Preparación de colonias individuales-cohortes y tratamiento con hormona del trabajador abejas para analizar la fisiología asociada con clases, y / o Sistema Endocrino

Resumen

Aquí describimos nuestro protocolo detallado para la preparación de las colonias de abejas de un solo cohortes - una herramienta útil para analizar la fisiología trabajador función asociada. También describimos los protocolos detallados para el tratamiento de los trabajadores con la hormona juvenil y ecdisona para evaluar la participación de estas hormonas en la regulación del comportamiento de los trabajadores y / o fisiología.

Resumen

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Introducción

La abeja europea, Apis mellifera, es un insecto eusocial con una sociedad altamente organizada ^1. Abejas obreras (casta de trabajo) se dedican a diversas tareas para mantener la actividad de la colonia, y estas tareas cambian de acuerdo a la edad de la abeja obrera después de la eclosión, que se conoce como la división relacionada con la edad del trabajo ^2-4. Los trabajadores jóvenes (<13 días de edad) cuidar de la cría de la colmena mediante la secreción de jalea real (abejas nodrizas), mientras que los trabajadores de más edad (> 15 días de edad) recogen el néctar y el polen exterior de la colmena (recolectores) ^2-4. La fisiología de los trabajadores cambia en asociación con este cambio de función. Por ejemplo, la función de las glándulas hipofaringe (HPGs), emparejado glándulas exocrinas ubicadas en la cabeza, cambios en asociación con el cambio de rol de enfermería para forrajeo ^2,5. HPGs enfermera abeja sintetizan principalmente proteínas principales de la jalea real, que son los principales componentes de la leche de abeja. Por otro lado, para cosechadoras de forraje, principalmente HPGssintetizar enzimas metabolizadoras de hidratos de carbono, tales como α-glucosidasa III, para procesar néctar en miel mediante la conversión de la sacarosa en glucosa y fructosa. Nuestros estudios previos revelaron que la expresión de mrjp2, que codifica una proteína principal de la jalea real y Hbg3, que codifica α-glucosidasa III, los cambios durante el turno de papel ^6-9.

Para determinar si los cambios fisiológicos en los tejidos de los trabajadores, incluyendo los HPGs, se asocia con el cambio de papel o con la edad de los trabajadores, que sería útil para manipular la composición de la población de una colonia de abejas, como para preparar un solo cohorte colonias en las que los trabajadores de casi la misma edad realizan tareas diferentes ^10,11. Robinson et al. (1989) describe un método para establecer una colonia de una sola cohorte ^10. colonias de una sola cohorte comprenden inicialmente una reina y trabajadores de 0-2 días de edad. Varios días después de establecer las colonias, los trabajadores de almost la misma edad asumir diferentes tareas. Algunos trabajadores realizan tareas de enfermería como en las colonias típicas, mientras que otros trabajadores realizan tareas de búsqueda de alimento antes de lo habitual y por lo tanto son llamados recolectores precoces. Comparaciones de expresión génica entre las abejas nodrizas y recolectores precoces proporcionarían información útil acerca de la fisiología de rol asociado de tejidos trabajador ^12-16. A continuación, describimos un protocolo detallado para la preparación de las colonias de una sola cohorte para el análisis de la fisiología de roles y / o asociado a la edad de ¹⁶ HPGs. También describimos brevemente cómo examinar la expresión de genes de mrjp2 y Hbg3 por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR) para evaluar la fisiología HPG.

Además del análisis de la fisiología de los trabajadores en colonias de una sola cohorte, el examen del sistema endocrino es importante para el análisis de los mecanismos de regulación de la fisiología trabajador función asociada. hormona juvenil (JH), que se KNOwn como la hormona del "status quo" en larvas de insectos, acelera el cambio en el papel de la enfermería a la búsqueda de alimento en las abejas obreras ^11. Además, ecdisona, que se conoce como la hormona de la muda durante la metamorfosis, podría estar implicada en el cambio de papel como genes que codifican las moléculas de señalización de ecdisona se expresan en los órganos de hongos, un centro superior del cerebro trabajador ^17-19. Por lo tanto, también se describe el protocolo detallado utilizado en nuestro estudio anterior ¹⁶ para tratar a los trabajadores con 20E, que es una forma activa de la ecdisona, y metopreno, un análogo de JH, para el análisis del efecto del sistema endocrino en HPG fisiología (expresión de mrjp2 y Hbg3).

