Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino

Resumo

Aqui nós descrevemos nosso protocolo detalhado para a preparação de colônias de abelhas-coorte único - uma ferramenta útil para analisar a fisiologia trabalhador associada à função. Descrevemos também protocolos detalhados para o tratamento de trabalhadores com hormônio juvenil e ecdisona para avaliar o envolvimento desses hormônios na regulação do comportamento do trabalhador e / ou fisiologia.

Resumo

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Introdução

A abelha europeia, Apis mellifera, é um inseto eusocial com uma sociedade altamente organizada ^1. Abelhas operárias (casta de trabalho) estão envolvidos em várias tarefas para manter a atividade colônia, e estas tarefas mudar de acordo com a idade da abelha trabalhador após a eclosão, o que é referido como a divisão relacionada com a idade do trabalho ^2-4. Os trabalhadores jovens (<13 dias de idade) cuidar da ninhada na colmeia através da secreção de geléia real (abelhas enfermeira), enquanto os trabalhadores mais velhos (> 15 dias de idade) recolhem o néctar e pólen fora da colméia (forrageiras) ^2-4. A fisiologia dos trabalhadores muda em associação com esta mudança de papel. Por exemplo, a função das glândulas hipofaringe (HPGS), emparelhado glândulas exócrinas localizadas na cabeça, alterações em associação com a mudança de papel a partir de enfermagem para forrageamento ^2,5. HPGS enfermeira abelha sintetizar principalmente principais proteínas da geléia real, que são os principais componentes do leite de abelha. Por outro lado, HPGS de forrageiras, principalmente,sintetizar enzimas metabolizadoras de hidratos de carbono, tais como α-glucosidase III, para processar néctar em mel através da conversão de sacarose em glicose e frutose. Os nossos estudos anteriores revelaram que a expressão de mrjp2, que codifica uma proteína principal da geleia real, e Hbg3, que codifica α-glucosidase III, alterações durante o deslocamento papel ^6-9.

Para determinar se as alterações fisiológicas dos tecidos de trabalho, incluindo as HPGS, está associada com a mudança de papel ou com a idade dos trabalhadores, seria útil para manipular a composição da população de uma colónia de abelhas, tal como para preparar uma única coorte colónias em que os trabalhadores de quase a mesma idade executar diferentes tarefas ^10,11. Robinson et al. (1989) descreveram um método para o estabelecimento de uma colónia única de ^10-coorte. colónias-coorte único compreendem inicialmente uma rainha e 0-2 dia os trabalhadores de idade. Vários dias depois de estabelecer as colônias, os trabalhadores de almost a mesma idade assumir diferentes tarefas. Alguns trabalhadores executar tarefas de enfermagem como em colónias típicas, enquanto outros trabalhadores executar tarefas de forrageamento mais cedo do que o habitual e são assim chamados forrageiras precoces. Comparações de expressão genética entre as abelhas de enfermagem e forrageiras precoces iria fornecer informações úteis sobre a fisiologia associada ao papel dos tecidos trabalhador ^12-16. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de colónias-coorte único para análise da fisiologia de papéis e / ou associada à idade de HPGS ^16. Também descrevemos brevemente como analisar a expressão gênica de mrjp2 e Hbg3 por quantitativa reação em cadeia de polimerase reversa (RT-PCR) para avaliar HPG fisiologia.

Para além da análise de fisiologia trabalhador em colónias-coorte único, o exame do sistema endócrino é importante para analisar os mecanismos de regulação da fisiologia associada trabalhador-papel. hormônio juvenil (JH), que é known como o hormônio 'status quo' em larvas de insetos, acelera a mudança no papel da enfermagem para forrageamento de abelhas operárias ^11. Além disso, de ecdisona, que é conhecida como a hormona de muda durante a metamorfose, podem estar envolvidos na mudança de papel como genes que codificam para moléculas de sinalização de ecdisona são expressas nos corpos de cogumelo, um centro superior do cérebro trabalhador ^17-19. Por isso, também descrevem o protocolo detalhado utilizado no nosso estudo anterior ¹⁶ para tratar os trabalhadores com 20E, que é uma forma activa de ecdisona, e metopreno, um análogo de JH, para análise do efeito do sistema endócrino em HPG fisiologia (expressão de mrjp2 e Hbg3).

