单队列殖民地和工蜂的激素治疗的准备来分析生理学与关联作用和/或内分泌系统

摘要

在这里，我们描述详细的协议单队列蜂群的准备 - 分析相关角色工人生理的有用工具。我们还描述了用于治疗工人幼激素和蜕皮激素评估这些激素在工作者行为和/或生理调控的参与详细协议。

摘要

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

引言

欧洲蜜蜂， 蜜蜂 ，是一种完全社会性昆虫具有高度组织性的社会^1。工蜂（劳动等级）从事各种工作，以保持集落的活性，并且这些任务根据羽化后工蜂的年龄，这被称为劳动^2-4的年龄相关的分割发生变化。青年工人（<13日龄）照顾在蜂巢的育雏通过分泌蜂王浆（蜂护士），而年纪较大的工人（> 15天）采集花蜜和花粉蜂巢（征粮^）2-4之外。工人的生理与这个角色转变的关联变化。例如，下咽腺（HPGS）的功能，配对位于头外分泌腺，改变与护理的作用转变为觅食^2,5关联。护士蜂HPGS主要合成王浆主蛋白，是蜂王浆主要成分。另一方面，觅食HPGS主要合成碳水化合物代谢酶，如α葡糖苷酶III，通过将蔗糖转化为葡萄糖和果糖处理花蜜到蜂蜜。我们以前的研究显示，MRJP2的表达，其编码的一个主要蜂王浆蛋白质和Hbg3，它的作用移^6-9中编码α葡糖苷酶III，变更。

要确定是否在工人组织中的生理变化，包括HPGS，与角色的转变或与工人的年龄，这将是操纵蜜蜂殖民地的人口组成，如准备单队列有用菌落在几乎相同年龄的工人执行不同的任务^10,11。 Robinson 等人。（1989）描述了用于建立单一的队列菌落¹⁰的方法。单队列殖民地最初包括女王和0-2日龄工人。建立殖民地几天后，ALM工人OST同龄承担不同的任务。有些工人进行护理任务，如在典型菌落，而其他工作人员执行任务觅食比往年提前，并因此被称为早熟觅食。护士蜜蜂觅食早熟之间的基因表达的比较将提供有关工作的组织^12-16的相关角色的生理有用的信息。这里，我们描述了制备单队列菌落HPGS ¹⁶的角色和/或与年龄相关的生理分析的详细协议。我们还简要介绍了如何通过定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检查MRJP2和Hbg3的基因的表达来评价HPG生理学。

除了工人生理学单队列菌落的分析，内分泌系统的检查是用于分析相关联的角色的工人生理学的调节机制重要。幼激素（JH），其硝酸钾WN在昆虫幼虫的'现状'的激素，加速从护理的作用，在工蜂¹¹觅食的转变。此外，蜕皮激素，这是变态过程称为蜕皮激素，可能参与的作用移作为编码蘑菇体被表达，工人脑^17-19的较高中心蜕皮激素信号传导分子的基因。因此，我们还描述了在我们以前的研究¹⁶用于与20E治疗工人的详细协议，它是蜕皮激素的活性形式，和烯虫酯，一JH类似物，为的内分泌系统的上HPG生理效应分析（表达MRJP2和Hbg3）。

