Preparazione di singole colonie-coorte e trattamento ormonale di lavoratore api per analizzare Fisiologia associati con il ruolo e / o sistema endocrino

Riepilogo

Qui si descrive il nostro protocollo dettagliato per la preparazione di colonie di api singola coorte - uno strumento utile per analizzare la fisiologia dei lavoratori di ruolo associati. Descriviamo anche protocolli dettagliati per il trattamento di lavoratori con ormone giovanile e ecdysone per valutare il coinvolgimento di questi ormoni nella regolazione del comportamento dei lavoratori e / o la fisiologia.

Abstract

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Introduzione

L'ape europea, Apis mellifera, è un insetto eusocial con una società altamente organizzata ^1. Api operaie (casta lavoro) sono impegnati in varie attività per mantenere l'attività delle colonie, e questi compiti cambiano a seconda dell'età del lavoratore api dopo eclosion, che viene indicato come divisione relativa all'età del lavoro ^2-4. Lavoratori giovani (<13 giorni) si prendono cura della nidiata nell'alveare secernendo pappa reale (api nutrici), mentre i lavoratori più anziani (> 15 giorni) raccolgono il nettare e il polline di fuori dell'alveare (raccoglitori) ^2-4. La fisiologia dei lavoratori cambia in associazione con questo spostamento ruolo. Ad esempio, la funzione delle ghiandole ipofaringee (HPGs), accoppiato ghiandole esocrine situati nella testa, i cambiamenti in associazione con il passaggio da ruolo infermieristico a foraggiare ^2,5. HPGs infermiera ape sintetizzano principalmente principali proteine ​​pappa reale, che sono i principali componenti di latte api. D'altra parte, HPGs falciatrici principalmentesintetizzare enzimi carboidrati metabolizzare, come α-glucosidasi III, per elaborare nettare miele convertendo saccarosio in glucosio e fruttosio. I nostri studi precedenti hanno rivelato che l'espressione di mrjp2, che codifica per una proteina importante pappa reale, e Hbg3, che codifica α-glucosidasi III, i cambiamenti durante il turno ruolo di ^6-9.

Per determinare se i cambiamenti fisiologici nei tessuti lavoratore, compresi i HPGs, è associato con lo spostamento ruolo o con l'età dei lavoratori, sarebbe utile per manipolare la composizione della popolazione di una colonia di api, ad esempio per preparare singolo coorte colonie in cui i lavoratori di quasi la stessa età di eseguire diversi compiti ^10,11. Robinson et al. (1989) ha descritto un metodo per stabilire un singolo-coorte colonia ^10. colonie singola coorte inizialmente comprendono una regina e vecchi operai 0-2 al giorno. Alcuni giorni dopo aver stabilito le colonie, i lavoratori di almost la stessa età assumere compiti diversi. Alcuni lavoratori svolgono compiti di cura, come nelle colonie tipiche, mentre altri lavoratori eseguire le attività di foraggiamento prima del solito e sono quindi chiamati raccoglitori precoci. Il confronto di espressione genica tra api nutrici e raccoglitori precoci potrebbero fornire informazioni utili sulla fisiologia di ruolo associata dei tessuti dei lavoratori ^12-16. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di colonie singola coorte per l'analisi della fisiologia di ruolo e / o età-associate di HPGs ^16. Abbiamo anche descrivere brevemente come esaminare l'espressione genica di mrjp2 e Hbg3 da reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa-quantitativa (RT-PCR) per valutare HPG fisiologia.

Oltre all'analisi della fisiologia dei lavoratori nelle colonie singola coorte, l'esame del sistema endocrino è importante per analizzare i meccanismi di regolazione di ruolo associata la fisiologia dei lavoratori. ormone giovanile (JH), che viene known come l'ormone 'status quo' in larve di insetti, accelera lo spostamento nel ruolo da infermieristico per l'alimentazione delle api operaie a ^11. Inoltre, ecdysone, che è conosciuto come l'ormone della muta durante la metamorfosi, potrebbe essere coinvolto nel passaggio ruolo di geni che codificano per molecole di segnalazione ecdysone sono espressi nei corpi di funghi, un più alto centro del cervello operaio ^17-19. Pertanto, abbiamo anche descritto il protocollo dettagliato utilizzato nel nostro studio precedente ¹⁶ per trattare i lavoratori con 20E, che è una forma attiva di ecdysone e metoprene, un analogo JH, per l'analisi degli effetti del sistema endocrino sulla HPG fisiologia (espressione mrjp2 e Hbg3).

