הכנת מושבות אחת-עוקבה טיפול הורמונלי של דבורי הדבש Worker לנתח Associated פיזיולוגיה עם תפקיד ו / או המערכת האנדוקרינית

Summary

כאן אנו מתארים הפרוטוקול המפורט שלנו לעריכת מושבות דבורים חד עוקבה - כלי שימושי לניתוח הפיסיולוגיה עובדת הקשורים התפקיד. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לטיפול עובדים עם הורמון נעורי ecdysone להעריך את המעורבות של הורמונים אלה בויסות התנהגות עובד ו / או פיזיולוגיה.

Abstract

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Introduction

דבורת הדבש האירופית, שהאפיס Apis, הוא חרק eusocial עם חברה מאורגנת מאוד ^1. דבורי עבודה (כת עבודה) עוסקים משימות שונות כדי לשמור על פעילות מושבה, ומשימות אלה לשנות בהתאם לגיל של דבורת הדבש עובד לאחר eclosion, אשר נקרא חלוקה הקשורות לגיל העבודה ^2-4. עובדים צעירים (<13 ימים) לטפל גוזלים בכוורת על ידי הפרשת מזון מלכות (דבורי אחות), ואילו עובדי מבוגרים (> 15 ימים) לאסוף צוף ואבקה מחוץ לכוורת (לקטים) ^2-4. הפיזיולוגיה של העובדים משתנה בשיתוף עם משמרת את התפקיד הזה. לדוגמא, הפונקציה של בלוטות hypopharyngeal (HPGs), לזווג בלוטות אקסוקרינית הממוקמות בראש, שינויים בשיתוף עם מעבר התפקיד מ סיעודי ליקוט ^2,5. HPGs דבורה מטפל בעיקר לסנתז חלבוני מזון המלכות גדולים, המהווים מרכיבים עיקריים של חלב דבורה. מצד השני, forager HPGs בעיקרלסנתז אנזימים חילוף חומרים של פחמימות, כגון-glucosidase α III, לעבד צוף לתוך דבש ידי המרת סוכרוז לגלוקוז ופרוקטוז. המחקרים הקודמים שלנו גילו כי הביטוי של mrjp2, מקודד חלבון מזון מלכות גדול, Hbg3, מקודד-glucosidase α III, שינויים במהלך תפקיד המשמרת ^6-9.

כדי לקבוע אם השינויים הפיסיולוגיים ברקמות העובד, לרבות HPGs, קשור בתפקיד המשמרת או עם הגיל של העובדים, זה יהיה שימושי כדי לתפעל את רכב האוכלוסייה של מושבת דבורת דבש, כגון להכין-עוקבה יחידה מושבות בה עובדים של כמעט בני אותו גיל לבצע משימות שונות ^10,11. רובינסון et al. (1989) תיאר שיטה להקמת מושבה אחת-עוקבה ^10. מושבות קוהורט יחיד בתחילה מהוות מלכה 0-2 יום עובדים ישנים. ימים ספורים לאחר הקמת המושבות, עובדי ALMost באותו הגיל להניח משימות שונות. חלק מהעובדים לבצע משימות סיעוד כמו במושבות טיפוסיות, ואילו עובדים אחרים לבצע משימות ליקוט מזון מוקדם מהרגיל ולכן נקראים לקטים מוקדמים. ג'ין השוואות ביטוי בין דבורי אחות לקטים מוקדמים תספקנה מידע שימושי על הפיסיולוגיה קשור התפקיד של רקמות עובדים ^12-16. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת מושבות-עוקבה אחת לניתוח של משחק תפקידים ו / או גיל הקשורים לפיזיולוגיה של HPGs ^16. כמו כן, אנו מתארים בקצרה כיצד לבחון את ביטוי הגנים של mrjp2 ו Hbg3 ידי תגובת שרשרת שעתוק-פולימראז הפוך כמותית (RT-PCR) להעריך פיזיולוגיה HPG.