Protocolo

1. Preparação de colónias-coorte Individual

1. Prepare três colônias de abelhas para criar duas colónias-coorte único e obter um número suficiente de trabalhadores recém-emergidas.
   1. Verifique se algum pupas nas células periféricas tampadas nos favos, tem olhos castanhos e uma cutícula pigmentada abrindo os pentes tampado com uma pinça. Se existem essas pupas em células pente periféricos, a maioria das pupas em todo o pentes vão surgir em cerca de 1-3 dias.
   2. Posteriormente, recolher os favos que contenham esses pupas depois de todas as abelhas adultas aderentes foram removidas com uma escova, e misture pentes das três colónias para minimizar a variabilidade entre as colônias.
2. Coloque os pentes recolhidos em uma caixa colmeia vazia e incubar a 33 ° C sob condições de umidade (> 60% de umidade relativa). Recolher cerca de 6.000 trabalhadores recém-emergidas durante 3 dias (3.000 trabalhadores por colónia) dos pentes recolhidos.
3. Determinar a quantidade de workers com base no peso de cinco trabalhadores recém-emergidas coletadas aleatoriamente a partir de colónias não manipuladas.
   1. Pesar cinco trabalhadores recém-emergidas recolhidos aleatoriamente a partir de colónias não manipuladas utilização de máquinas de pesagem.
      Nota: O peso de cinco trabalhadores recém-emergidas é geralmente 500-600 mg.
   2. Estimar a quantidade de trabalhadores recolhidos pela divisão do peso dos trabalhadores recolhidos pelo peso médio de cinco trabalhadores recém-emergidas.
4. Aplicar marcas de tinta para as thoraces de cerca de 1.800 trabalhadores (900 trabalhadores por colônia), utilizando marcadores de tinta à base de água poster.
   Nota: marcador lavável, que é usada para aplicar a tinta está listada na tabela de materiais.
5. Introduzir uma rainha e aproximadamente 3.000 dos trabalhadores 0-2 dias de idade para uma nova caixa de colmeia que contém dois pentes, um pente contendo mel e pólen como conservas e outro pente vazio para postura de ovos pela rainha. Recolher o pente contendo mel e pólen from outra colônia unmanipulated depois de todas as abelhas aderentes são removidas.
   Nota: O uso da caixa de ramificação nuclear (caixa pequena colmeia tamanho) é recomendado.
6. Recolher as abelhas de enfermagem e forrageiras precoces com marcas de tinta de 6 a 8 dias após a criação de colónias-coorte único.
   1. Para a coleta de abelhas enfermeira, pegar os trabalhadores que colocam suas cabeças em células pente para cuidar da prole. Use uma pinça para recolher as abelhas enfermeira de pentes que contêm muitos trabalhadores de cria e adultos.
      Nota: Se HPGS de trabalhadores recolhidos são desenvolvidas quando dissecado tal como descrito na etapa 1.7, estes trabalhadores são definidos como abelhas enfermeira. Segurando as thoraces por pinças é recomendado para pegar os trabalhadores dos favos.
   2. Para a coleta de forrageiras, utilize uma rede de insetos para capturar os trabalhadores que retornam para suas colméias com cargas de pólen em suas pernas traseiras.
      Nota: Se HPGS dos trabalhadores capturados aparecem quando encolhido dissecado tal como descrito no passo 1.7, os trabalhadores são definidos como forrageiras.
7. clasSIFY o HPG em três grupos, "desenvolvidos", "intermediário" e "encolhida" pela dissecção sob microscópio estereoscópico.
   1. Anestesiar 10-15 abelhas em uma gaiola de inseto em uma geladeira por 10-15 minutos até que as abelhas não podem voar ou a pé. Em seguida, mover-se sobre gelo e abelhas completar a anestesia em gelo durante 5 min.
      Nota: Demora cerca de total de 15-20 minutos para alcançar a anestesia. Se o tempo de anestesia deve ser reduzido, o número de abelhas em uma gaiola deve ser reduzida para 1-3 por gaiola abelhas.
   2. Dissecar a cabeça do corpo com tesouras e pinças. Fixar a cabeça em cera dental colocado em uma placa de Petri com alfinetes. Inserir dois pinos para as bases das antenas para fixar a cabeça. Soak cabeças fixas em solução salina de insectos (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM _CaCl2).
   3. Remover o aspecto anterior da cutícula da cabeça utilizando uma pinça fina e uma faca cirúrgica sob um microscópio binocular.
      Nota: Os HPGS podem ser facilmente encontrados na cabeça após a remoção de Cuticle. A HPG é um órgão botrióide que existe em torno do cérebro na cabeça.
   4. Remover o tecido traqueal, que é um tecido membranoso branco sob a cutícula. Então, dissecar os HPGS da cabeça, puxando-os lentamente com uma pinça.
   5. Classificar HPGS com ácinos grande e circular como "desenvolvido". Classificar HPGS com pequena e distorcida ácinos como 'encolhido'. Classificar HPGS correspondente a nenhum "desenvolvido" nem "encolhida" como "intermediário".
      Nota: Fotografias representativas que mostram estas três classes de estados HPG são indicados na Figura 2.
   6. Assunto "desenvolvido" e HPGS 'Shrunken' para extração de RNA como 'enfermeira abelha HPGS' e 'HPGS de forrageiras ", respectivamente, e comparar a expressão do gene nos HPGS entre abelhas de enfermagem e forrageiras (Seção 4).