Protocollo

1. Preparazione di singole colonie-coorte

1. Preparare tre colonie di api per la creazione di due colonie singola coorte e per ottenere un numero sufficiente di lavoratori nuovi emersi.
   1. Verificare che alcune pupe nelle cellule periferiche innevate nei favi ha occhi marroni e una cuticola pigmentato aprendo i pettini innevate con una pinzetta. Se sono presenti queste pupe in cellule pettine periferici, la maggior parte pupe in tutta la pettini emergerà in circa 1-3 giorni.
   2. Successivamente, raccogliere i pettini che contengono queste pupe dopo tutte le api adulte aderenti sono stati rimossi con una spazzola, e mescolare i pettini delle tre colonie di ridurre al minimo la variabilità tra le colonie.
2. Posizionare i pettini raccolti in una scatola vuota alveare e incubare a 33 ° C in condizioni di umidità (> 60% di umidità relativa). Raccogliere circa 6.000 lavoratori nuovi emersi nel corso di 3 giorni (3.000 lavoratori per colonia) dai pettini raccolti.
3. Determinare la quantità di workeRS sulla base del peso di cinque operai recentemente emersi raccolti in modo casuale dalle colonie non manipolata.
   1. Pesare cinque lavoratori nuovi emersi raccolti in modo casuale da colonie non manipolate con macchine di pesatura.
      Nota: Il peso di cinque operai recentemente emersi è generalmente 500-600 mg.
   2. Stima la quantità di lavoratori raccolti dividendo il peso dei lavoratori raccolti dal peso medio di cinque lavoratori nuovi emersi.
4. Applicare segni di vernice alle thoraces di circa 1.800 lavoratori (900 operai per colonia) utilizzando marcatori vernice poster a base d'acqua.
   Nota: marcatore lavabile che viene utilizzato per applicare la vernice è elencato nella tabella dei materiali.
5. Introdurre una regina e circa 3.000 delle vecchie lavoratori 0-2 al giorno per una nuova casella alveare che contiene due pettini, un pettine di miele e polline come conserve e un altro pettine vuoto per la deposizione delle uova dalla regina. Raccogliere il pettine di miele e polline from un'altra colonia non manipolata dopo tutte le api aderenti vengono rimossi.
   Nota: Si consiglia l'uso della scatola alveare nucleare (piccola scatola alveare dimensioni).
6. Raccogliere api nutrici e raccoglitori precoci con vernice segna 6 a 8 giorni dopo la creazione di colonie singola coorte.
   1. Per raccogliere le api infermiere, raccogliere i lavoratori che mettono le loro teste nelle cellule pettine per prendersi cura della covata. Utilizzare le pinzette per raccogliere le api infermiere da pettini che contengono molti lavoratori covata e adulti.
      Nota: Se HPGs dei lavoratori raccolti sono sviluppate quando sezionato come descritto al punto 1.7, questi lavoratori sono definiti come api nutrici. Tenendo le thoraces di pinzette si raccomanda di raccogliere i lavoratori dai favi.
   2. Per raccogliere raccoglitori, utilizzare una rete per catturare insetti lavoratori che ritornano ai loro alveari con carichi di polline sulle zampe posteriori.
      Nota: Se HPGs dei lavoratori catturati appare rimpicciolita quando sezionato come descritto al punto 1.7, questi lavoratori sono definiti come raccoglitori.
7. ClasSify l'HPG in tre gruppi, 'sviluppato', 'intermedi', e 'Shrunken' dalla dissezione sotto uno stereomicroscopio.
   1. Anestetizzare 10-15 api in una gabbia insetto in frigorifero per 10-15 minuti fino a quando le api non possono volare o camminare. Quindi spostare api su ghiaccio e completare l'anestesia in ghiaccio per 5 min.
      Nota: Ci vogliono circa 15-20 minuti in totale per ottenere l'anestesia. Se il tempo di anestesia deve essere ridotto, il numero di api in una gabbia deve essere ridotto a 1-3 api per gabbia.
   2. Sezionare la testa dal corpo con le forbici e pinzette. Fissare la testa sulle impronte dentarie posto su una capsula di Petri con perni. Inserire due perni nelle basi delle antenne per fissare la testa. Mettere a bagno le teste fisse in soluzione salina insetto (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl _2).
   3. Rimuovere la faccia anteriore della cuticola della testa con una pinzetta fini e un bisturi al microscopio binoculare.
      Nota: I HPGs possono essere facilmente trovati in testa dopo la rimozione di cuticle. L'HPG è un organo botrioide che esiste intorno al cervello nella testa.
   4. Rimuovere il tessuto tracheale che è un tessuto membranoso bianca sotto la cuticola. Poi, sezionare i HPGs dalla testa tirandole lentamente con una pinzetta.
   5. Adesso HPGs con ampia e circolare acini come 'sviluppato'. Adesso HPGs con il piccolo e distorto acini come 'Shrunken'. Adesso HPGs corrispondente a nessuno 'sviluppato' né 'Shrunken' come 'intermedio'.
      Nota: fotografie rappresentativi che mostrano queste tre classi di HPG stati sono indicati in figura 2.
   6. Soggetto 'sviluppato' e HPGs 'Shrunken' per l'estrazione di RNA come 'infermiere api HPGs' e 'HPGs falciatrici', rispettivamente, e confrontare l'espressione genica nelle HPGs tra api nutrici e raccoglitori (sezione 4).

