Tek kohort Kolonileri ve İşçi arıların Hormon Tedavisi hazırlanması Rolü ve / veya Endokrin Sistemi Fizyolojisi İlişkili Analiz

Özet

Burada tek kohort bal arısı kolonilerinin hazırlanması için detaylı protokol açıklar - rol ilişkili işçi fizyolojisi analiz etmek için kullanışlı bir araç. Biz de işçi davranışı ve / veya fizyoloji düzenlenmesinde bu hormonların katılımını değerlendirmek jüvenil hormon ve ekdisonla işçileri tedavisi için ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Özet

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Giriş

Avrupa bal arısı, Apis mellifera, son derece örgütlü bir toplumda ¹ ile eusocial böcek olduğunu. İşçi bal arıları (emek kast) koloni etkinliğini sürdürmek için çeşitli görevler yapan ve bu görevleri emek ^2-4 yaşa bağlı bölümü olarak adlandırılır eclosion sonra işçi bal arısı yaşına göre değişir. Genç işçiler (<13 gün) yaşlı işçiler ise, arı sütü (hemşire arılar) salgılayarak kovandaki yavru özen (> 15 gün) kovanı (silaj) ^2-4 dışındaki nektar ve polen toplamak. İşçilerin fizyolojisi bu rol kayması ile birlikte değişir. Örneğin, hipofaringeal bezleri (HPGler) işlevi, ^2,5 kazarak için hemşirelik rol kayması ile birlikte egzokrin kafasında bulunan bezleri, değişiklikleri eşleştirilmiş. Hemşire arı HPGler ağırlıklı arı sütünün en önemli bileşenleri olan büyük arı sütü proteinleri sentezler. Öte yandan, toplayıcı HPGler ağırlıklıglukoz ve fruktoz halinde sakaroz dönüştürerek bal içine nektar işlemek için, bu tür α-glukosidaz III olarak karbonhidrat metabolize edici enzimleri, sentez. Daha önceki çalışmalar ortaya koydu rolü kayması ^6-9 içinde α-glukozidaz III değişiklikleri kodlayan önemli bir arı sütü protein ve Hbg3 kodlayan mrjp2 ekspresyonu.

HPGler dahil işçi dokularda fizyolojik değişiklikler, rol kayması veya işçilerin yaş ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için, tek kohort hazırlamak için gibi, bir arı kolonisinin nüfusu kompozisyonunu işlemek için yararlı olacaktır koloniler hangi neredeyse aynı yaştaki işçiler farklı görevleri ^10,11 gerçekleştirin. Robinson ve ark. (1989), tek bir kohort koloni ¹⁰ oluşturulması için bir yöntem açıklamıştır. Tek kohort koloniler başlangıçta bir kraliçe ve 0-2 gün eski işçileri kapsar. Birkaç gün koloniler kurduktan sonra, alm işçileriAynı yaşta ost farklı görevler üstlenecek. Diğer işçiler her zamankinden daha erken toplayıcı görevleri gerçekleştirmek ve böylece erken silaj denir oysa Bazı işçiler, tipik koloniler olarak hemşirelik görevleri gerçekleştirmek. Hemşire arılar ve erken toplayıcılar arasındaki gen ifadesi karşılaştırmaları işçi dokuların ^12-16 rolü ile ilişkili fizyolojisi hakkında yararlı bilgiler sağlayacaktır. Burada, HPGler ¹⁶ rol ve / veya yaşa bağlı fizyoloji analizi için tek bir kohort koloniler hazırlamak için detaylı bir protokol açıklar. Ayrıca kısa bir süre HPG fizyolojisi değerlendirmek için niceliksel ters kopyalama-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile mrjp2 ve Hbg3 gen ekspresyonunu incelemek için açıklanmıştır.

