Erstellung von Einzel-Kohorte Kolonien und Hormonbehandlung von Arbeitshonigbienen Physiologie Assoziierte Analysieren mit Rolle und / oder endokrine System

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir unser ausführliches Protokoll zur Herstellung von Single-Kohorte Bienenvölker - ein nützliches Werkzeug für die Analyse der Rolle-assoziierten Arbeiter Physiologie. Wir beschreiben auch detaillierte Protokolle für Arbeitnehmer mit Juvenilhormons und Ecdyson Behandlung der Beteiligung dieser Hormone an der Regulation der Arbeiter Verhalten und / oder Physiologie zu bewerten.

Zusammenfassung

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Einleitung

Die Europäische Honigbiene, Apis mellifera, ist ein eusocial Insekt mit einer hoch organisierten Gesellschaft ^1. Arbeiter Honigbienen (Arbeits Kaste) sind in verschiedener Aufgaben Kolonie Aktivität zu erhalten, und diese Aufgaben ändern sich je nach dem Alter des Arbeitnehmers Honigbiene nach dem Schlüpfen, die als altersbedingte Arbeitsteilung bezeichnet wird ^2-4. Junge Arbeitnehmer (<13 Tage alt) kümmern sich um die Brut in den Bienenstock von Gelée Royale sezer (Ammen), während ältere Arbeitnehmer (> 15 Tage alt) sammeln Nektar und Pollen außerhalb des Bienenstocks (foragers) ^2-4. Die Physiologie der Arbeiter ändert sich in Verbindung mit dieser Rolle Verschiebung. Zum Beispiel kann die Funktion der Hypopharynxdrüsen (HPGs), gepaart im Kopf befindet exokrinen Drüsen, Änderungen im Zusammenhang mit der Rolle Verschiebung von Pflege bis ^2,5 Nahrungssuche. Krankenschwester Biene HPGs synthetisieren hauptsächlich großen Gelee royale Proteine, die wichtigsten Komponenten der Bienenmilch sind. Auf der anderen Seite, forager HPGs hauptsächlichKohlenhydrat-metabolisierende Enzyme wie α-Glucosidase III synthetisieren Nektar in Honig zu verarbeiten, indem Saccharose in Glucose und Fructose umwandelt. Unseren früheren Studien zeigten , dass die Expression von mrjp2, die einen Haupt Gelée royale - Protein kodiert, und Hbg3, die während der Rolle Verschiebung ^6-9 α-Glucosidase III, Änderungen kodiert.

Um zu bestimmen, ob die physiologischen Veränderungen in den Arbeiter Geweben, einschließlich der HPGs, mit der Rolle Verschiebung oder mit dem Alter der Arbeiter verbunden ist, wäre es nützlich, die Population Zusammensetzung eines Bienenvolk zu manipulieren, beispielsweise single-Kohorte vorzubereiten Kolonien , in denen Arbeiter fast im gleichen Alter führen verschiedene Aufgaben ^10,11. Robinson et al. (1989) beschrieben , ein Verfahren zur Herstellung einer Einzelkolonie Kohorten ¹⁰ herzustellen. Einzel-Kohorte Kolonien umfassen zunächst eine Königin und 0-2 Tage alten Arbeiter. Einige Tage nach der Kolonien Gründung, Arbeiter von almost im gleichen Alter übernehmen verschiedene Aufgaben. Einige Arbeiter verrichten Pflegeaufgaben wie in typischen Kolonien, während andere Arbeiter Nahrungssuche Aufgaben früher als üblich und werden so altklug foragers genannt. Die Genexpression Vergleiche zwischen Ammen und altklug foragers würde nützliche Informationen über die Rolle assoziierte Physiologie der Arbeiter Gewebe ^16.12. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für ¹⁶ Single-Kohorte Kolonien für die Analyse der rollen- und / oder altersassoziierte Physiologie der HPGs vorbereitet. Wir beschreiben auch kurz , wie die Genexpression von mrjp2 und Hbg3 durch quantitative reverse Transkription-Polymerase - Kettenreaktion (RT-PCR) zu untersuchen HPG Physiologie zu untersuchen.