2. Injecção de 20E

1. Recolha abelhas enfermeira de colónias típicas como described no procedimento 1.6.1.
   Nota: HPGS não pode ser examinada nessas abelhas como as abelhas serão criados.
2. Anestesiar as abelhas a 4 ° C num frigorífico (não em gelo).
   Nota: Demora cerca de 30 min para conseguir anestesia. Se o tempo de anestesia é reduzido, o número de abelhas na gaiola deve ser reduzida para 1-3 abelhas por gaiola.
3. Com uma pinça, imobilizar as abelhas em cera dental colocados em uma placa de Petri.
4. Injectar 1 ul de uma solução 20E no aspecto anterior da cabeça utilizando uma ponta de injecção feita a partir de uma micropipeta capilar calibrado usando um extractor de agulha de vidro.
   1. Dissolve-se em solução salina de etanol 20E-inseto (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, CaCl ₂ 1 mM) mistura (1: 4) a 2,5 ug / ul.
   2. Ligue a ponta de injecção para um tubo de borracha, e ligar uma ponta de micropipeta de amarelo para o lado oposto do tubo.
   3. Coloque 1 ml de solução 20E em parafilme utilizando uma micropipeta, segure a ponta da micropipeta amarelo na boca, umd desenhar a solução para a ponta de injecção.
   4. Inserir a ponta de injecção para a base da antena, e injectar a solução por sopro através da ponta da micropipeta amarelo.
      Nota: O protocolo mostrado neste passo é o método de injecção representativo, mas o uso da máquina de injecção automatizado é recomendado para a segurança como necessário ^20.
5. Traseira as abelhas injetados em gaiolas de insetos em 33-36 ° C (a temperatura ideal é de 35 ° C) em condições escuras e úmidas (> 60% de umidade relativa) durante 1 ou 3 dias. Fornecimento mistura mel-água (1: 1) para as abelhas. Se necessário, a contagem de sobreviventes abelhas após a injecção.

3. Aplicação de Methoprene

1. Recolher os favos que contêm pupas de colónias típicas depois de todas as abelhas adultas aderentes são removidas com uma escova. Incubar os pentes de 33-36 ° C (a temperatura ideal é de 35 ° C) em condições húmidas (> 60% de humidade relativa) durante 1 dia.
2. Recolha abelhas recém-emergidas dos pentes recolhidos e aplicar marcas de tinta para os seus thoraces usando tinta cartaz como descrito no protocolo para a preparação de colónias-coorte único. Retornar as abelhas marcadas para suas colônias.
3. Após 6 dias, recolher trabalhadores pintadas (6 dias de idade) a partir das colónias. Pegar trabalhadores pintadas dos pentes, mantendo suas thoraces com uma pinça.
4. Anestesiar as abelhas a 4 ° C num frigorífico (não em gelo) como no procedimento 2.2. Usando pinças, imobilizar as abelhas em cera dental colocados numa placa de Petri e aplicar 1-5 uL de uma solução de metopreno (50-250 mg / mL) dissolvido em acetona para as suas cabeças utilizando uma micropipeta. Utilizar uma ponta de filtro que é resistente à acetona.
   Nota: Acetona pode ter efeitos nocivos sobre as abelhas, levando à morte. Se é observada a uma elevada mortalidade de abelhas, a redução do volume de acetona para 1 ml no mínimo é recomendado.
5. Traseira as abelhas em gaiolas de insetos em 33-36 ° C (o ideal temperature é de 35 ° C) durante 7 dias sob condições escuros e úmidos (> 60% de umidade relativa). Fornecimento mistura mel-água (1: 1) para as abelhas. Se necessário, a contagem de sobreviventes abelhas após a aplicação tópica.
   Nota: Neste artigo, abelhas sobreviventes são contadas 7 dias após a aplicação (Tabela 3).

