シングルコホートコロニーと労働者ミツバチのホルモン治療の準備は役割および/または内分泌系との生理学関連を分析します

要約

役割に関連する労働者の生理機能を解析するための便利なツール - ここでは、単一コホートミツバチコロニーの製造のための私達の詳細なプロトコルを記述します。また、労働者の行動および/または生理の調節におけるこれらのホルモンの関与を評価するために、幼若ホルモンおよびエクジソンで労働者を治療するための詳細なプロトコルを記述します。

要約

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

概要

ヨーロッパミツバチ、 ミツバチは 、高度に組織化された社会¹と真社会性昆虫です。ワーカーミツバチ（労働カーストは）労働^2-4の年齢関連部門と呼ばれる、コロニー活性を維持するためにさまざまなタスクに従事し、かつ、これらのタスクは、羽化後ワーカーミツバチの年齢に応じて変更されています。若年労働者（<13日齢）高齢労働者がいる間、ローヤルゼリー（看護師蜂）を分泌することによりハイブのひなの世話をする（> 15日齢）はハイブ（飼料収穫機^）2-4の外に蜜や花粉を集めます。労働者の生理機能は、この役割のシフトに関連して変化します。例えば、下咽頭腺（HPGs）の機能は、頭部に位置する外分泌腺^、2,5を採餌する看護か ​​らロールシフトに関連して変化をペアリング。ナース蜂HPGsは、主に蜂のミルクの主要な構成要素である主要なローヤルゼリーのタンパク質を合成します。一方、飼料収穫機HPGs主ブドウ糖と果糖にショ糖を変換することによって蜂蜜に蜜を処理するために、このようなαグルコシダーゼIIIなどの炭水化物代謝酵素を合成。我々の以前の研究では、α-グルコシダーゼIIIをコードする主要なローヤルゼリータンパク質、およびHBG3、ロールシフト^6-9中の変更をエンコードするmrjp2の発現、ことを明らかにしました。

HPGsを含む労働者の組織における生理的変化は、ロールシフトまたは労働者の年齢と関連しているかどうかを判断するためには、単一のコホートを準備するなど、ミツバチのコロニーの人口構成を操作することが有用ですほぼ同じ年齢の労働者が異なるタスク^10,11を実行したコロニー。ロビンソンら （1989）は、単一のコホートコロニー^10を確立^するため^の方法を記載しています。シングルコホートコロニーは、最初は女王と0-2日齢の労働者を含みます。コロニーを確立した後、数日間、ALMの労働者同じ年齢OST異なるタスクを想定しています。他の労働者がいつもより早く採餌タスクを実行するため、早熟飼料収穫機と呼ばれているのに対し、一部の労働者は、典型的なコロニーのように看護タスクを実行します。看護師の蜂と早熟飼料収穫機間の遺伝子発現の比較は、労働者の組織^12-16の役割に関連した生理機能に関する有用な情報を提供するであろう。ここでは、ロールベースおよび/ ​​またはHPGs ¹⁶の加齢に伴う生理機能の解析のための単一のコホートのコロニーを調製するための詳細なプロトコルを記述します。我々はまた、簡単にHPGの生理機能を評価するために、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によってmrjp2とHBG3の遺伝子発現を検査する方法について説明します。

シングルコホートコロニー内のワーカー生理学の分析に加えて、内分泌系の検査は、役割に関連する労働者の生理機能の調節機構を解析するために重要です。自演れる幼若ホルモン（JH）、昆虫の幼虫の「現状」ホルモンとしてWN、ワーカーミツバチ¹¹で採餌への看護の役割のシフトを加速します。また、変態の間に脱皮ホルモンとして知られているエクジソンは、、キノコ体に労働者の脳^17-19の高い中心部を表現しているジソンシグナル伝達分子をコードする遺伝子としての役割シフトに関与している可能性があります。したがって、我々はまた、HPG生理学上の内分泌系の効果の分析（の発現のために詳細なエクジソンの活性型である20Eと労働者を治療するために、我々の以前の研究¹⁶で使用されるプロトコル、およびメトプレン、JHアナログを、記述しますmrjp2とHBG3）。