Protocolo

1. Preparación de colonias individuales-cohorte

1. Preparar tres colonias de abejas para crear dos colonias de una sola cohorte y para la obtención de un número suficiente de trabajadores recién emergidas.
   1. Compruebe que algunas pupas en las células periféricas nevadas en los panales tienen ojos marrones y una cutícula pigmentada con la apertura de los peines cubrieron usando unas pinzas. Si existen estas pupas en las células periféricas de peine, la mayoría de las pupas en el conjunto de peines surgirá en aproximadamente 1-3 días.
   2. Posteriormente, recoger los panales que contienen estos pupas después de que todas las abejas adultas adherentes se han eliminado con un cepillo, y mezclar los peines de las tres colonias para minimizar la variabilidad entre las colonias.
2. Coloque los panales recogidos en una caja colmena vacía y se incuba a 33 ° C en condiciones de humedad (> 60% de humedad relativa). Recoge aproximadamente 6.000 trabajadores recién surgido a lo largo de 3 días (3.000 trabajadores por colonia) de los panales recogidos.
3. Determinar la cantidad de workers basado en el peso de cinco trabajadores recién emergidas recogieron al azar de colonias no manipulados.
   1. Pesar cinco trabajadores recién emergidas recogidos al azar de colonias no manipulados utilizando máquinas de pesar.
      Nota: El peso de cinco trabajadores recién emergidas es generalmente 500-600 mg.
   2. Estimar la cantidad de trabajadores recogidos dividiendo el peso de los trabajadores recogidos por el peso promedio de cinco trabajadores recién emergidas.
4. Aplicar marcas de pintura a las Thoraces de aproximadamente 1.800 trabajadores (900 trabajadores por colonia) usando marcadores de la pintura del cartel a base de agua.
   Nota: marcador lavable que se utiliza para aplicar la pintura está en la lista en la Tabla de Materiales.
5. Introducir una reina y aproximadamente 3.000 de los antiguos trabajadores 0-2 día para un nuevo cuadro de colmena que contiene dos peines, un panal de miel y polen como conservas y otro peine vacío para la puesta de huevos por la reina. Recoger el panal con la miel y el polen from otra colonia no manipulado después de que todas las abejas adherentes se eliminan.
   Nota: Se recomienda el uso de la caja de la colmena nuclear (cuadro de colmena de tamaño pequeño).
6. Recoger las abejas nodrizas y recolectores precoces con marcas de pintura de 6 a 8 días después de la creación de colonias de una sola cohorte.
   1. Para recoger las abejas nodrizas, recoger a los trabajadores que ponen sus cabezas en las células de peine para cuidar de la prole. Use pinzas para recoger las abejas nodrizas de los panales que contienen muchos trabajadores de cría y adultos.
      Nota: Si se desarrollan HPGs de los trabajadores recogidos cuando diseccionado como se describe en el paso 1.7, estos trabajadores se definen como las abejas nodrizas. La celebración de los Thoraces por pinzas se recomienda para recoger a los trabajadores de los panales.
   2. Para recoger las recolectoras, utilice una red de insectos para capturar los trabajadores que regresan a sus colmenas con cargas de polen en sus patas traseras.
      Nota: Si HPGs de los trabajadores capturados aparece encogida cuando diseccionado como se describe en el paso 1.7, esos trabajadores se definen como recolectores.
7. clasSIFY el HPG en tres grupos, "desarrollado", "intermedio", y "encogido" por la disección bajo un microscopio estereoscópico.
   1. 10-15 anestesiar a las abejas en una jaula de insectos en un refrigerador durante 10-15 minutos hasta que las abejas no pueden volar o caminar. A continuación, mueva abejas sobre hielo y completar la anestesia en hielo durante 5 min.
      Nota: Se tarda aproximadamente total de 15-20 minutos para conseguir una anestesia. Si necesita el tiempo de anestesia que se acorte, el número de abejas en una jaula debe reducirse a 1-3 abejas por jaula.
   2. Diseccionar la cabeza del cuerpo con unas tijeras y pinzas. Fijar la cabeza en cera dental colocado en una placa de Petri con alfileres. Inserte dos pernos en las bases de las antenas para fijar la cabeza. Remojar cabezas fijas en solución salina de insectos (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, 1 mM CaCl _2).
   3. Retire la cara anterior de la cutícula de la cabeza con unas pinzas finas y un cuchillo quirúrgico bajo un microscopio binocular.
      Nota: Los HPGs se pueden encontrar fácilmente en la cabeza después de la eliminación de cuticle. El HPG es un órgano botrioide que existe alrededor del cerebro en la cabeza.
   4. Eliminar el tejido traqueal que es un tejido membranoso blanco debajo de la cutícula. A continuación, diseccionar los HPGs de la cabeza por ellos tirando lentamente con unas pinzas.
   5. Clasificar a HPGs con acinos grande y circular, como "desarrollados". Clasificar a HPGs con acinos pequeña y distorsionada como 'encogido'. Clasificar HPGs que corresponde a ninguno "desarrollados" ni "encogido 'como' Intermedio '.
      Nota: las fotografías representativas que muestran estas tres clases de estados HPG se indican en la Figura 2.
   6. Asunto "desarrollados" y HPGs 'encogidos' a la extracción de RNA como 'abejas HPGs enfermera "y" HPGs cosechadoras de forraje', respectivamente, y comparar la expresión génica en las HPGs entre las abejas nodrizas y recolectores (sección 4).

