diskussion

Jüngste Studien haben gezeigt , dass die Maus Leber kann mit humanen Hepatozyten neu besiedelt werden, einschließlich Erwachsenen Hepatozyten und proliferative hepatische Stammzellen ^17. Diese repopulated Lebern wurden als präklinische Versuchsmodelle für Arzneimittelmetabolismus Test und Arzneimittelentdeckung und -entwicklung ¹⁸ verwendet wird ; Darüber hinaus haben sie eine in vivo Umgebung für die Zellreifung und Differenzierung ¹⁹ versehen. Das Hauptziel der vorliegen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human albumin	Sigma	A6684	Mouse
Human CK19	Dako	M088801	Mouse
Human nuclei	Millipore	MAB1281	Mouse
Human CK8/18	Progen	GP11	Guinea pig
CDCP1	Biolegend	324006	Mouse
CD90	BD	559869	Mouse
CD66	BD	551479	Mouse
GOT/AST-PIII	Fujifilm	14A2X10004000009
DMEM/F-12	Gibco	11320-033
FBS	Biowest	S1520
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Diphtheria Toxin	Sigma	D0564-1MG
Human Albumin ELISA Kit	Bethyl Laboratories	E88-129
Syringe (1 ml)	Terumo	SS-01T
32G 1/2" needle	TSK	PRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)	Sakura Finetek Japan	4583
MoFlo high-speed cell sorter	Beckman Coulter	B25982
DRI-CHEM 7000	Fujifilm	14B2X10002000046