단일 코호트 식민지와 노동자 꿀벌의 호르몬 치료의 준비 역할 및 / 또는 내분비 시스템과 생리학 관련 분석하기

요약

여기에서 우리는 단일 코호트 꿀벌 식민지의 제조를위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명 - 롤 관련 근로자의 생리를 분석하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 또한 작업자의 행동 및 / 또는 생리 조절에 이러한 호르몬의 참여를 평가하기 위해 청소년 호르몬과 에크 디손과 근로자를 치료하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

서문

유럽 ​​꿀벌, API를 mellifera이는 고도로 조직 된 사회 ^(1)와 eusocial 곤충이다. 작업자 꿀벌 (노동 계급) 식민지 활동을 유지하기 위해 다양한 작업에 종사하고 있으며, 이러한 작업은 노동 ^2-4의 연령과 관련된 부문이라고 우화 후 작업자 꿀벌의 연령에 따라 변경합니다. 젊은 노동자 (<십삼일 세) 고령 근로자는 동안, 로얄 제리 (간호사 꿀벌)을 분비하여 하이브에 무리를 돌봐 (> 15 일)는 하이브 (초지) ^2-4 이외의 꿀과 꽃가루를 수집합니다. 노동자의 생리는이 역할 변화와 관련하여 변경합니다. 예를 들어, 하인두암 샘 (HPGs)의 기능은 ^2,5를 구하고으로 간호의 역할 변화와 관련 외분비 머리에있는 땀샘, 변화를 쌍. 간호사 꿀벌 HPGs는 주로 꿀벌 우유의 주요 구성 요소 주요 로얄 젤리 단백질을 합성. 한편, 주로 사일리지의 HPGs포도당과 과당 수크로오스로 변환하여 허니에 꿀을 처리하기 위해, 예컨대 α 글루코 III 탄수화물 대사 효소를 합성한다. 우리의 이전 연구는 밝혀 그 역할 변화 ^6-9시 α - 글루코시다 III, 변경 내용을 암호화하는 주요 로얄 젤리 단백질 및 Hbg3를 인코딩 mrjp2의 표현.

HPGs 포함 작업자 조직에서 생리적 변화는, 롤 시프트 또는 작업자의 나이와 관련되어 있는지 여부를 확인하기 위해, 단일 집단을 조제 같은 꿀벌 콜로니 인구 조성물을 조작하는 것이 유용 할 것이다 식민지는 거의 같은 나이의 노동자들은 다른 작업 ^{10, 11을 수행합니다.} 로빈슨 등의 알. (1989)는 단일 콜로니 ^{10 코호트를} 구축하는 방법을 설명했다. 단일 코호트 식민지 초기에 여왕과 0~2일 된 근로자를 포함한다. 며칠 식민지를 설정 한 후, ALM의 노동자같은 나이 OST 다른 작업을 가정합니다. 다른 근로자가 평소보다 일찍 꼴 작업을 수행함으로써 조숙 한 초지라고하는 반면 일부 노동자들은 전형적인 식민지로 간호 작업을 수행합니다. 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지 사이의 유전자 발현 비교는 노동자 조직 ^12-16의 역할 관련된 생리에 대한 유용한 정보를 제공 할 것이다. 여기, 우리는 HPGs ^(16)의 역할 - 및 / 또는 연령 관련 생리학의 분석을 위해 단일 코호트 식민지를 준비하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 또한 간단히 HPG 생리학을 평가하기 위해 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 mrjp2 및 Hbg3의 유전자 발현을 확인하는 방법을 설명한다.