研究方案

1.单队列殖民地的制备

1. 准备三蜂群创建两个单队列菌落并获得足够数量的新出现的工人。
   1. 检查在梳皑皑的外周细胞的一些蛹有棕色的眼睛和开放使用镊子封顶梳子色素角质层。如果外围梳状细胞中存在这些蛹，在整个梳子最蛹会出现在大约1-3天。
   2. 随后，收集所有含有成人贴壁蜂已经用刷子去除后这些蛹的梳子，混合来自三个殖民地梳子，以减少菌落中的变异。
2. 放置收集梳子在一个空蜂巢框和在33℃潮湿条件下用C（> 60％相对湿度）孵育。收集大约6000新出现过工人从收集的梳子3天（每殖民地3000名工人）。
3. 确定借机的量基于五个新兴工人的重量RS随机抽取未经处理的殖民地收集。
   1. 重5使用称重机未经处理的殖民地随机抽取新出现的工人。
      注:五个新出现的工人的重量一般500-600毫克的。
   2. 通过将所收集的工作人员的重量由平均重量五个新出现工人估计收集工人的数量。
4. 涂漆标志使用水性漆的海报标志约1,800工人（每900菌落工人）的thoraces。
   注意:可洗的标记被用于施加涂料中列出的材料的表 。
5. 介绍一个皇后和大约0-2天的工人3000到包含两个梳子，蜂蜜含有梳1和花粉如腌制食品和产蛋女王另一个空梳一个新的蜂巢框。收集含有蜂蜜和花粉FR梳OM所有贴蜜蜂陆续未经处理的殖民地被删除。
   注:建议使用核蜂巢箱（小型蜂巢盒）的。
6. 收集护士蜜蜂觅食早熟用油漆标记6〜8天创造的单队列殖民地之后。
   1. 为了收集护士蜜蜂，拿起那把他们的头梳进入细胞采取育雏保健工作者。使用镊子从包含许多育雏和成年工人收集梳理护士蜜蜂。
      注意:如果收集工人HPGS如步骤1.7中所述解剖时被开发，这些工人被定义为护士蜜蜂。拿住镊子thoraces建议从梳子拿起工人。
   2. 为了收集征粮，使用防虫网，以捕获返回自己的蜂巢对他们的后腿花粉负载工人。
      注意:如果在步骤1.7中所述解剖时拍摄的工人HPGS出现缩水，这些工人被定义为觅食。
7. CLASSIFY的HPG分成三组，"开发"，"中间"和"皱缩"通过在立体显微镜下解剖。
   1. 麻醉在昆虫笼10-15蜜蜂在冰箱10-15分钟，直到蜜蜂无法飞行或步行。然后，移动蜜蜂在冰上，并完成在冰上麻醉5分钟。
      注意:大约需要总15-20分钟达到麻醉。如果麻醉时间需要缩短，蜜蜂在笼子的数目应减少到每笼1-3蜜蜂。
   2. 用剪刀和镊子解剖从主体的头部。固定放置在培养皿销牙科蜡头。将两个引脚到天线的基地，以固定头部。浸泡固定磁头在昆虫盐水（130毫米氯化钠，5毫米氯化钾，1毫米氯化钙_2）。
   3. 双目显微镜下除去用细镊子头部和手术刀的角质层的前方面。
      注:HPGS可以在头部很容易找到去除的C后uticle。该HPG的是，在头部左右脑存在葡萄状的器官。
   4. 取出气管组织是表皮下的白色膜状组织。然后，用小镊子缓缓地提拉他们解剖从头部HPGS。
   5. 分类HPGS大和循环腺泡为"发达"。分类HPGS小和歪曲腺泡为"皱缩"。相应的分类既不"发达"，也没有"皱缩"HPGS为"中级"。
      注意:代表的照片，显示这三个类HPG状态在图2中表示。
   6. 主题"发达"和"皱缩"HPGS以RNA提取为"护士蜂HPGS'和'觅食HPGS"，分别和护士蜜蜂觅食（第4节）之间的HPGS比较基因表达。

2. 20E注射

1. 从收集典型菌落为DESCR护士蜜蜂IBED在过程1.6.1。
   注:HPGS不能在这些蜜蜂进行审查，作为蜜蜂会被饲养。
2. 麻醉在4℃蜜蜂在冰箱（未在冰上）。
   注意:这需要大约30分钟，使麻醉。如果麻醉时间被缩短，在笼蜜蜂的数目应减少到每笼1-3蜜蜂。
3. 使用镊子，固定放置在培养皿上的牙模的蜜蜂。
4. 注入1微升20E溶液成使用来自用玻璃针拔出器校准的毛细管微量制成的注射尖端的头部的前方面。
   1. 溶解20E在乙醇-昆虫盐水（130毫摩尔NaCl，5mM的氯化钾，1mM的氯化钙_2）的混合物（1:4）以2.5微克/微升。
   2. 喷射末梢连接到橡胶管中，和一个黄色枪头连接到管的相反的一侧。
   3. 使用微量上放置封口膜1微升20E溶液，保持黄色微量移液器尖端在口中，一个d拉伸溶液进入注射小费。
   4. 插入喷射尖端进入天线的基础上，并通过经由黄色微量移液器尖端吹注入该溶液。
      注意:在此步骤中显示的协议是代表注射方法，但建议在必要时²⁰安全使用自动注射机。
5. 后在33-36℃的昆虫笼注入蜜蜂（理想温度为35℃）进行1或3天阴暗潮湿条件下（> 60％相对湿度）下。供应蜂蜜 - 水混合物（1:1），以蜜蜂。如果需要的话，算上注射后幸存的蜜蜂。

3.烯虫酯中的应用

1. 收集包含从典型菌落蛹所有附着的成年蜜蜂用刷子去除后，梳子。孵育梳子在33-36℃（理想温度为35℃）在潮湿的条件下为1天（> 60％相对湿度）。
收集从收集的梳新兴蜜蜂和应用的标志漆用海报涂料作为在协议中用于制备单队列菌落描述其thoraces。返回标记的蜜蜂他们的殖民地。
2. 6天后，收集来自克隆彩绘工人（6日龄）。通过举办他们的thoraces用镊子拿起从梳子彩绘工人。
3. 麻醉在4℃蜜蜂在冰箱（未在冰上），为在步骤2.2。使用镊子，固定放置在培养皿上的牙模蜜蜂和应用1-5微升溶于丙酮中使用微量头甲氧普林溶液（50-250微克/微升）。使用过滤嘴是向丙酮抗性。
   注意:丙酮可能会对蜜蜂导致死亡的有害影响。如果观察蜜蜂的死亡率高，建议丙酮在最小的体积为1微升的降低。
4. 后在昆虫笼蜜蜂在33-36°C（理想Ťemperature是35℃）下阴暗潮湿的条件下7天（> 60％相对湿度）。供应蜂蜜 - 水混合物（1:1），以蜜蜂。如果需要的话，算上局部应用后幸存的蜜蜂。
   注:在本文中，幸存的蜜蜂申请（ 表3）后7天计数。