בנוסף הניתוח של פיזיולוגיה עובד במושבות חד עוקבה, הבדיקה של מערכת האנדוקרינית חשובה לניתוח מנגנוני הוויסות של פיזיולוגיה עובדים הקשורים תפקיד. הורמון נעורים (JH), אשר known כמו ההורמון 'סטטוס קוו' ב זחלי חרקים, מאיץ את המעבר בתפקיד מ סיעוד לחפש מזון דבורים עובדים ^11. יתר על כן, ecdysone, אשר ידוע בתור הורמון השרה במהלך המטמורפוזה, עשוי להיות מעורב תפקיד המשמרת כמו גנים המקודדים מולקולות איתות ecdysone באים לידי ביטוי בגופי הפטריות, מרכז גבוה של המוח עובד ^17-19. לכן, אנו גם מתארים את הפרוטוקול המפורט השתמש במחקר הקודם שלנו ¹⁶ לטיפול עובדים עם 20E, שהינה בעלת צורה פעילה של ecdysone, ו methoprene, אנלוג JH, לניתוח של שפעת המערכת האנדוקרינית על פיזיולוגית HPG (ביטוי של mrjp2 ו Hbg3).

Protocol

1. הכנת מושבות אחת-עוקבה

1. כן שלוש מושבות דבורים ליצור שתי מושבות האחת-עוקבה להשיג מספר מספיק של עובדים יצאו זה עתה.
   1. בדקו כמה גלמים בתאים ההיקפיים כתרי המסרקים יש עיניים חומות לציפורן פיגמנט ידי פתיחת המסרקים כתרים באמצעות פינצטה. אם גלמים אלה קיימים בתאי מסרק פריפריה, רוב הגלמים של המסרקים כולה יצא ב כ 1-3 ימים.
   2. בהמשך לכך, לאסוף את המסרקים המכילים גלמים אלה אחרי הכל הדבורים הבוגרות החסידות הוסרו עם מברשת, ומערבבים מסרקים משלוש המושבות למזער שונה בין מושבות.
2. מניח את המסרקים שנאספו תיבת כוורת ריקה לדגור על 33 מעלות צלזיוס מתחת בתנאי לחות (לחות יחסית> 60%). אסוף כ -6,000 עובדים עתה הגיח מעל 3 ימים (3,000 עובדים לכל מושבה) ממסרקי שנאספו.
3. לקבוע את הכמות וורקrs לפי המשקל של חמישה פועלים עתה הגיח שנאספו באקראי ממושבות unmanipulated.
   1. לשקול חמש פועל עתה הגיח שנאספו באקראי ממושבות unmanipulated באמצעות ומכונות שקילות.
      הערה: המשקל של חמישה פועלים החדשים שנוצרו בסופו של דבר בדרך כלל 500-600 מ"ג.
   2. להעריך את כמות העובדים שנאספו על ידי חלוקת המשקל של העובדים שגבו המשקל הממוצע של חמישה פועל יצאו זה עתה.
4. החל סימני צבע על thoraces של כ -1,800 עובדים (900 עובדים לכל מושבה) באמצעות סמני צבע פוסטר על בסיס מים.
   הערה: סמן רחיץ אשר משמש כדי להחיל את הצבע מופיע בטבלה של חומרים.
5. הצג מלכה וכ -3,000 העובדים הישנים 0-2 היום לתיבת כוורת חדשה המכילה שני מסרקים, מנה אחת של דבש מסרק המכיל ואבקה כמו מזונות משומרים ועוד מסרק ריק הטלה ידי המלכה. אסוף את המסרק המכיל fr דבש ואבקת פרחיםom אחר מושבת unmanipulated אחרי כל הדבורים החסידים יוסרה.
   הערה: שימוש תיבת כוורת גרעינית (תיבת כוורת בגודל קטנה) מומלץ.
6. אסוף דבורי אחות לקטים מוקדמים עם סימני צבע 6 עד 8 ימים לאחר יצירת מושבות האחת-עוקבה.
   1. כדי לאסוף דבורי אומנות, להרים עובדים כי טמנו את ראשיהם לתוך תאים מסרקים לטפל של הגוזלים. להשתמש בפינצטה כדי לאסוף דבורי אחות מסרקים המכילים עובדים גוזלים ומבוגרים רבים.
      הערה: אם HPGs עובדים שנאספו מפותחים כאשר גזור כמתוארים בשלב 1.7, עובדים אלה מוגדרים דבורי אומנות. החזקת thoraces ידי פינצטה מומלץ להרים עובדים מהמסרקים.
   2. כדי לאסוף לקטים, השתמש נטו חרקים ללכוד עובדים לחזור הכוורות שלהם עם המון אבקה על רגליהם האחוריות.
      הערה: אם HPGs העובדים שנתפסו מופיעים מצומק כאשר גזור כמתואר בשלב 1.7, עובדים אלה מוגדרים הלקטים.
7. ClasSify HPG לשלוש קבוצות, 'פותח', 'ביניים', ו 'שהתכווץ' על ידי לנתיחה תחת סטראו.
   1. להרדים 10-15 דבורים בתוך כלוב חרקים במקרר למשך 10-15 דקות עד דבורים לא יכול לעוף או ללכת. לאחר מכן, להעביר דבורים על קרח ולהשלים את ההרדמה על קרח למשך 5 דקות.
      הערה: זה לוקח בערך 15-20 דקות בסה"כ להגיע להרדמה. אם זמן ההרדמה צריך להתקצר, מספר דבורים בתוך כלוב צריך להיות מופחת 1-3 דבורים בכל כלוב.
   2. לנתח את הראש מהגוף עם מספריים פינצטה. תקן את הראש על שעוות שיני דגש על צלחת פטרי עם סיכות. הכנס שתי סיכות לתוך הבסיסים של האנטנות לתקן את הראש. משרים ראשי קבוע מלוחים חרקים (130 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 1 מ"מ CaCl _2).
   3. הסר את ההיבט הקדמי של לציפורן של הראש באמצעות פינצטה בסדר וסכין כירורגית תחת מיקרוסקופ משקפת.
      הערה: HPGs ניתן למצוא בקלות ראש לאחר הסרת גuticle. HPG הוא איבר botryoid שקיים סביב המוח בראשו.
   4. הסרת הרקמה קנה הנשימה שהנה רקמה קרומית לבנה מתחת לציפורן. לאחר מכן, לנתח את HPGs מהראש ידי משיכת אותם לאט עם פינצטה.
   5. לסווג HPGs עם acini גדול עגול כמו 'פותח'. לסווג HPGs עם acini קטן ומעוות כמו 'שהתכווצה'. לסווג HPGs מתאים לא 'פותח' ולא 'שהתכווצתי' כמו 'ביניים'.
      הערה: תמונות נציג המראות שלושה שיעורים אלה של מדינות HPG מסומנים באיור 2.
   6. נושא 'פותח' ו HPGs 'שהתכווצה' כדי מיצוי RNA כמו 'HPGs דבורה מטפלת' ו 'HPGs forager', בהתאמה, ולהשוות ביטוי גנים HPGs בין אחות דבורים הלקטים (סעיף 4).