2. Iniezione di 20E

1. Raccogliere api nutrici da colonie tipiche come described nella procedura 1.6.1.
   Nota: HPGs non possono essere esaminate in queste api come saranno allevate le api.
2. Anestetizzare le api a 4 ° C in frigorifero (non su ghiaccio).
   Nota: Ci vogliono circa 30 minuti per raggiungere l'anestesia. Se il tempo di anestesia è ridotto, il numero di api nella gabbia deve essere ridotta a 1-3 api per gabbia.
3. Usando le pinzette, immobilizzare le api su impronte dentarie posti su una piastra di Petri.
4. Iniettare 1 ml di soluzione di 20E nella faccia anteriore della testa con una punta di iniezione a base di una micropipetta capillare calibrato con un estrattore ago di vetro.
   1. Sciogliere 20E in soluzione salina etanolo-insetto (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl ₂₎ miscela (1: 4) a 2,5 mg / mL.
   2. Collegare la punta di iniezione ad un tubo di gomma, e collegare una punta micropipetta giallo al lato opposto del tubo.
   3. Mettere 1 ml di soluzione di 20E su parafilm utilizzando una micropipetta, tenere la punta micropipetta gialla in bocca, und disegnare la soluzione nella punta di iniezione.
   4. Inserire la punta di iniezione nella base delle antenne, e iniettare la soluzione soffiando attraverso la punta micropipetta gialla.
      Nota: Il protocollo mostrato in questa fase è il metodo di iniezione rappresentante, ma l'uso della macchina per iniezione automatica è raccomandato per la sicurezza se necessario ^20.
5. Posteriore le api iniettati in gabbie di insetti a 33-36 ° C (la temperatura ideale è di 35 ° C) in condizioni di buio e umido (> 60% di umidità relativa) per 1 o 3 giorni. miscela di miele-acqua di alimentazione (1: 1) per le api. Se necessario, contare sopravvivenza delle api dopo l'iniezione.

3. Applicazione di Methoprene

1. Raccogliere i pettini che contengono pupe da tipiche colonie dopo tutte le api adulte aderenti vengono rimossi con un pennello. Incubare i pettini a 33-36 ° C (la temperatura ideale è di 35 ° C) in ambiente umido (> 60% di umidità relativa) fino a 1 giorno.
2. Raccogliere le api nuovi emersi dai favi raccolti e applico segni di vernice ai loro thoraces con vernice poster come descritto nel protocollo per la preparazione di colonie singola coorte. Riportare le api marcate nelle loro colonie.
3. Dopo 6 giorni, raccogliere i lavoratori verniciato (6 giorni di età) dalle colonie. Pick up lavoratori dipinte dai favi tenendo loro thoraces con una pinzetta.
4. Anestetizzare le api a 4 ° C in frigorifero (non su ghiaccio) come nella procedura 2.2. Usando le pinzette, immobilizzare le api su impronte dentarie posti su una piastra di Petri e applicare 1-5 ml di soluzione di methoprene (50-250 mg / mL) disciolto in acetone per le loro teste usando una micropipetta. Utilizzare una punta filtro che è resistente alla acetone.
   Nota: Acetone può avere effetti dannosi sulle api che portano alla morte. Se si osserva l'elevata mortalità delle api, si raccomanda la riduzione del volume di acetone per 1 ml al minimo.
5. Posteriore le api in gabbie di insetti a 33-36 ° C (la t idealeemperature è di 35 ° C) per 7 giorni in condizioni di buio e umido (> 60% di umidità relativa). miscela di miele-acqua di alimentazione (1: 1) per le api. Se necessario, contare sopravvivenza delle api dopo l'applicazione topica.
   Nota: In questo articolo, le api sopravvissute sono contati 7 giorni dopo l'applicazione (Tabella 3).