Tek kohort kolonilerinde işçi fizyolojisi analizine ek olarak, endokrin sistemin incelenmesi rol ilişkili işçi fizyolojisi düzenleyici mekanizmaların analiz etmek için önemlidir. kullanımları bilinmektedir Jüvenil hormon (JH),Böcek larvaları 'statükonun' hormon gibi wn, işçi bal arılarının ¹¹ kazarak için hemşirelik rolü kayması hızlandırır. Ayrıca, metamorfoz sırasında tüy dökümü hormonu olarak bilinen ekdison, mantar organları işçi beynin ^17-19 daha yüksek bir merkezi ifade edilir ekdison sinyal molekülleri kodlayan genlerin olarak rol kayması dahil olabilir. Bu nedenle, biz de HPG fizyolojisi üzerindeki endokrin sistemin etkisinin analizi (ifadesi için ayrıntılı ekdisonla aktif formudur 20E işçileri tedavi önceki çalışmamızda ¹⁶ kullanılan protokol, ve methopiren, bir JH analog tanımlamak mrjp2 ve Hbg3).

Protokol

Tek kohort Kolonileri 1. Hazırlık

1. Üç balarısı kolonilerinin iki tek-kohort koloniler oluşturmak ve yeni ortaya çıkan işçilerin yeterli sayıda elde etmek için hazırlayın.
   1. peteklerde şapkalı periferik hücrelerde bazı pupa kahverengi gözleri ve cımbız kullanarak şapkalı tarak açarak bir pigmentli manikür olup olmadığını kontrol edin. Bu pupa periferik tarak hücrelerinde varsa, bütün peteklerde pupa çoğu yaklaşık 1-3 gün içinde ortaya çıkacaktır.
   2. Daha sonra, tüm yapışık yetişkin arıların bir fırça ile temizlendikten sonra bu pupa içeren petekleri toplamak ve koloniler arasında değişkenliği en aza indirmek için üç koloniler tarakları karıştırın.
2. boş kovanı kutusunda toplanır tarak yerleştirin ve nemli koşullar altında 33 ° C (>% 60 nispi nem) inkübe edilir. Toplanan tarak 3 gün (koloni başına 3.000 işçi) üzerinden yaklaşık 6.000 yeni ortaya çıkan işçileri toplayın.
3. worke miktarını belirlemekBeş yeni ortaya işçi ağırlığına göre RS rastgele unmanipulated koloniler toplanmıştır.
   1. rastgele tartı makineleri kullanarak unmanipulated koloniler toplanan beş yeni ortaya çıkan işçileri tartılır.
      Not: Beş yeni çıkan işçilerin ağırlığı genellikle 500-600 mg olduğunu.
   2. Beş yeni ortaya çıkan işçilerin ortalama ağırlığı ile toplanan işçilerin ağırlığı bölünmesiyle tarafından toplanan işçilerin miktarını tahmin edin.
4. su bazlı afiş boya işaretlerini kullanarak yaklaşık 1.800 işçi (koloni başına 900 işçi) ve thoraces boya işaretleri uygulayın.
   Not: Yıkanabilir işaretleyici boya uygulamak için kullanılan Malzemelerin Tablo listelenir.
5. İki tarak, bir tarak içeren bal ve korunmuş gıdalar gibi polen ve yumurta döşeme kraliçe tarafından başka bir boş tarak içeren yeni bir kovan kutusuna bir kraliçe ve yaklaşık 3.000 0-2 gün eski işçilerin tanıtmak. bal ve polen fr içeren tarağı toplamakom tüm yapışık arıların sonra başka unmanipulated koloni kaldırılır.
   Not: Nükleer kovan kutusunun (küçük ölçekli kovanı kutusu) kullanılması tavsiye edilir.
6. Tek kohort koloniler oluşturduktan sonra 6 ila 8 gün boya işaretleri ile hemşire arılar ve erken silaj toplayın.
   1. , Hemşire arıları toplamak kuluçka dikkat çekmek için tarak hücrelere başlarını koymak işçileri almak için. Birçok yavru ve yetişkin işçilerin ihtiva tarak gelen hemşire arıları toplamak için cımbız kullanın.
      Not: Adım 1.7'de açıklandığı gibi disseke zaman toplanan işçilerin HPGler geliştirilmesi halinde, bu işçilerin hemşire arılar olarak tanımlanır. cımbız ile thoraces tutan tarak işçileri almak için tavsiye edilir.
   2. silaj toplamak için, kendi arka ayakları üzerinde polen yükleri ile kendi kovanlarına geri işçileri yakalamak için bir böcek net kullanabilirsiniz.
      Not: Adım 1.7'de açıklandığı gibi disseke zaman yakalanan işçilerin HPGler büzülmüş görünüyorsa, bu işçiler toplayıcılar olarak tanımlanmaktadır.
7. clasüç gruba, 'Gelişmiş', 'Intermediate' içine HPG yoğunlaştıracaktır ve stereomikroskop altında diseksiyon tarafından 'Büzüşük'.
   1. Arılar sinek ya da yürüyemiyorum kadar 10-15 dakika buzdolabında bir böcek kafes içinde 10-15 arılar anestezisi. Daha sonra, buz üzerine arılar taşımak ve 5 dakika boyunca buz üzerinde anestezi doldurun.
      Not: anestezi elde etmek için toplam 15-20 dakika sürer. Anestezi süresi kısalır gerekiyorsa, bir kafes içinde arıların sayısı kafes başına 1-3 arılar için azaltılmalıdır.
   2. makas ve cımbız ile vücuttan kafa teşrih. iğneler ile bir Petri kabı üzerine yerleştirilen diş mumu üzerine kafa sabitleyin. kafa düzeltmek için anten üsleri İki işaretçilerine yerleştirin. Böcek tuzlu su (130 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM _CaCl2) sabit kafaları bekletin.
   3. binoküler mikroskop altında ince cımbız kullanarak baş ve cerrahi bıçak manikür ön yönünü çıkarın.
      Not: HPGler kolay C çıkarılmasından sonra baş bulunabiliruticle. HPG baş beynin etrafında var olan bir botryoid organdır.
   4. manikür altında beyaz bir zar doku trakeal doku çıkarın. Sonra, yavaş yavaş cımbız ile çekerek baş HPGler incelemek.
   5. 'Gelişmiş' gibi büyük ve yuvarlak asinüs ile HPGler sınıflandırır. 'Büzüşük' gibi küçük ve bozuk asinüs ile HPGler sınıflandırır. HPGler 'Intermediate' olarak ne 'geliştirildi' ne de 'Büzüşük' tekabül sınıflandırır.
      Not: HPG devletlerin bu üç sınıf Şekil 2'de gösterilmiştir göstermektedir Temsilcisi fotoğraf.
   6. Konu 'geliştirilen' ve RNA ekstraksiyonu için 'Büzüşük' HPGler sırasıyla ve hemşire arılar ve toplayıcılar (bölüm 4) arasındaki HPGler gen ifadesini karşılaştırın hemşire arı HPGler 've' silaj makina HPGler '.