2. הזרקה של 20E

1. אסוף דבורי אומנות ממושבות טיפוסיות כמו described בהליך 1.6.1.
   הערה: HPGs לא יכול להיבחן מהדבורים כמו הדבורים יהיה גודלו.
2. להרדים את הדבורים ב 4 ° C במקרר (לא על הקרח).
   הערה: זה לוקח בערך 30 דקות כדי להשיג הרדמה. אם זמן ההרדמה מתקצר, מספר דבורים בכלוב צריך להיות מופחת 1-3 דבורים בכל כלוב.
3. בעזרת פינצטה, לשתק את הדבורים על שעוות שיני דגש על צלחת פטרי.
4. להזריק 1 μl של פתרון 20E לתוך ההיבט הקדמי של הראש באמצעות טיפ הזרקה עשוי micropipette נימים מכויל באמצעות חולץ מחט זכוכית.
   1. ממיסים 20E מלוחים אתנול-חרקים (130 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 1 מ"מ CaCl ₂₎ תערובת (1: 4) ב 2.5 מיקרוגרם / μl.
   2. חבר את קצה ההזרקה לצינור גומי, ולהתחבר טיפ micropipette צהוב לצד השני של הצינור.
   3. מקום 1 μl של פתרון 20E על parafilm באמצעות micropipette, להחזיק את קצה micropipette צהוב פה,d לצייר הפתרון לתוך קצה ההזרקה.
   4. הכנס את קצה ההזרקה לתוך הבסיס של האנטנות, ולהזריק את הפתרון על ידי נושבת קצה micropipette הצהוב.
      ההערה: הפרוטוקול שמוצג צעד זה הוא שיטת הזרקת הנציג, אבל השימוש של מכונת ההזרקה האוטומטית מומלץ עבור בטיחות כמו ²⁰ הכרחית.
5. אחורי הדבורים המוזרקים בכלובי חרקים ב 33-36 מעלות צלזיוס (הטמפרטורה האידיאלית הם 35 מעלות צלזיוס) בתנאים כהים ולחים (> 60% לחות יחסית) עבור 1 או 3 ימים. אספקת תערובת דבש-מים (1: 1) כדי הדבורים. במידת הצורך, לספור לשרוד דבורים לאחר ההזרקה.