4. RNA Estrazione e RT-PCR quantitativa

1. Anestetizzare le api e sezionare HPGs come descritto nei punti 1.7.1 a 1.7.4.
2. Raccogliere le HPGs sezionato in una provetta in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
3. Aggiungere 400 ml di reagente per denaturazione proteica.
   Nota: Questo reagente è disponibile in commercio (si veda la tabella dei materiali).
4. Omogeneizzare i tessuti HPG con una mano tesa miscelatore elettrico con un pestello omogeneizzazione che si inserisce all'interno di una provetta. Omogeneizzare ad una velocità di rotazione di circa 300 rpm per 1 min in ghiaccio per rompere e cellule del tessuto Lisare.
   Nota: Il miscelatore elettrico tenuto in mano è disponibile in commercio (si veda la tabella dei materiali).
5. Aggiungere 80 ml di cloroformio e mescolare bene. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
6. Centrifugare le provette da microcentrifuga a 14.170 xg per 15 min a 4 ° C. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Aggiungere un volume uguale di isopropanolo e 1 ml di glicogeno (5 mg / ml). Incubare a -20 ° C per almeno 20 min.
7. Centrifugare le provette da microcentrifuga a 14.170 xg per 10 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
8. Aggiungere 400 ml di etanolo al 75% per il pellet e mescolare bene, centrifugare le provette da microcentrifuga a 14.170 xg per 15 min a 4 ° C, e rimuovere il surnatante. Ripetere queste procedure ancora una volta.
9. Far asciugare il pellet per 5-10 minuti e poi si dissolvono in 10 acqua priva di RNasi microlitri.
   Nota: essiccazione completa del pellet può causare insolubilizzazione del pellet di RNA in acqua. Così, il pellet che è leggermente surf è appropriato perdissoluzione.
10. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro come NanoDrop o simili.
11. Trattare 500 ng di RNA totale con 2.0 U di DNasi I incubando a 37 ° C per 30 min a degradare qualsiasi DNA genomico contaminante.
12. Reverse-trascrivere 200 ng di RNA DNasi I trattati ed eseguire real time PCR utilizzando kit disponibili in commercio (si veda l'elenco nella tabella dei materiali e reagenti) e primer gene-specifici (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 'e 5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 'e 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Eseguire la PCR come segue: [95 ° C x 30 sec + (95 ° C x 5 sec + 60 ° C x 15 sec + 72 ° C x 20 sec) x 45-55 cicli].
13. Normalizzare la quantità di trascrizione con quella del fattore di allungamento 1α-F2 (EF1α˗F2) o ribosomiale proteina 49 (rp49) ^9,16,21,22. Questi geni sono un controllo affidabile gEnes per l'analisi dell'espressione genica nelle HPGs con qRT-PCR.
14. Eseguire due code t-test per rilevare le differenze significative tra due gruppi sperimentali (api nutrici contro raccoglitori precoci, api 20E-trattati contro le api di controllo, e le api Methoprene trattati vs. api di controllo) utilizzando il software statistico.
    Nota: Se F-test assume l'omogeneità della varianza, test t può essere utilizzato. Se no, t-test di Welch può essere utilizzato.

Risultati

Una panoramica del protocollo per la preparazione di colonie singola coorte è illustrata nella Figura 1A. Time-corso di esperimenti da preparare colonie singola coorte di assaggiare collezione è mostrato in Figura 1B. I lavoratori che hanno soddisfatto i criteri di comportamento per il comportamento di cura o comportamento alimentare sono stati raccolti da colonie singola coorte, e lo sviluppo HPG è stata stimata in questi lavoratori tabella 1...

Discussione

Preparazione delle colonie singola coorte

Qui abbiamo descritto il protocollo utilizzato nel nostro studio precedente ¹⁶ per preparare colonie singola coorte per l'analisi di HPG fisiologia associata con lo spostamento nel ruolo di api operaie. Api bottinatrici infermiere e precoci che soddisfacevano i criteri descritti nelle procedure di 1.6-1.7 e la figura 2 sono stati osservati nelle colonie singolo di coorte (Tabella 1). Le fotografie in <...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
UNIPOSCA	Mitsubishi pencil	PC-5M	Marker pen for the application of marks to bees
20-hydroxyecdysone	Sigma Aldrich	H5142
Methoprene	Sigma Aldrich	33375
Breeding case insect	IRIS OHYAMA	CP-SS
Electromotion mixier	ISO	23M-R25	homogenization of tissue
TRIZol Reagent	Invitrogen	15596-026	the reagent for total RNA extraction
DNase I	Takara	2270A
PrimeScript RT reagent kit	Takara	RR037A	the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II	Takara	RR820A	the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument	Roche	12011468001	the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl)	Roche	4929292001	the material for real-time PCR