20E 2. Enjeksiyon

1. descr gibi tipik kolonilerden hemşire arıları toplamakprosedür 1.6.1 anlatılagelmiştir.
   Not: Arılar yetiştirilen olacak gibi HPGler bu arılar incelenebilir edilemez.
2. Bir buzdolabı (buz ile ilgili) 'de 4 ° C' de arı anestezisi.
   Not: anestezi elde etmek için yaklaşık 30 dakika sürer. Anestezi süresi kısalır ise, kafes içinde arıların sayısı kafes başına 1-3 arılar için azaltılmalıdır.
3. cımbız kullanarak, Petri kabı üzerine yerleştirilen diş mumu üzerinde arı hareketsiz.
4. Bir cam iğne çektirmenin kullanarak kalibre kılcal mikropipet yapılan bir enjeksiyon ucu kullanarak başın ön yüzünde içine 20E solüsyonu 1 ul enjekte edilir.
   1. Etanol böcek tuzlu su içinde (130 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM _CaCl2) karışımı 20E çözülür (1: 4) 2.5 ug / ml.
   2. Bir lastik tüp enjeksiyon ucu bağlayın ve tüpün karşı tarafında sarı bir mikropipet ucu bağlayın.
   3. Bir, bir mikropipet kullanarak parafilm üzerindeki 20E solüsyonu 1 ul koyun ağızda sarı mikropipet ucu tutunenjeksiyon ucu içine çözümü çizmek d.
   4. antenlerin taban içine enjeksiyon ucu takın ve sarı mikropipet ucu ile üfleyerek çözüm enjekte.
      Not: Bu adımda gösterilen Protokol Örnek enjeksiyon yöntemi, ancak otomatik enjeksiyon makinesinin kullanımı ²⁰ gerekli güvenliği için tavsiye edilir.
5. Arka 1 veya 3 gün boyunca karanlık ve nemli koşullarda (>% 60 bağıl nem) altında 33-36 ° C'de böcek kafeslerde enjekte arılar (ideal sıcaklık 35 ° C). Tedarik bal-su karışımı (1: 1) arılara. Gerekirse, enjeksiyondan sonra arılar hayatta sayılır.