단일 코호트 식민지에서 노동자 생리학의 분석뿐만 아니라, 내분비 시스템의 검사 역할 관련 작업자 생리의 규제 메커니즘을 분석하는 것이 중요하다. 알것입니다 청소년 호르몬 (JH)곤충 애벌레의 '현 상태'호르몬과 같은 WN, 작업자 꿀벌 ¹¹ 꼴에 간호의 역할에 변화를 가속화합니다. 또한, 변형하는 동안 털갈이 호르몬으로 알려져있다 에크 디손은, 버섯 몸에 작업자 뇌 ^17-19의 높은 중심을 표현 에크 디손 신호 분자를 코딩하는 유전자와 같은 역할 변화에 관여 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 또한 HPG 생리학의 내분비 시스템의 효과 분석 (의 발현에 대한 자세한 에크 디손의 활성 형태 20E 근로자를 치료하기 위해 우리의 이전 연구 ^(16)에 사용되는 프로토콜 및 methoprene하는 JH 아날로그를 설명 mrjp2 및 Hbg3).

프로토콜

단일 코호트 식민지 1. 준비

1. 세 꿀벌 식민지 두 개의 단일 코호트 식민지를 만들려면 새로 등장 노동자의 충분한 수를 얻기 위해를 준비합니다.
   1. 콤에 덮인 주변 세포의 일부 번데기는 갈색 눈과 핀셋을 사용하여 출장 빗를 열어 착색 된 표피가 있는지 확인합니다. 이 번데기 주변 콤 세포에 존재하는 경우, 전체의 빗 번데기 대부분 약 1~3일을에 등장 할 것이다.
   2. 그 후, 모든 부착 성인 꿀벌이 브러시로 제거 된 후 이러한 번데기가 포함 된 빗를 수집하고 식민지 사이의 변동성을 최소화하기 위해 세 개의 식민지에서 빗 섞는다.
2. 빈 하이브 상자에 수집 된 빗를 놓고 습한 조건에서 33 ° C (> 60 % 상대 습도)에 품어. 수집 된 빗에서 삼일 (식민지 3,000 근로자)을 통해 약 6,000 새롭게 등장 근로자를 수집합니다.
3. worke의의 양을 결정오 새롭게 등장 노동자의 중량을 기준으로 R은 임의로 조작되지 식민지에서 수집.
   1. 무작위로 저울을 사용하여 조작되지 식민지에서 수집 한 다섯 새롭게 등장 노동자의 무게를.
      참고 : 다섯 새롭게 등장 근로자의 무게는 일반적으로 500-600 밀리그램이다.
   2. 오 새롭게 등장 근로자의 평균 무게에 의해 수집 된 노동자의 무게를 나누어 수집 된 노동자의 양을 추정한다.
4. 수성 포스터 페인트 마커를 사용하여 약 1,800 근로자 (식민지 당 900 노동자)의 흉곽에 페인트 자국을 적용합니다.
   참고 : 빨 마커 페인트를 적용하는 데 사용되는 재료의 표에 나열되어 있습니다.
5. 두 빗, 한 빗 포함 꿀, 보존 식품 등의 꽃가루와 알을 낳는 여왕에 의해 또 다른 빈 빗 포함 된 새 하이브 상자에 여왕 약 3,000 0-2일 된 근로자를 소개합니다. 꿀과 꽃가루 FR이 포함 된 빗를 수집톰 모든 부착 꿀벌 후 다른 조작되지 식민지가 제거됩니다.
   참고 : 핵 하이브 상자 (소형 하이브 상자)의 사용을 권장합니다.
6. 단일 코호트 식민지를 만든 후 6 ~ 8 일 페인트 마크 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지를 수집합니다.
   1. , 간호사 꿀벌 수집 한 무리 돌봐 빗 세포에 머리를 넣어 노동자를 선택합니다. 많은 무리와 성인 근로자를 포함 빗에서 간호사 꿀벌을 수집 핀셋을 사용합니다.
      참고 : 단계 1.7에 설명 된대로 해부 할 때 수집 된 근로자의 HPGs이 개발하는 경우, 이러한 노동자들은 간호사 꿀벌로 정의됩니다. 핀셋으로 흉곽을 잡고하는 콤 근로자를 선택하는 것이 좋습니다.
   2. 초지를 수집하려면, 자신의 뒷다리에 꽃가루 부하 자신의 두드러기로 돌아 근로자를 캡처하는 곤충 그물을 사용합니다.
      참고 : 단계 1.7에 설명 된대로 해부 할 때 캡처 노동자의 HPGs이 수축 나타날 경우 해당 근로자는 초지로 정의됩니다.
7. CLAS세 그룹, '개발', '중간'으로 HPG를 sify하고, 실체 현미경 아래에서 절개하여 '말라 비틀어 진'.
   1. 꿀벌 비행 또는 걸을 수있을 때까지 10 ~ 15 분 동안 냉장고에 곤충 케이지에서 10 ~ 15 벌을 마취. 그런 다음 얼음에 꿀벌을 이동하고 5 분 동안 얼음에 마취를 완료합니다.
      참고 : 마취를 달성하기 위해 총 15 ~ 20 분 정도 걸립니다. 마취 시간을 단축 할 필요가있을 때에는 케이지 벌 수 케이지 당 1-3 꿀벌로 감소되어야한다.
   2. 가위와 핀셋으로 몸에서 머리를 해부하다. 핀 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 머리를 고정합니다. 머리를 해결하기 위해 안테나의 기지에 두 개의 핀을 삽입합니다. 곤충 생리 식염수 (130 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 _2)에 고정 된 머리를 만끽 해보세요.
   3. 쌍안 현미경 미세 핀셋을 사용하여 머리와 수술 용 칼의 표피의 앞쪽 부분을 제거합니다.
      주 : HPGs 용이 C 제거한 후 헤드에 있습니다uticle. HPG는 머리에 뇌의 주위에 존재하는 botryoid 기관이다.
   4. 표피 아래에 흰 막질 조직되는 기관 조직을 제거합니다. 그런 다음 천천히 족집게로 당겨 머리에서 HPGs을 해부하다.
   5. '개발'과 같은 대형 원형 꽈리와 HPGs를 분류. '말라 비틀어 진'작은 왜곡 꽈리와 HPGs를 분류. HPGs이 '중간'으로도 '개발'이나 '말라 비틀어 진'에 해당하는 분류.
      참고 : HPG 상태의 세 가지 클래스가 그림 2에 표시되어 보여 대표 사진.
   6. 주제 '개발'과 같은 RNA 추출에 '말라 비틀어 진'HPGs 각각과 간호사 꿀벌과 초지 (4 절) 사이의 HPGs에서 유전자 발현을 비교하는 '간호사 꿀벌 HPGs'와 '사일리지 콤바인 HPGs'.