Neben der Analyse der Arbeiter Physiologie im Einzel Kohorte Kolonien, Prüfung des endokrinen Systems ist wichtig für die Regulationsmechanismen der Rolle assoziierten Arbeiter Physiologie zu analysieren. Juvenile Hormon (JH), die kno istwn als in Insektenlarven Hormon 'Status quo', beschleunigt den Wandel in der Rolle von Pflege in Arbeitshonigbienen ¹¹ bis Nahrungssuche. Weiterhin Ecdyson, das als Häutungshormons während der Metamorphose bekannt ist, könnte in der Rolle Verschiebung als Gene , die für Ecdyson Signalmoleküle in den Pilzkörpern, ein höheres Zentrum des Arbeiters brain ^17-19 exprimiert werden beteiligt sein. Deshalb beschreiben wir auch das detaillierte Protokoll in unserer früheren Studie ¹⁶ verwendet , um Arbeitnehmer mit 20E behandeln, die eine aktive Form von Ecdyson ist, und Methopren, ein JH analog zur Analyse der Wirkung des endokrinen Systems auf HPG Physiologie (Expression von mrjp2 und Hbg3).

Protokoll

1. Herstellung von Einzel-Kohorte Kolonien

1. Bereiten Sie drei Bienenvölker zu schaffen zwei Single-Kohorte Kolonien und eine ausreichende Anzahl von neu entstandenen Arbeiter zu erhalten.
   1. Überprüfen Sie, dass einige Puppen in den verkappten peripheren Zellen in den Waben haben braune Augen und ein pigmentiertes Kutikula durch die verkappten Kämme mit einer Pinzette zu öffnen. Wenn diese pupae in Umfangskammzellen vorhanden sind, werden die meisten Puppen in den ganzen Kämme entstehen in etwa 1-3 Tagen.
   2. Anschließend sammeln die Kämme haben diese enthalten Puppen nach allen anhaftenden erwachsenen Bienen mit einer Bürste entfernt worden ist, und von den drei Kolonien Kämme mischen Variabilität unter Kolonien zu minimieren.
2. Legen Sie die gesammelten Kämme in einem leeren Feld Struktur und Inkubation bei 33 ° C unter feuchten Bedingungen (> 60% relative Luftfeuchtigkeit). Sammeln Sie rund 6.000 neu entstandenen Arbeiter über 3 Tage (3.000 Arbeiter pro Kolonie) aus den gesammelten Kämme.
3. Bestimmen Sie die Menge von workers bezogen auf das Gewicht von fünf neu entstandenen Arbeiter aus unmanipulated Kolonien zufällig gesammelt.
   1. Wiegen fünf neu entstandenen Arbeiter aus unmanipulated Kolonien mit einem Gewicht von Maschinen zufällig gesammelt.
      Hinweis: Das Gewicht von fünf neu entstandenen Arbeiter im Allgemeinen 500-600 mg ist.
   2. Schätzen Sie die Menge der gesammelten Arbeiter durch das Gewicht der gesammelten Arbeiter durch das durchschnittliche Gewicht von fünf neu entstandenen Arbeiter geteilt wird.
4. Bewerben Farbmarkierungen auf den thoraces von rund 1.800 Arbeiter (900 Arbeiter pro Kolonie) mit wasserbasierenden Plakatfarbe Marker.
   Hinweis: Waschbar Marker, der verwendet wird , um die Farbe aufzutragen ist in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
5. Einführung einer Königin und etwa 3.000 der 0-2 Tage alten Arbeiter zu einem neuen Feld Struktur, die zwei Kämme enthält, ein Kamm aus Honig und Pollen als Konserven und andere leer Kamm für die Eiablage durch die Königin. Sammeln Sie den Kamm aus Honig und Pollen from eine andere unmanipulated Kolonie, nachdem alle anhaftenden Bienen werden entfernt.
   Hinweis: Die Nutzung der Kern hive Box (klein hive-Box) wird empfohlen.
6. Sammeln Krankenschwester Bienen und altklug foragers mit Farbmarkierungen 6 bis 8 Tage nach dem Single-Kohorte Kolonien zu schaffen.
   1. So sammeln Krankenschwester Bienen holen Arbeiter, die ihre Köpfe in Kamm Zellen gelegt kümmern sich um die Brut. Verwenden einer Pinzette die Krankenschwester Bienen Waben zu sammeln, die viele Brut und erwachsene Arbeitnehmer enthalten.
      Hinweis: Wenn HPGs der gesammelten Arbeiter entwickelt werden, wenn seziert als 1,7 in Schritt beschrieben, werden diese Arbeiter als Krankenschwester Bienen definiert. die thoraces durch Pinzette halten wird empfohlen, Arbeiter aus den Waben zu holen.
   2. So sammeln foragers, verwenden Sie ein Insektennetz Arbeiter zu erfassen, die mit Pollen Lasten auf die Hinterbeine, um ihre Bienenstöcke zurück.
      Hinweis: Wenn HPGs der gefangenen Arbeiter geschrumpften erscheinen, wenn seziert als 1,7 in Schritt beschrieben, werden diese Arbeitnehmer als foragers definiert.
7. Classifizieren die HPG in drei Gruppen, "entwickelt", "Intermediate" und "geschrumpfte" durch die Präparation unter einem Stereomikroskop.
   1. Anesthetize 10-15 Bienen in einem Insekt Käfig in einem Kühlschrank für 10-15 Minuten, bis die Bienen fliegen oder kann nicht gehen. Dann Bienen auf Eis bewegen und die Anästhesie auf Eis für 5 min ab.
      Hinweis: Es dauert etwa 15-20 Minuten insgesamt zu Anästhesie erreichen. Wenn der Narkosezeit verkürzt werden muss, sollte die Anzahl der Bienen in einem Käfig auf 1-3 Bienen pro Käfig reduziert werden.
   2. Präparieren Sie den Kopf vom Körper mit einer Schere und Pinzette. Befestigen Sie den Kopf auf Dentalwachs auf eine Petrischale gelegt mit Stiften. Legen Sie zwei Stifte in die Basen der Antennen den Kopf zu fixieren. Einweichen feste Köpfe in Insektensalzlösung (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl _2).
   3. Entfernen Sie den vorderen Aspekt der Kutikula des Kopfes mit einer feinen Pinzette und einem chirurgischen Messer unter dem Binokular.
      Hinweis: Die HPGs kann leicht in den Kopf nach der Entfernung von c gefunden werdenuticle. Die HPG ist ein botryoid Organ, das rund um das Gehirn im Kopf existiert.
   4. Entfernen Sie die Luftröhrengewebe, die eine weiße membranartige Gewebe unter der Oberhaut ist. Dann sezieren die HPGs vom Kopf, indem sie langsam mit einer Pinzette herausziehen.
   5. Klassifizieren HPGs mit großen und Kreis acini als "entwickelt". Klassifizieren HPGs mit kleinen und verzerrt acini als "geschrumpfte". Klassifizieren HPGs entsprechend weder "entwickelt" noch "geschrumpfte" als "Intermediate".
      Hinweis: Repräsentative Fotografien , die diese drei Klassen von HPG Staaten zeigen sind in Abbildung 2 dargestellt.
   6. Betreff "entwickelt" und "geschrumpfte" HPGs zu RNA-Extraktion als "Krankenschwester Biene HPGs 'und' forager HPGs 'bezeichnet und die Genexpression in den HPGs zwischen Ammen und foragers (Abschnitt 4) zu vergleichen.