プロトコル

シングルコホートコロニーの調製

1. 2つの単一コホートコロニーを作成するために、3つのミツバチのコロニーを準備し、新たに出現した労働者の十分な数を取得します。
   1. 櫛でキャップされた末梢細胞内のいくつかの蛹は、ピンセットを使用してキャップされた櫛を開くことによって、茶色の目と着色されたキューティクルを持っていることを確認してください。これらの蛹が周辺コーム細胞に存在する場合、全体の櫛で蛹のほとんどは約1-3日で出てきます。
   2. その後、すべての付着大人のミツバチをブラシで除去された後にこれらの蛹を含む櫛を収集し、コロニー間のばらつきを最小限にするために3個のコロニーから櫛を混ぜます。
2. 空の巣のボックスに集めコームを置き、高湿度（> 60％の相対湿度）下で33℃でインキュベートします。収集した櫛から3日（コロニーあたり3,000労働者）で約6000新興労働者を集めます。
3. workeの量を決定5新たに出現した労働者の重量に基づいて、RSはランダムに操作されていないコロニーから集めました。
   1. ランダムに計量機を使用して操作されていないコロニーから収集した5新興労働者を計量。
      注：5新興労働者の量は、一般に500から600 mgです。
   2. 5新たに出現した労働者の平均重量によって収集された労働者の重量を割ることによって収集した労働者の量を推定します。
4. 水ベースのポスターペイントマーカーを用いて、約1,800の労働者（コロニーあたり900労働者）のthoraxの複数形にペイントマークを適用します。
   注：ウォッシャブルマーカー塗料を適用するために使用される材料の表に記載されています。
5. 女王を導入し、約3,000 0-2日齢労働者の2櫛、保存食品、女王によって産卵のための別の空の櫛のように蜂蜜と花粉を含む1櫛を含む新しいハイブボックスに。ハチミツと花粉のFRを含む櫛を収集すべての付着ミツバチが除去された後オム別の未操作のコロニー。
   注：核ハイブボックス（小型ハイブボックス）の使用が推奨されます。
6. 6〜8日、シングルコホートコロニーを作成した後、ペイントマークで看護師のミツバチと早熟飼料収穫機を収集します。
   1. 看護師の蜂を収集するには、ひなの世話をするためにコーム細胞に頭を入れた労働者を拾います。多くのひなと大人の労働者が含まれている櫛から看護師蜂を収集するためにピンセットを使用してください。
      注：ステップ1.7で説明したように解剖したときに収集された労働者のHPGsが開発されている場合は、これらの労働者は、看護師の蜂のように定義されています。ピンセットによってthoraxの複数形を保持することは櫛から労働者をピックアップすることをお勧めします。
   2. 飼料収穫機を収集するには、その後ろ足に花粉負荷との巣箱に戻る労働者をキャプチャするために昆虫ネットを使用しています。
      注：ステップ1.7で説明したように解剖したときに撮影した労働者のHPGsが収縮し表示された場合は、これらの労働者は、飼料収穫機のように定義されています。
7. CLAS実体顕微鏡下で解剖によって三つのグループにHPGをSIFY、「開発」、「中級」、および「縮みました」。
   1. ミツバチが飛んだり歩くこ​​とができないまで、10〜15分間冷蔵庫に虫かごで10-15ミツバチを麻酔。その後、氷の上にミツバチを移動し、5分間氷上で麻酔を完了します。
      注：これは、麻酔を達成するために、合計15〜20分程度かかります。麻酔時間を短縮する必要がある場合は、ケージ内の蜂の数は、ケージ当たり1-3蜂に減少させるべきです。
   2. ハサミやピンセットで身体から頭を解剖。ピンとペトリ皿に置い歯科用ワックスに頭を固定します。ヘッドを固定するためのアンテナのベースに2つのピンを挿入します。昆虫生理食塩水（130のNaCl、5mMのKCl、1mMのCaCl ₂を）に固定されたヘッドを浸します。
   3. 双眼顕微鏡下で微細なピンセットやメスを使用してヘッドのキューティクルの前面を削除します。
      注：HPGsは簡単にCを除去した後の頭の中で見つけることができますuticle。 HPGは、頭の中で脳の周りに存在するブドウ状の器官です。
   4. キューティクルの下に白い膜状の組織である気管組織を削除します。そして、ゆっくりとピンセットでそれらを引いて、頭からHPGsを分析。
   5. 「開発」として大きな円形腺房でHPGsを分類します。 「縮んだ」として、小と歪んだ腺房でHPGsを分類します。 HPGsが「中級」としていずれも「開発」や「縮んだ 'に対応する分類。
      注：HPG状態のこれらの3つのクラスが示す代表的な写真を図2に示されています。
   6. 件名は「開発​​」およびRNA抽出に「収縮」HPGs」看護師蜂HPGs」と「飼料収穫機HPGs」として、それぞれ、および看護師のミツバチと飼料収穫機（セクション4）との間にHPGsにおける遺伝子発現を比較します。