20E 2. 주입

1. DESCR 전형적인 식민지에서 간호사 꿀벌 수집절차 1.6.1에서 ibed.
   참고 : 꿀벌을 사육하는 바와 같이 HPGs이 꿀벌에 검사 할 수 없습니다.
2. 냉장고 (안 얼음)에서 4 ° C에서 꿀벌을 마취.
   참고 : 마취를 달성하기 위해 약 30 분 소요됩니다. 마취 시간이 단축되는 경우, 케이지 벌 수 케이지 당 1-3 꿀벌로 감소되어야한다.
3. 핀셋을 사용하여 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 꿀벌을 고정.
4. 유리 바늘 풀러를 사용하여 보정 된 모세관 마이크로 피펫으로부터 이루어지는 분사구를 사용하여 헤드의 전방 측면에 20E 액 1 μl를 주입한다.
   1. 에탄올 곤충 식염수 (130 mM의 염화나트륨, 5 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 ₂₎ 혼합물 (20E)를 용해 (1 : 4) 2.5 μg의에서 / μL.
   2. 고무 튜브에 분사구를 연결 관의 양측에 옐로우 마이크로 피펫 팁을 연결한다.
   3. 은 마이크로 피펫을 사용하여 파라 필름에 20E 솔루션 1 μl를 놓고 입에 노란색 마이크로 피펫 팁을 개최분사구로 용액을 그리 거라고.
   4. 안테나의 기본에 주입 팁을 삽입하고 노란색 마이크로 피펫 팁을 통해 불어 솔루션을 주입.
      주 :이 단계에 도시 된 프로토콜은 대표적인 주입 방법이지만, 자동 주입 장치의 사용이 ²⁰ 필요한 안전 권장된다.
5. 후면은 1 ~ 3 일 동안 어둡고 습한 조건 (> 60 % 상대 습도)에서 33 ~ 36 ℃에서 곤충 케이지에 주입 된 꿀벌 (이상적인 온도는 35 ° C)입니다. 공급 꿀 - 물 혼합물 (1 : 1) 꿀벌에. 필요한 경우, 주사 후 꿀벌 생존 계산합니다.