2. Injektion von 20E

1. Sammeln Krankenschwester Bienen aus typischen Kolonien als Beschribed in dem Verfahren 1.6.1.
   Hinweis: HPGs kann nicht in diesen Bienen untersucht werden, wie die Bienen gezüchtet werden.
2. Anesthetize die Bienen bei 4 ° C im Kühlschrank (nicht auf Eis).
   Hinweis: Es dauert etwa 30 min Anästhesie zu erreichen. Wenn die Anästhesiezeit verkürzt wird, sollte die Anzahl der Bienen im Käfig 1-3 Bienen pro Käfig reduziert werden.
3. Mit einer Pinzette zu immobilisieren, die Bienen auf Dentalwachs auf einem Teller Petri gelegt.
4. Injizieren Sie 1 ul 20E-Lösung in die Vorderseite des Kopfes eine Injektionsspitze aus einem kalibrierten Kapillare Mikro hergestellt unter Verwendung einer Glas Nadel Abzieher.
   1. Auflösen 20E in Ethanol-Insektensalzlösung (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl ₂₎ Gemisch (1: 4) bei 2,5 ug / ul.
   2. Verbinden Sie die Injektionsspitze an einem Gummischlauch, und eine Verbindung zu der gegenüberliegenden Seite des Rohres einen gelben Mikropipettenspitze.
   3. Platz 1 ul 20E Lösung auf Parafilm mit einer Mikropipette, halten Sie die gelbe Mikropipettenspitze im Mund, eind die Lösung in die Injektionsspitze ziehen.
   4. Legen Sie die Injektionsspitze in die Basis der Antennen, und die Lösung zu injizieren, indem sie durch die gelbe Mikropipettenspitze bläst.
      Hinweis: Das Protokoll in diesem Schritt gezeigt wird , ist der repräsentative Einspritzverfahren, aber die Verwendung der automatischen Injektionsmaschine ist aus Sicherheitsgründen als notwendig ²⁰ empfohlen.
5. Hinten die injizierten Bienen in Insekten Käfigen bei 33-36 ° C (die ideale Temperatur liegt bei 35 ° C) unter dunklen und feuchten Bedingungen (> 60% relative Luftfeuchtigkeit) für 1 oder 3 Tage. Versorgungs Honig-Wasser-Gemisch (1: 1) an die Bienen. Bei Bedarf zählen Bienen nach der Injektion zu überleben.