4. RNA提取和定量RT-PCR

1. 麻醉蜜蜂和步骤1.7.1说明1.7.4解剖HPGS。
2. 收集在干冰上和存储微量​​离心管的解剖HPGS在-80℃直到使用。
3. 添加400微升试剂为蛋白质变性。
   注:此试剂是市售的（见材料表 ）。
4. 使用均质与离心管内适合一个同质化的杵举行电动搅拌机一只手HPG组织。均质化在约300rpm下的旋转速度在冰上打破和裂解组织细胞1分钟。
   注意:手持电动打蛋器可购（见材料表 ）。
5. 加入80微升氯仿拌匀。在室温下孵育5分钟。
6. 离心机离心管在14170 XG在4℃下15分钟。将水相转移至新管中。添加异丙醇和1μl糖原（5毫克/毫升）的等体积。孵育在-20℃至少20分钟。
7. 离心微量离心管在14170×g离心10分钟，在4℃下，去除上清。
8. 加入400微升75％乙醇的颗粒拌匀，在4℃，14170 XG离心离心管15分钟，然后取出上清。重复这些步骤一次。
9. 空气干燥沉淀5-10分钟，然后将其溶解于10μl无RNA酶的水。
   注:沉淀完全干燥可能导致RNA沉淀的不溶化于水中。因此，这是微湿的沉淀是适当的溶解。
10. 使用分光光度计等的NanoDrop或类似测量RNA浓度。
11. 通过在37℃温育30分钟以降解任何污染的基因组DNA的治疗500ng的总RNA用DNase I的2.0ü。
12. 反向转录的200ng DNA酶I处理过的RNA，并使用市售的试剂盒进行实时PCR（见材料与试剂的表的列表）和基因特异性引物（MRJP2 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3'和5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3'，Hbg3 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3'和5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'）。执行的PCR如下:[95℃×30秒+（95℃×5秒+ 60℃×15秒+ 72℃×20秒）×45-55个循环]。
13. 规范化成绩单量与延伸因子1α-F2（EF1α˗F2）或核糖体蛋白^{49（RP49）9,16,21,22}的。这些基因是可靠的控制功能g烯类在使用QRT-PCR的HPGS分析基因表达。
14. 执行双尾t检验来检测使用统计两个软件实验组（护士对蜜蜂觅食早熟，20E治疗蜜蜂与控制蜜蜂和烯虫酯处理与蜜蜂蜜蜂控制）之间的显著差异。
    注意:如果F-检验假设方差的同质性，学生t检验可以使用。如果不是，可以使用韦尔奇氏t检验。

结果

该协议用 ​​于制备单队列菌落的概述图1A中示出。从制备单队列菌落样品收集实验时间过程示于图1B。该纳护理行为或取食行为的行为准则工人从单队列菌落收集，并且HPG发展这些工人估计表1示出的HPG发展的分类为三组。 "开发"，"中间"和"皱缩"根据大小。示出这三个类HPGS的代表性照片在图2中所示，结果表明，这两个?...

讨论

单队列殖民地的制备

在这里，我们描述了我们先前的研究¹⁶用于为与工蜂的角色转变相关的生理HPG分析准备单队列殖民地的协议。在单队列菌落（ 表1）中观察到护士蜜蜂和早熟觅食出满足在程序1.6-1.7和图2中所描述的标准。在HPG分类为基准规定的图2中的照片是有用的。基于这两个工人行为和HPG发展的标准是有效的，用于定义典型...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
UNIPOSCA	Mitsubishi pencil	PC-5M	Marker pen for the application of marks to bees
20-hydroxyecdysone	Sigma Aldrich	H5142
Methoprene	Sigma Aldrich	33375
Breeding case insect	IRIS OHYAMA	CP-SS
Electromotion mixier	ISO	23M-R25	homogenization of tissue
TRIZol Reagent	Invitrogen	15596-026	the reagent for total RNA extraction
DNase I	Takara	2270A
PrimeScript RT reagent kit	Takara	RR037A	the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II	Takara	RR820A	the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument	Roche	12011468001	the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl)	Roche	4929292001	the material for real-time PCR