Methoprene 3. 응용 프로그램

1. 모든 부착 성인 꿀벌이 브러시로 제거 후 전형적인 식민지에서 번데기가 포함 된 빗를 수집합니다. 33 ~ 36 ℃에서 콤을 품어 일일 최대를위한 다습 한 조건에서 (> 60 % 상대 습도) (이상적인 온도는 35 ° C)입니다.
수집 된 빗에서 새로 등장 꿀벌 수집 및 단일 코호트 식민지를 준비하기위한 프로토콜에 설명 된 포스터 페인트를 사용하여 흉곽에 페인트 자국을 적용합니다. 그들의 식민지로 표시 꿀벌을 돌려줍니다.
2. 육일 후, 식민지에서 (6 일 이전) 그린 근로자를 수집합니다. 핀셋으로 자신의 흉곽을 잡고 빗에서 그린 근로자를 선택합니다.
3. 절차 2.2에서와 같이 (안 얼음) 냉장고에 4 ° C에서 꿀벌을 마취. 핀셋을 사용하여 페트리 접시에 배치 치과 왁스에 꿀벌을 고정 및 마이크로 피펫을 사용하여 머리에 아세톤에 용해 methoprene 용액 (50-250 μg의 / μL)의 1-5 μl를 적용합니다. 아세톤에 내성 필터 팁을 사용합니다.
   참고 : 아세톤 죽음에 이르는 꿀벌에 유해한 영향을 미칠 수 있습니다. 꿀벌의 높은 사망률이 관찰되는 경우, 최소 1 μL로 아세톤의 양의 감소가 권장된다.
4. 후면 33 ~ 36 °의 C (이상적인 t에서 곤충 케이지에서 꿀벌럼 온은 어둡고 습한 조건에서 7 일간 35 ° C) (> 60 % 상대 습도)입니다. 공급 꿀 - 물 혼합물 (1 : 1) 꿀벌에. 필요한 경우, 국소 적용 후 꿀벌 생존 계산합니다.
   참고 :이 기사에서는 생존 꿀벌 7 일 응용 프로그램 (표 3) 후 계산됩니다.