3. יישום Methoprene

1. אסוף את המסרקים המכילים גלמי ממושבות בדרך כלל אחרי כל הדבורים הבוגרות החסידות תוסרנה עם מברשת. הדגירה המסרקת ב- C ° 33-36 (הטמפרטורה האידיאלית היא 35 מעלות צלזיוס) בתנאי לחות (לחות יחסית> 60%) בהיקף של עד 1 יום.
2. אסופה דבורים חדשים הגיחו מסרקים שנאספו ולהחיל סימני צבע כדי thoraces שלהם באמצעות צבע פוסטר כמתואר בפרוטוקול להכנת מושבות האחת-עוקבה. החזר את הדבורים המסומנים למושבות שלהם.
3. לאחר 6 ימים, לאסוף עובדים צבועים (6 יממה) מן המושבות. תרים עובדים צבועים מהמסרקים ידי החזקת thoraces שלהם עם פינצטה.
4. להרדים את הדבורים ב 4 ° C במקרר (לא על הקרח) כמו בפרוצדורה 2.2. בעזרת פינצטה, לשתק את הדבורים על שעווה שיניים דגש על צלחת פטרי ולהחיל 1-5 μl של פתרון methoprene (50-250 מיקרוגרם / μl) מומס אצטון כדי ראשיהם באמצעות micropipette. השתמש קצה מסנן כי הוא עמיד בפני אצטון.
   הערה: אצטון יכול להיות השפעות מזיקות על דבורים מובילה למוות. אם התמותה של דבורים הגבוהות הוא ציין, צמצום היקף אצטון 1 μl לכל הפחות מומלץ.
5. אחורי הדבורים בכלובי חרקים ב 33-36 ° C (t האידיאליemperature הוא 35 מעלות צלזיוס) במשך 7 ימים בתנאים כהים ולחים (לחות יחסית> 60%). אספקת תערובת דבש-מים (1: 1) כדי הדבורים. במידת הצורך, לספור לשרוד דבורים לאחר יישום מקומי.
   הערה: במאמר זה, דבורים לשרוד נספרים 7 ימים לאחר היישום (לוח 3).