4. Extracção de ARN e RT-PCR quantitativo

1. Anestesiar abelhas e dissecar HPGS como descrito nos passos 1.7.1 a 1.7.4.
2. Recolher os HPGS dissecados em um tubo de microcentrifugadora em gelo seco e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
3. Adicionar 400 ul de reagente para a desnaturação da proteína.
   Nota: Este reagente está comercialmente disponível (ver a tabela de materiais).
4. Homogeneizar os tecidos HPG usando uma mão batedeira com um pilão de homogeneização que se encaixa dentro de um tubo de microcentrífuga. Homogeneizar a uma velocidade de rotação de aproximadamente 300 rpm durante 1 min em gelo para quebrar e lisam células de tecido.
   Nota: A batedeira de mão está disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
5. Adicionar 80 ul de clorofórmio e misture bem. Incubar durante 5 min à TA.
6. Centrifugar os tubos de microcentrífuga a 14170 xg durante 15 min a 4 ° C. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Adicionar um volume igual de isopropanol e 1 ul de glicogénio (5 mg / ml). Incubar a -20 ° C durante pelo menos 20 min.
7. Centrifugar os tubos de microcentrífuga a 14170 xg durante 10 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.
8. Adicionar 400 ul de etanol a 75% ao sedimento e misturar bem, centrifugar os tubos de microcentrífuga a 14170 xg durante 15 min a 4 ° C, e remover o sobrenadante. Repita estes procedimentos mais uma vez.
9. Ar seco o sedimento durante 5-10 min e depois dissolvê-lo em 10 de água livre de RNase mL.
   Nota: a secagem completa do pelete pode causar insolubilização do sedimento de ARN em água. Assim, o sedimento que é ligeiramente molhado é apropriado paradissolução.
10. Medir a concentração de RNA usando um espectrofotómetro, tal como NanoDrop ou semelhante.
11. Tratar 500 ng de ARN total com 2,0 U de ADNase I por incubação a 37 ° C durante 30 minutos para degradar qualquer ADN genómico contaminante.
12. Reverse-transcrever 200 ng de ARN tratado com ADNase I e realizar PCR em tempo real utilizando kits disponíveis comercialmente (ver a lista na Tabela de Reagentes e Materiais) e iniciadores específicos do gene (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', e 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'e 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Executar a PCR como se segue: [95 ° C x 30 seg + (95 ° C x 5 segundos + 60 ° C x 15 seg + 72 ° C x 20 seg) x 45-55 ciclos].
13. Normalizar a quantidade de transcrição com o do factor de elongação 1α-F2 (EF1α˗F2) ou ribosomal da proteína 49 (rp49) ^9,16,21,22. Estes genes são o controle confiável genos para analisar a expressão do gene nas HPGS utilizando qRT-PCR.
14. Execute bicaudal t-teste para detectar as diferenças significativas entre dois grupos experimentais (abelhas enfermeira vs. forrageiras precoces, abelhas tratadas-20E contra as abelhas de controle, e as abelhas tratadas com methoprene vs. abelhas controle) usando o software estatístico.
    Nota: Se o teste F assume a homogeneidade da variância, teste t de Student pode ser usado. Se não, o teste t de Welch pode ser usado.

Resultados

Uma visão geral do protocolo para a preparação de colónias-coorte único é ilustrado na Figura 1A. Tempo-decorrer de experiências de preparação de colónias-coorte único da recolha da amostra é mostrado na Figura 1B. Trabalhadores que satisfizeram os critérios comportamentais para o comportamento de enfermagem ou de comportamento de forrageamento foram coletados a partir de colónias-coorte único, e desenvolvimento HPG foi estimado nesses tra...

Discussão

Preparação de colónias-coorte única

Aqui descrevemos o protocolo utilizado em nosso estudo anterior ¹⁶ para preparar colónias-coorte único para análise da HPG fisiologia associada com a mudança no papel das abelhas operárias. Abelhas de enfermagem e forrageiras precoces que satisfizeram os critérios descritos nos procedimentos de 1,6-1,7 e Figura 2 foram observadas nas colônias-coorte único (Tabela 1). As fotografias da Figura ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
UNIPOSCA	Mitsubishi pencil	PC-5M	Marker pen for the application of marks to bees
20-hydroxyecdysone	Sigma Aldrich	H5142
Methoprene	Sigma Aldrich	33375
Breeding case insect	IRIS OHYAMA	CP-SS
Electromotion mixier	ISO	23M-R25	homogenization of tissue
TRIZol Reagent	Invitrogen	15596-026	the reagent for total RNA extraction
DNase I	Takara	2270A
PrimeScript RT reagent kit	Takara	RR037A	the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II	Takara	RR820A	the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument	Roche	12011468001	the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl)	Roche	4929292001	the material for real-time PCR