20Eの2インジェクション

1. DESCRのような典型的なコロニーからの看護師蜂を収集手順1.6.1でibed。
   注意：ミツバチを飼育するようHPGsは、これらの蜂で調べることができません。
2. （ない氷上で）冷蔵庫内で4℃でハチを麻酔。
   注：これは、麻酔を達成するの​​に約30分かかります。麻酔時間が短縮されている場合は、ケージ内の蜂の数は、ケージ当たり1-3蜂に減少させるべきです。
3. ピンセットを使用して、ペトリ皿に置かれた歯科用ワックスのハチを固定します。
4. ガラス針プラーを用いて較正キャピラリーマイクロピペットから作られた噴射口を使用して、ヘッドの前面に20E溶液1μlを注入します。
   1. エタノール昆虫生理食塩水に（130のNaCl、5mMのKCl、1mMのCaCl ₂を）混合物20Eを溶解させ（1：4）を2.5μgに/μL。
   2. ゴムチューブに注入チップを接続し、チューブの反対側に黄色のマイクロピペットチップを接続します。
   3. マイクロピペットを用いてパラフィルム上20E溶液1μlを置き、口の中で黄色のマイクロピペットチップを保持し、噴射口の中にソリューションを描くdは。
   4. アンテナのベースへの注入先端を挿入し、黄色のマイクロピペットチップを吹き抜けることにより溶液を注入します。
      注：この手順に示されているプロトコルは、代表的な注入方法であるが、自動化された射出成形機の使用は、安全性、必要に応じて²⁰のために推奨されます。
5. リアは、1または3日間、暗くて湿った条件（> 60％の相対湿度）下で33-36℃で昆虫のケージ内に注入ミツバチ（理想的な温度は35℃です）。供給蜂蜜 - 水混合物（1：1）ミツバチします。必要に応じて、注射後にミツバチを存続数えます。

メトプレンの3.アプリケーション

1. すべての付着大人のミツバチをブラシで除去された後、典型的なコロニーから蛹が含まれている櫛を収集します。 33-36℃で櫛をインキュベート1日までのために湿度の高い条件で（> 60％の相対湿度）（理想的な温度は35℃です）。
2. は収集櫛から新たに登場蜂を収集し、単一コホートコロニーを調製するためのプロトコルに記載されているようにポスターの塗料を使用してthoraxの複数形にペイントマークを適用します。そのコロニーにマークされたミツバチを返します。
3. 6日後、コロニーから（6日齢）塗装労働者を集めます。ピンセットでそのthoraxの複数形を保持することによって櫛から描いた労働者をピックアップ。
4. 手順2.2のように（ない氷上で）冷蔵庫内で4℃でハチを麻酔。ピンセットを使用して、ペトリ皿に置い歯科用ワックスにミツバチを固定化し、マイクロピペットを用いて頭にアセトンに溶解メトプレン液の1-5μlの（50-250μgの/μl）を適用します。アセトンに耐性のあるフィルターチップを使用してください。
   注意：アセトンは死に至るミツバチに有害な影響を与えることがあります。ミツバチの高い死亡率が観察される場合には、最低でも1μlのアセトンの量の減少が推奨されます。
5. リア33-​​36℃で昆虫のケージでミツバチ（理想トンemperatureは暗く、湿気の多い条件下で7日間35°C）（> 60％の相対湿度）です。供給蜂蜜 - 水混合物（1：1）ミツバチします。必要に応じて、局所適用後にミツバチを存続数えます。
   注：この記事では、生き残った蜂が7日、アプリケーション（ 表3）の後にカウントされます。