הפקת 4. רנ"א כמותי RT-PCR

1. להרדים דבורים לנתח HPGs כמתואר 1.7.1 צעדים 1.7.4.
2. אסוף את HPGs גזור בצינור microcentrifuge על קרח ולאחסן יבש ב -80 ° C עד השימוש.
3. להוסיף 400 μl של מגיב עבור denaturation חלבון.
   הערה: מגיב זה זמין מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
4. Homogenize רקמות HPG באמצעות יד שנערכה מערבל חשמלי עם עלי המגון שמתאים בתוך צינור microcentrifuge. Homogenize במהירות סיבוב של כ 300 סל"ד במשך 1 דקות על הקרח לשבור ותאי רקמות lyse.
   הערה: מערבל חשמלי כף יד זמין מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
5. הוסף 80 μl כלורופורם ומערבבים היטב. דגירה במשך 5 דקות ב RT.
6. צנטריפוגה צינורות microcentrifuge ב 14,170 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. מעביר את השלב המימי לצינור חדש. הוסף נפח שווה של isopropanol ו 1 גליקוגן μl (5 מ"ג / מ"ל). דגירה ב -20 ° C עבור 20 דקות לפחות.
7. צנטריפוגה צינורות microcentrifuge ב 14,170 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
8. להוסיף 400 μl של אתנול 75% על גלולה ומערבבים היטב, בצנטריפוגה צינורות microcentrifuge ב 14,170 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C, ולהסיר את supernatant. חזור על נהלים אלה פעם נוספת.
9. אוויר יבש גלולה במשך 5-10 דקות ולאחר מכן לפזר אותו 10 מים μl RNase חינם.
   הערה: ייבוש מלא של הגלולה עלול לגרום insolubilization של גלולת RNA במים. לפיכך, גלולה שהוא רטוב מעט מתאיםהֲמָסָה.
10. למדוד את ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר כגון NanoDrop או דומה.
11. פנקו 500 ננוגרם של רנ"א הכל עם 2.0 U של DNase אני על ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לבזות כל הדנ"א הגנומי מזהמים.
12. Reverse-לתמלל 200 ננוגרם של DNase אני שטופלתי RNA ולבצע בזמן אמת PCR באמצעות ערכות זמינות מסחרי (ראה הרשימה בטבלה של חומרים ריאגנטים) ו פריימרים גן ספציפי (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 ', ו -5 '-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3 ", Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3' 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3 '). בצעו את PCR כדלקמן: [95 ° C x 30 שניות + (95 מעלות צלזיוס x 5 שניות + 60 ° C x 15 שניות + 72 ° C x 20 שניות) x 45-55 מחזורים].
13. לנרמל את כמות תעתיק עם זה של F2-1α גורם התארכות (EF1α˗F2) או 49 חלבון ריבוזומלי (rp49) ^9,16,21,22. גנים אלו הם g המלא אמיןEnes לניתוח ביטוי גנים HPGs באמצעות qRT-PCR.
14. בצע שני זנב מבחן t לזהות את ההבדלים המשמעותיים בין שתי קבוצות ניסוי (דבורי אומנות לעומת לקטים מפותחים לגילו, דבורים שטופל 20E לעומת דבורים שליטים, ודבורים שטופל methoprene לעומת דבורים מלאים) באמצעות תוכנה סטטיסטית.
    הערה: אם F-מבחן מניח שונויות, מבחן t ניתן להשתמש. אם לא, יכול לשמש מבחן t של וולש.

תוצאות

סקירה כללית של פרוטוקול להכנת מושבות אחת-עוקבה מתוארת באיור 1A. זמן-במהלך הניסויים מלהכין מושבות אחת-עוקבה לדגום אוסף מוצג באיור 1B. עובד כי בקריטריונים התנהגותיים להתנהגות סיעוד או התנהגות שיחור מזון נאספו ממושבות יחידה עוקבה, ופי...

Discussion

הכנת מושבות אחת-עוקבה

כאן תיארנו את פרוטוקול השתמשו במחקר הקודם שלנו ¹⁶ להכין מושבות אחת-עוקבה לניתוח של הפיזיולוגיה HPG הקשורים משמרת בתפקיד הדבורים הפועלות. הדבורים המטפלות ואת הלקטים בוגרת לגילה, שלעתים עומדת בקריטריונים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UNIPOSCA	Mitsubishi pencil	PC-5M	Marker pen for the application of marks to bees
20-hydroxyecdysone	Sigma Aldrich	H5142
Methoprene	Sigma Aldrich	33375
Breeding case insect	IRIS OHYAMA	CP-SS
Electromotion mixier	ISO	23M-R25	homogenization of tissue
TRIZol Reagent	Invitrogen	15596-026	the reagent for total RNA extraction
DNase I	Takara	2270A
PrimeScript RT reagent kit	Takara	RR037A	the reagent for reverse transcription
SYBR Premix ExTaq II	Takara	RR820A	the reagent for real-time PCR
LightCycle 1.2 Instrument	Roche	12011468001	the instrument for real-time PCR
LightCycle Capillaries (20μl)	Roche	4929292001	the material for real-time PCR