4. RNA 추출 및 정량적 RT-PCR

1. 꿀벌 마취 및 1.7.4에 단계 1.7.1에 설명 된대로 HPGs을 해부하다.
2. 사용할 때까지 -80 ° C에서 드라이 아이스와 저장소에 microcentrifuge 관에서 해부 HPGs를 수집합니다.
3. 단백질 변성을위한 시약 400 μl를 추가합니다.
   참고 :이 시약 (재료의 표 참조) 상업적으로 사용할 수 있습니다.
4. 미세 원심 관 내부에 맞는 균질화 유봉과 전기 믹서 핸드 헬드를 사용하여 HPG 조직을 균질화. 끊는 얼음를 Lyse 조직 세포에 1 분 동안 약 300 rpm의 회전 속도로 균질화시킨다.
   참고 : 휴대용 전기 믹서가 시판되고 (재료의 표 참조).
5. 80 μl의 클로로포름을 넣고 잘 섞는다. RT에서 5 분 동안 인큐베이션.
6. 4 ℃에서 15 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기. 새로운 튜브로 수성 단계를 전송합니다. 이소프로판올 1 μL 글리코겐 (5 ㎎ / ㎖)의 동일한 볼륨을 추가합니다. 적어도 20 분 동안 -20 ℃에서 인큐베이션.
7. 4 ° C에서 10 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
8. 펠렛에 75 % 에탄올 400 μl를 추가하고 잘 혼합, 4 ° C에서 15 분 동안 14,170 XG에서의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리하고, 상층 액을 제거합니다. 한 번 더이 절차를 반복합니다.
9. 5-10 분 동안 펠렛을 공기 - 건조 후, 10 μL의 RNase가없는 물에 녹인다.
   참고 : 펠렛의 완전 건조가 물에 RNA 펠렛의 불용 화의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 약간 젖은 펠렛은 적합용해.
10. NanoDrop 또는 유사한 같은 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정한다.
11. 어떤 오염 게놈 DNA를 분해하기 위해 30 분 동안 37 ℃에서 배양에서의 DNase I의 2.0 U와 총 RNA의 500 NG를 취급합니다.
12. 역 전사의 DNase I 처리 RNA 200 NG 및 시판되는 키트를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 유전자 특이 적 프라이머 (mrjp2 (재료 및 시약의 테이블의 목록 참조) 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 '와 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). 다음과 같이 PCR을 수행 : 95 ° C X 30 초 + (95 ° C × 5 초 + 60 ° C X 15 초 + 72 ° C × 20 ​​초) 45 ~ 55주기를 X].
13. 신장 인자 1α-F2 (EF1α˗F2) 또는 리보솜 단백질 49 (rp49) ^{9,16,21,22의와} 성적 증명서의 양을 정상화. 이 유전자는 신뢰할 수있는 제어 g입니다QRT-PCR을 사용하여 HPGs 유전자 발현을 분석 ENES.
14. 통계 소프트웨어를 사용하여 두 실험 그룹 (간호사 꿀벌 대 조숙 기계, 제어 꿀벌 대 20E 처리 꿀벌 및 제어 꿀벌 대 methoprene 처리 꿀벌) 사이에 유의 한 차이를 감지하는 두 개의 꼬리 t 테스트를 수행합니다.
    주 : F-테스트 분산의 균일 성을 가정하면, 스튜던트 t 검정을 사용할 수있다. 그렇지 않으면 웰치 t 테스트가 사용될 수있다.

결과

단일 콜로니 코호트 제조 프로토콜의 개요는도 1a에 도시되어있다. 컬렉션 샘플 단일 코호트 식민지를 준비에서 실험의 시간 코스는 그림 1B에 표시됩니다. 간호 행동이나 구하고 행동에 대한 행동 기준을 만족 근로자는 단일 코호트 식민지에서 수집하고, HPG의 개발은 이러한 노동자 추정 표 1은 세 그룹으로 HPG 개발의 분류를 보여줍?...

토론

단일 코호트 식민지의 제조

여기에서 우리는 일벌의 역할의 변화와 관련된 HPG 생리학의 분석을 위해 단일 코호트 식민지를 준비하는 우리의 이전 연구 ^(16)에서 사용되는 프로토콜을 설명했다. 절차 1.6-1.7 및 그림 2에 설명 된 기준을 만족 간호사 꿀벌과 조숙 한 초지는 단일 코호트 식민지 (표 1)에서 관찰되었다. HPG의 분류 기준으로 미국에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
UNIPOSCA	Mitsubishi pencil	PC-5M	Marker pen for the application of marks to bees
20-hydroxyecdysone	Sigma Aldrich	H5142
Methoprene	Sigma Aldrich	33375
Breeding case insect	IRIS OHYAMA	CP-SS
Electromotion mixier	ISO	23M-R25	homogenization of tissue
TRIZol Reagent	Invitrogen	15596-026	the reagent for total RNA extraction
DNase I	Takara	2270A
PrimeScript RT reagent kit	Takara	RR037A	the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II	Takara	RR820A	the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument	Roche	12011468001	the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl)	Roche	4929292001	the material for real-time PCR