3. Anwendung von Methoprene

1. Sammeln Sie die Kämme, die Puppen aus typischen Kolonien nach allen anhaftenden erwachsenen Bienen entfernt werden mit einem Pinsel enthalten. Inkubieren der Kämme bei 33-36 ° C (die optimale Temperatur beträgt 35 ° C) unter feuchten Bedingungen (> 60% relative Luftfeuchtigkeit) für bis zu 1 Tag.
2. Sammeln frisch geschlüpfte Bienen aus den gesammelten Kämme und Farbmarkierungen auf ihre thoraces mit Plakatfarbe gelten wie für die Vorbereitung Single-Kohorte Kolonien im Protokoll beschrieben. Bringen Sie die markierten Bienen in ihre Kolonien.
3. Nach 6 Tagen bemalten Arbeiter (6 Tage alt) aus den Kolonien zu sammeln. Pick-up gemalt Arbeiter aus den Waben durch ihre thoraces mit einer Pinzette zu halten.
4. Anesthetize die Bienen bei 4 ° C im Kühlschrank (nicht auf dem Eis), wie in dem Verfahren 2.2. Mit einer Pinzette zu immobilisieren, die Bienen auf Dentalwachs auf einem Teller Petri gegeben und gelten 1-5 ul Methopren Lösung (50-250 ug / ul), gelöst in Aceton, um ihre Köpfe mit einer Mikropipette. Verwenden Sie eine Filterspitze, die Aceton beständig ist.
   Hinweis: Aceton können die schädlichen Auswirkungen auf Bienen haben zum Tod führt. Wenn die hohe Sterblichkeit der Bienen beobachtet wird, wird die Verringerung des Volumens von Aceton zu 1 & mgr; l bei der minimalen empfohlen.
5. Hinten die Bienen in Insekten Käfigen bei 33-36 ° C (ideal temperaturbereich ist 35 ° C) für 7 Tage unter dunklen und feuchten Bedingungen (> 60% relative Luftfeuchtigkeit). Versorgungs Honig-Wasser-Gemisch (1: 1) an die Bienen. Bei Bedarf zählen Bienen nach der topischen Anwendung zu überleben.
   Hinweis: In diesem Artikel werden überlebenden Bienen 7 Tage nach der Anwendung gezählt (Tabelle 3).

4. RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR

1. Anesthetize Bienen und sezieren HPGs wie in den Schritten 1.7.1 bis 1.7.4 beschrieben.
2. Sammeln Sie die seziert HPGs in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis und bei -80 ° C bis zur Verwendung.
3. In 400 ul des Reagenz zur Denaturierung von Proteinen.
   Hinweis: Dieses Reagenz im Handel erhältlich ist (siehe die Tabelle der Materialien).
4. Homogenisieren HPG Gewebe eine Hand elektrischen Mixer mit einer Homogenisierung zerstoßen, die in einem Mikrozentrifugenröhrchen passt. Homogenisieren für 1 min auf Eis bei einer Rotationsgeschwindigkeit von ungefähr 300 rpm zu brechen und lysieren Gewebezellen.
   Hinweis: Die Hand elektrischen Mixer im Handel erhältlich ist (die Tabelle der Materialien sehen).
5. In 80 ul Chloroform und gut mischen. Inkubieren für 5 min bei RT.
6. Zentrifugieren der Mikrozentrifugenröhrchen bei 14.170 xg für 15 min bei 4 ° C. Die wäßrige Phase in ein neues Röhrchen. Hinzufügen eines gleichen Volumens an Isopropanol und 1 ul Glycogen (5 mg / ml). Inkubieren bei -20 ° C für mindestens 20 min.
7. Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße bei 14170 × g für 10 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand.
8. In 400 ul 75% Ethanol zu dem Pellet und gut mischen, Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße bei 14170 × g für 15 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diese Verfahren noch einmal.
9. Der Luft trocknen das Pellet für 5-10 min und dann in 10 & mgr; l RNase-freiem Wasser auflösen.
   Hinweis: Die vollständige Trocknung des Pellets Unlöslichmachen des RNA-Pellet in Wasser führen kann. Somit wird das Pellet leicht feucht ist, ist geeignet fürAuflösung.
10. Messen Sie die RNA-Konzentration ein Spektrophotometer wie Nanodrop oder ähnliches verwendet wird.
11. Behandlung von 500 ng Gesamt-RNA mit 2,0 U DNase I für 30 min bei 37 ° C inkubiert vorhandene kontaminierende genomische DNA zu degradieren.
12. Rückwärts-transkribieren 200 ng DNase I behandelten RNA und führen PCR Echtzeit im Handel erhältlichen Kits (siehe die Liste in der Tabelle der Materialien und Reagenzien) und Gen-spezifischen Primer (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'und 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'und 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Führen Sie die PCR wie folgt: [95 ° C x 30 sec + (95 ° C x 5 sec + 60 ° C x 15 s + 72 ° C x 20 sec) x 45-55 Zyklen].
13. Normalisieren der Menge an Transkript mit der Elongationsfaktor 1α-F2 (EF1α˗F2) oder ribosomale Protein 49 (rp49) ^9,16,21,22. Diese Gene sind zuverlässige Kontrolle genen für die Genexpression in den HPGs mit qRT-PCR-Analyse.
14. Führen Sie two-tailed t-Test, um die signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen (Ammenbienen vs. altklug foragers, 20E behandelten Bienen vs. Kontrolle Bienen und Methopren behandelten Bienen vs. Kontrolle Bienen) mit Hilfe statistischer Software zu erkennen.
    Hinweis: Wenn F-Test, um die Homogenität der Varianz, Student-t-Test verwendet werden können, übernimmt. Wenn nicht, kann Welch t-Test verwendet werden.

Ergebnisse

Eine Übersicht über das Protokoll single-Kohorte Kolonien zur Herstellung ist in 1A veranschaulicht. Zeitverlauf der Experimente von Single-Kohorte Kolonien Vorbereitung der Probenahme ist in 1B gezeigt. Arbeiter, die die Verhaltenskriterien für Pflegeverhalten oder Fraßverhalten erfüllt wurden von Single-Kohorte Kolonien gesammelt und HPG Entwicklung wurde in dieser Arbeiter Tabelle 1 zeigt die Einteilung der HPG Entwicklung in dre...

Diskussion

Herstellung von Single-Kohorte Kolonien

Hier haben wir beschrieben , das Protokoll in unserer früheren Studie ¹⁶ verwendet , um Single-Kohorte Kolonien für die Analyse von HPG Physiologie vorzubereiten im Zusammenhang mit der Verschiebung der Rolle der Arbeiterbienen. Krankenschwester Bienen und altklug foragers, die die Kriterien in den Verfahren beschrieben erfüllt 1,6-1,7 und 2 wurden in den Single-Kohorte Kolonien (Tabelle 1) beobachtet. Di...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
UNIPOSCA	Mitsubishi pencil	PC-5M	Marker pen for the application of marks to bees
20-hydroxyecdysone	Sigma Aldrich	H5142
Methoprene	Sigma Aldrich	33375
Breeding case insect	IRIS OHYAMA	CP-SS
Electromotion mixier	ISO	23M-R25	homogenization of tissue
TRIZol Reagent	Invitrogen	15596-026	the reagent for total RNA extraction
DNase I	Takara	2270A
PrimeScript RT reagent kit	Takara	RR037A	the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II	Takara	RR820A	the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument	Roche	12011468001	the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl)	Roche	4929292001	the material for real-time PCR