2. Inyección de 20E

1. Recoger las abejas nodrizas de colonias típicas como described en el procedimiento 1.6.1.
   Nota: HPGs no pueden ser examinadas en estas abejas que se crían las abejas.
2. Anestesiar a las abejas a 4 ° C en un refrigerador (no en el hielo).
   Nota: Se tarda unos 30 minutos para conseguir una anestesia. Si el tiempo de anestesia se acorta, el número de abejas en la jaula debe ser reducido a 1-3 abejas por jaula.
3. Con unas pinzas, inmovilizar las abejas en moldes dentales colocados en una placa de Petri.
4. Se inyecta 1 l de solución de 20E en el aspecto anterior de la cabeza utilizando una punta de inyección a partir de una micropipeta capilar calibrado utilizando un extractor de aguja de vidrio.
   1. Disolver 20E en solución salina etanol-insecto (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, 1 mM CaCl ₂₎ mezcla (1: 4) a 2,5 g / l.
   2. Conectar la punta de inyección para un tubo de goma, y ​​conectar una punta de la micropipeta amarilla para el lado opuesto del tubo.
   3. Colocar 1 l de solución de 20E en parafina utilizando una micropipeta, sostenga la punta de la micropipeta amarilla en la boca, unad dibujar la solución en la punta de inyección.
   4. Inserte la punta de la inyección en la base de las antenas, e inyectar la solución soplando a través de la punta de la micropipeta amarilla.
      Nota: El protocolo se muestra en este paso es el método de inyección representativo, pero se recomienda el uso de la máquina de inyección automatizado para la seguridad como sea necesario ^20.
5. Posterior a las abejas inyectados en jaulas de insectos a 33-36 ° C (la temperatura ideal es de 35 ° C) en condiciones oscuras y húmedas (> 60% de humedad relativa) durante 1 ó 3 días. De suministro de mezcla de miel y agua (1: 1) a las abejas. Si es necesario, contar sobrevivir a las abejas después de la inyección.

3. Aplicación de Metopropeno

1. Recoger los panales que contienen pupas de las colonias típicas después de que todas las abejas adultas adherentes se eliminan con un cepillo. Incubar los peines a 33-36 ° C (la temperatura ideal es de 35 ° C) en condiciones de humedad (> 60% de humedad relativa) durante un máximo de 1 día.
2. Recopilar abejas recién nacidas de los panales recogidos y aplicar marcas de pintura a sus Thoraces utilizando pintura de carteles como se describe en el protocolo para la preparación de las colonias de una sola cohorte. Devolver las abejas marcadas a sus colonias.
3. Después de 6 días, recoger los trabajadores pintadas (de 6 días de edad) de las colonias. Recoge los trabajadores pintadas de los panales mediante la celebración de sus Thoraces con pinzas.
4. Anestesiar a las abejas a 4 ° C en un refrigerador (no en el hielo) como en el procedimiento 2.2. Con unas pinzas, inmovilizar las abejas en moldes dentales colocados en una placa de Petri y aplicar 1-5 l de solución de metopreno (50-250 mg / l) disuelto en acetona a la cabeza utilizando una micropipeta. Utilice una punta de filtro que es resistente a la acetona.
   Nota: La acetona puede tener el efecto nocivo para las abejas que llevan a la muerte. Si se observa la alta mortalidad de las abejas, se recomienda la reducción del volumen de acetona a 1 l como mínimo.
5. Posterior a las abejas en las jaulas de insectos a 33-36 ° C (la t idealesemperatura es de 35 ° C) durante 7 días en condiciones oscuras y húmedas (> 60% de humedad relativa). De suministro de mezcla de miel y agua (1: 1) a las abejas. Si es necesario, contar sobrevivir a las abejas después de la aplicación tópica.
   Nota: En este artículo, las abejas que sobreviven se cuentan 7 días después de la aplicación (Tabla 3).

4. Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa

1. Anestesiar a las abejas y diseccionar HPGs como se describe en los pasos 1.7.1 a 1.7.4.
2. Recoge los HPGs disecados en un tubo de microcentrífuga en hielo seco y almacenar a -80 ° C hasta su uso.
3. Añadir 400 l de reactivo para la desnaturalización de la proteína.
   Nota: Este reactivo está disponible en el mercado (véase la Tabla de Materiales).
4. Homogeneizar los tejidos HPG utilizando una batidora eléctrica de mano con una mano de mortero homogeneización que cabe dentro de un tubo de microcentrífuga. Homogeneizar a una velocidad de rotación de aproximadamente 300 rpm durante 1 min en hielo para romper y lisar las células del tejido.
   Nota: La batidora eléctrica de mano está disponible en el mercado (véase la Tabla de Materiales).
5. Añadir 80 l de cloroformo y mezclar bien. Incubar durante 5 min a TA.
6. Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 14.170 xg durante 15 min a 4 ° C. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo. Añadir un volumen igual de isopropanol y 1 l de glucógeno (5 mg / ml). Se incuba a -20 ° C durante al menos 20 min.
7. Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 14.170 xg durante 10 min a 4 ° C y separar el sobrenadante.
8. Añadir 400 l de etanol al 75% al ​​sedimento y mezclar bien, centrifugar los tubos de microcentrífuga a 14.170 xg durante 15 min a 4 ° C, y se elimina el sobrenadante. Repita este procedimiento una vez más.
9. El aire seco de la pastilla durante 5-10 minutos y luego se disuelven en 10 l de agua libre de RNasa.
   Nota: el secado completo de la pastilla puede causar la insolubilización del pellet de ARN en agua. Por lo tanto, el sedimento que es ligeramente húmedo es apropiado parade disolución.
10. Medir la concentración de ARN usando un espectrofotómetro tal como NanoDrop o similar.
11. Tratar 500 ng de ARN total con 2,0 U de DNasa I por incubación a 37 ° C durante 30 min para degradar cualquier ADN genómico contaminante.
12. Reverse-transcribir 200 ng de ARN tratado con DNasa I y realizar PCR en tiempo real utilizando kits disponibles comercialmente (véase la lista en la Tabla de Materiales y Reactivos) y cebadores específicos del gen (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'y 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'y 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Realice la PCR como sigue: [95 ° C x 30 seg + (95 ° C x 5 seg + 60 ° C x 15 seg + 72 ° C x 20 seg) x 45-55 ciclos].
13. Normalizar la cantidad de transcripción con la del factor de elongación 1α-F2 (EF1α˗F2) o la proteína ribosomal 49 (rp49) ^9,16,21,22. Estos genes son el control fiable genes para el análisis de la expresión génica en las HPGs utilizando QRT-PCR.
14. Realizar dos colas t-test para detectar las diferencias significativas entre los dos grupos experimentales (las abejas nodrizas vs. recolectores precoces, abejas 20E tratados vs abejas de control, y las abejas metopreno tratados vs abejas control) utilizando el software estadístico.
    Nota: Si F-prueba supone la homogeneidad de la varianza, prueba t de Student se puede utilizar. Si no, la prueba t de Welch se puede utilizar.

Resultados

Una visión general del protocolo para la preparación de las colonias de una sola cohorte se ilustra en la Figura 1A. El curso temporal de los experimentos de la preparación de las colonias de una sola cohorte para la recogida de muestras se muestra en la Figura 1B. Los trabajadores que cumplieron con los criterios de comportamiento para el comportamiento de enfermería o el comportamiento de alimentación se obtuvieron de colonias de una sola cohorte,...

Discusión

Preparación de colonias de una sola cohorte

Aquí describimos el protocolo utilizado en nuestro estudio anterior ¹⁶ para preparar colonias de una sola cohorte para el análisis de HPG fisiología asociada con el cambio en el papel de las abejas obreras. Se observaron las abejas nodrizas y recolectores precoces que cumplieran los criterios descritos en los procedimientos de 1.6-1.7 y Figura 2 en las colonias de una sola cohorte (Tabla 1). Las foto...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
UNIPOSCA	Mitsubishi pencil	PC-5M	Marker pen for the application of marks to bees
20-hydroxyecdysone	Sigma Aldrich	H5142
Methoprene	Sigma Aldrich	33375
Breeding case insect	IRIS OHYAMA	CP-SS
Electromotion mixier	ISO	23M-R25	homogenization of tissue
TRIZol Reagent	Invitrogen	15596-026	the reagent for total RNA extraction
DNase I	Takara	2270A
PrimeScript RT reagent kit	Takara	RR037A	the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II	Takara	RR820A	the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument	Roche	12011468001	the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl)	Roche	4929292001	the material for real-time PCR