Methopiren 3. Uygulama

1. tüm yapışık yetişkin arıların bir fırça ile çıkarıldıktan sonra tipik kolonilerden pupa ihtiva taraklar toplayın. 33-36 ° C'de tarakları inkübe 1 gün öncesine kadar için nemli ortamlarda (>% 60 bağıl nem) (ideal sıcaklık 35 ° C).
2. toplanmış kovanlardan gelen yeni ortaya çıkan arıların toplayın ve tek kohort koloniler hazırlamak için protokol açıklandığı gibi posteri boya kullanarak thoraces boya işaretleri geçerlidir. kendi kolonilerine işaretli arıları dönün.
3. 6 gün sonra, koloniler (6 gün eski) boyalı işçileri toplamak. cımbız ile thoraces tutarak tarak boyalı işçileri Pick up.
4. prosedür 2.2 olarak (buz ile ilgili) bir buzdolabı içinde 4 ° C'de arılar anestezisi. cımbız kullanarak, bir Petri tabağına konmuş diş mumu arıların hareketsiz bir mikropipet kullanılarak başlarına asetonda çözündürüldü metopiren çözeltisi (50-250 mg / ml) 1-5 ul geçerlidir. aseton dirençli olan bir filtre ucu kullanın.
   Not: Aseton ölüme yol açan arılar üzerinde zararlı etkileri olabilir. arı yüksek mortalite gözlenirse, en az 1 ul aseton hacmi azaltılması önerilir.
5. Arka 33-36 ° C (ideal bir ton böcek kafeslerde arılaremperature karanlık ve nemli koşullar altında 7 gün süreyle 35 ° C) (>% 60 nispi nem) 'dir. Tedarik bal-su karışımı (1: 1) arılara. Gerekirse, topik uygulamadan sonra arı kalan sayısı.
   Not: Bu yazıda, hayatta kalan arılar 7 gün uygulama (Tablo 3) sonra sayılır.