4. RNA抽出および定量的RT-PCR

1. ハチを麻酔し、1.7.4へのステップ1.7.1で説明したようにHPGsを分析。
2. 使用するまで-80℃でドライアイスとストアのマイクロ遠心チューブ内の解剖HPGsを収集します。
3. タンパク質の変性用試薬の400μlのを追加します。
   注：この試薬 ​​は（ 材料の表を参照）は、市販されています。
4. マイクロチューブの内側に収まる均質化乳棒で手持ち電動ミキサーを使用して、HPG組織をホモジナイズします。組織細胞を破壊し、溶解し、氷上で1分間約300回転の回転速度で均質化します。
   注：手持ち電動ミキサーは市販されている（ 材料の表を参照してください）。
5. 80μlのクロロホルムを加え、よく混ぜます。 RTで5分間インキュベートします。
6. 4℃で15分間、14170×gでマイクロ遠心チューブを遠心。新しいチューブに水相を転送します。等量のイソプロパノールを加え、1μlのグリコーゲン（5 mg / mlで）。少なくとも20分間-20℃でインキュベートします。
7. 4℃で10分間14170×gでマイクロ遠心チューブを遠心し、上清を除去します。
8. ペレットに75％エタノール400μlを添加して、よく混ぜ、4℃で15分間14170×gでマイクロ遠心チューブを遠心し、上清を除去します。もう一度これらの手順を繰り返します。
9. 5-10分間ペレットを空気乾燥した後、10μlのRNaseフリー水に溶解します。
   注：ペレットの完全な乾燥は水にRNAペレットの不溶化を引き起こす可能性があります。このように、少し濡れているペレットに適しています溶解。
10. 光度計または類似のような分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。
11. 任意の混入したゲノムDNAを分解するために、37℃で30分間インキュベートすることによってDNアーゼIの2.0 Uで500ngの全RNAを扱います。
12. -逆転写のDNase I処理したRNA 200ngのをし、市販のキットを用いてリアルタイムPCRを行い、遺伝子特異的プライマー（mrjp2（材料および試薬の表でリストを参照）; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 '、および5 「-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3 '、HBG3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3'および5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3 '）。次のようにPCRを実行します。[95℃×30秒+（95℃×5秒間+ 60℃×15秒間+ 72℃×20秒）45-55サイクルをX]。
13. 延長因子1α-F2（EF1α˗F2）またはリボソームタンパク質^{49（rp49）9,16,21,22}のそれと転写産物の量を正規化します。これらの遺伝子は、信頼性の高い制御グラムです定量RT-PCRを用いてHPGsにおける遺伝子発現を分析するためのエン。
14. 統計ソフトウェアを使用して、2つの実験群（看護師蜂対早熟飼料収穫機、制御蜂対20E処理された蜂、および制御蜂対メトプレン処理されたハチ）との間に有意な差を検出するために両側t検定を実行します。
    注：F検定は分散の均一性を仮定した場合、スチューデントのt検定を使用することができます。そうでない場合、ウェルチのt検定を使用することができます。

結果

単一コホートコロニーを調製するための手順の概要を、図1Aに示されています。サンプルコレクションに単一コホートコロニーを調製から実験の時間経過を、 図1Bに示されています。看護の動作や採餌行動のための行動基準を満たした労働者は、シングルコホートコロニーから回収し、HPGの開発はこれらの労働者に推定された表1は、3

ディスカッション

シングルコホートコロニーの調製

ここでは、働きバチの役割の変化に関連したHPG生理学の分析のための単一のコホートのコロニーを準備するために私たちの以前の研究¹⁶で使用されるプロトコルを説明しました。手順1.6から1.7と図2に記載された基準を満たした看護師蜂と早熟飼料収穫機は、シングルコホートコロニー（ 表1）で観察され?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
UNIPOSCA	Mitsubishi pencil	PC-5M	Marker pen for the application of marks to bees
20-hydroxyecdysone	Sigma Aldrich	H5142
Methoprene	Sigma Aldrich	33375
Breeding case insect	IRIS OHYAMA	CP-SS
Electromotion mixier	ISO	23M-R25	homogenization of tissue
TRIZol Reagent	Invitrogen	15596-026	the reagent for total RNA extraction
DNase I	Takara	2270A
PrimeScript RT reagent kit	Takara	RR037A	the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II	Takara	RR820A	the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument	Roche	12011468001	the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl)	Roche	4929292001	the material for real-time PCR