4. RNA ekstraksiyonu ve kantitatif RT-PCR

1. Arılar uyutmak ve 1.7.4'e adımları 1.7.1 açıklandığı gibi HPGler teşrih.
2. kullanılıncaya kadar -80 ° C'de kuru buz ve mağaza bir mikrosantrifüj tüp disseke HPGler toplayın.
3. Protein denatürasyonu için reaktif 400 ul ekle.
   Not: bu madde (Malzeme Tablo) ticari olarak mevcuttur.
4. Bir mikrosantrifüj tüp içinde uygun bir homojenizasyon havan tokmağı ile elektrikli karıştırıcı bir el kullanarak HPG dokuları homojenize. kırmak için buz ve lize doku hücreleri üzerinde 1 dakika boyunca yaklaşık 300 rpm'lik bir dönme hızında homojenize edilir.
   Not: el elektrikli karıştırıcı piyasadan temin edilebilir (Malzeme Tablo).
5. 80 ul kloroform ekleyin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
6. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 14.170 x g'de mikrosantrifüj tüpleri santrifüjleyin. yeni bir tüpe sulu faz transfer. izopropanol ve 1 ul glikojen (5 mg / ml) eşit hacim. En az 20 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.170 x g'de mikrosantrifüj tüpleri santrifüj ve supernatant çıkarın.
8. pelet% 75 etanol içinde 400 ul ilave edin ve iyice karıştırın, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 14.170 x g'de mikrosantrifüj tüpleri santrifüj ve supernatant çıkarın. bir kez daha bu işlemleri tekrarlayın.
9. 5-10 dakika boyunca pelet hava kuru ve daha sonra 10 mL RNaz içermeyen su içinde çözülür.
   Not: pelet tam kuruma suyun RNA pellet çözünmez neden olabilir. Bu nedenle, hafif ıslak topak için uyguneritme.
10. NanoDrop veya benzeri gibi bir spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonu ölçümü.
11. Herhangi bir bulaşık genomik DNA'yı, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek DNase 2.0 U toplam RNA 500 ng tedavi edin.
12. Ters-transkribe DNase I ile tedavi edilen RNA, 200 ng ve ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak gerçek zamanlı PCR yapmak ve gene-özel tetikleyiciler (mrjp2 (Malzemeler ve Reaktifler Tablo l'de liste), 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', ve 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 've 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). aşağıdaki gibi PCR gerçekleştirin: [95 ° C x 30 sn + (95 ° C x 5 saniye + 60 ° C x 15 saniye + 72 ° C x 20 sn) 45-55 döngüleri x].
13. Uzama faktörü 1α-F2 (EF1α˗F2) ya da ribozomal proteini 49 (rp49) ^9,16,21,22 bu ile transkript miktarı normalize. Bu genler güvenilir kontrol gr vardırMah-PCR ile HPGler gen ifadesini analiz etmek için enes.
14. İstatistiksel yazılımı kullanarak iki deney gruplarında (hemşire arılar vs erken toplayıcılar, kontrol arılar vs 20E-tedavi arılar ve kontrol arılar vs methopiren tedavi edilen arı) arasında önemli farklılıklar tespit etmek için iki kuyruklu t-testi yapın.
    Not: F-testi varyans homojenliğini kabul durumunda, Student t-testi kullanılır. Değilse, Welch t-testi kullanılır.

Sonuçlar

Tek kohort koloniler hazırlanması için mFLINT Şekil 1A'da gösterilmiştir. Koleksiyonu örnek tek kohort koloniler hazırlamaktan deneylerin Zaman kurs Şekil 1B gösterilmiştir. Hemşirelik davranış veya toplayıcı davranış için davranışsal kriterleri karşılayıp işçiler tek kohort koloniler toplanmıştır ve HPG gelişme bu işçilerin tahmin edilmiştir Tablo 1 üç gruba HPG gelişme sınıflandırılmasını g...

Tartışmalar

Tek kohort koloniler hazırlanması

Burada işçi arıların rolü kayması ile ilişkili HPG fizyolojisi analizi için tek kohort koloniler hazırlamak için önceki çalışmamızda ¹⁶ kullanılan protokol nitelendirdi. Prosedürler 1.6-1.7 ve Şekil 2'de açıklanan kriterleri karşılayıp Hemşire arılar ve erken silaj tek kohort koloniler (Tablo 1) gözlendi. HPG sınıflandırılması referans olarak devletler Şekil 2'de

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
UNIPOSCA	Mitsubishi pencil	PC-5M	Marker pen for the application of marks to bees
20-hydroxyecdysone	Sigma Aldrich	H5142
Methoprene	Sigma Aldrich	33375
Breeding case insect	IRIS OHYAMA	CP-SS
Electromotion mixier	ISO	23M-R25	homogenization of tissue
TRIZol Reagent	Invitrogen	15596-026	the reagent for total RNA extraction
DNase I	Takara	2270A
PrimeScript RT reagent kit	Takara	RR037A	the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II	Takara	RR820A	the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument	Roche	12011468001	the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl)	Roche	4929292001	the material for real-time PCR