El análisis del tejido de miocardio entero en 3D del corazón

Resumen

Este protocolo describe un nuevo método para la comparación 3D de tejido de miocardio de todo el corazón con MRI. Esto está diseñado para la evaluación precisa de inyecciones intramiocárdicas en la zona fronteriza del infarto de un modelo porcino crónica de un infarto de miocardio.

Resumen

terapias regenerativas cardíacos tienen como objetivo proteger y reparar el corazón dañado en pacientes con cardiopatía isquémica. Mediante la inyección de células madre u otras sustancias biológicas que mejoran la angio- o vasculogénesis en la zona fronteriza del infarto (IBZ), la perfusión del tejido se mejora, y el miocardio puede ser protegido de daños mayores. Para el efecto terapéutico máximo, es la hipótesis de que la sustancia regenerativa se entrega mejor a la IBZ. Esto requiere inyecciones precisas y ha llevado al desarrollo de nuevas técnicas de inyección. Para validar estas nuevas técnicas, hemos diseñado un protocolo de validación basado en un análisis del tejido de miocardio. Este protocolo incluye el procesamiento de tejido de miocardio de todo el corazón que permite detallada de dos dimensiones (2D) y el análisis tridimensional (3D) de la anatomía cardiaca y las inyecciones intramiocárdicas. En un cerdo, infarto de miocardio fue creado por un 90-min la oclusión de la arteria descendente anterior izquierda coronaria. Cuatro semanas más tarde, un mixtoure de un hidrogel con partículas superparamagnéticas de óxido de hierro (SPIOs) y perlas fluorescentes se inyectó en el IBZ utilizando un enfoque endocardial mínimamente invasiva. 1 h después del procedimiento de inyección, el cerdo fue sacrificado, y el corazón se extirpó y se incrusta en agarosa (agar). Después de la solidificación del agar, se realizaron imágenes de resonancia magnética (MRI), el corte en lonchas del corazón, y de imágenes de fluorescencia. Después de imagen post-procesamiento, se realizó un análisis 3D para evaluar la precisión de la focalización IBZ. Este protocolo proporciona un método estructurado y reproducible para la evaluación de la precisión de la focalización de las inyecciones intramiocárdicas en el IBZ. El protocolo puede ser utilizado fácilmente cuando se desea el tratamiento de tejido cicatricial y / o validación de la precisión de la inyección de todo el corazón.

Introducción

La cardiopatía isquémica ha sido la principal causa mundial de muerte en las últimas décadas ^1. El tratamiento agudo después de infarto de miocardio tiene como objetivo restablecer el flujo de sangre al miocardio a través de la intervención coronaria percutánea o cirugía de revascularización coronaria. En infartos graves, una gran zona del miocardio está marcada, y estos casos a menudo resultan en la insuficiencia cardiaca isquémica (HF) ^2. Las opciones terapéuticas actuales para el enfoque de HF en la prevención y la preservación de la función cardiaca de los pacientes con IC, pero no en la regeneración.

En la última década, las terapias regenerativas cardiacos se han investigado como una opción de tratamiento de la IC ^3. Esta terapia tiene como objetivo ofrecer productos biológicos, tales como células madre o factores de crecimiento, directamente al miocardio lesionado para inducir la revascularización, la protección de los cardiomiocitos, la diferenciación y el crecimiento ^4. para una óptimaefecto terapéutico, se plantea la hipótesis de que la biológica se debe inyectar en la zona fronteriza del infarto (IBZ) para facilitar una buena perfusión tisular para la supervivencia de la biológica y para un efecto óptimo a la zona objetivo ^{5, 6.} Múltiples técnicas se han desarrollado para llevar a cabo la identificación y la visualización de la IBZ para guiar las inyecciones intramiocárdicas ^{7, 8, 9, 10, 11.} Además de la identificación y la visualización de la IBZ, la entrega también se basa en los biomateriales y catéteres de inyección utilizados. Para validar la precisión de la inyección de las técnicas de administración, se requiere un método de cuantificación precisa y reproducible.

Hemos desarrollado un protocolo para el procesamiento de todo el corazón infarto de tejido que se ofrece en dos dimensiones (2D) y tres dimensional (3D) de imágenes, que puede ser utilizado para el estudio cualitativo y cuantitativo objetivo. El protocolo cubre el proceso de incorporación y el análisis de imagen digital. En este trabajo, se demuestra un protocolo para la evaluación de la precisión de la focalización de las inyecciones intramiocárdicas en el IBZ en un gran modelo porcino de infarto de miocardio crónico.

Protocolo

El experimento in vivo se realizó de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio preparados por el Instituto de Investigación de Animales de Laboratorio. El experimento fue aprobado por el Comité de Experimentación Animal local.

1. Preparación de la solución inyectable e incrustación

1. Preparar el gel inyectable.
   1. Preparar 1 ml de ureido-pirimidinona gel (UPY) de acuerdo a los protocolos descritos anteriormente ^{12, 13.}
   2. Añadir partículas de óxido de hierro superparamagnéticas (SPIOs) a la solución para obtener una concentración de 15 mg / ml y se agita la mezcla durante 5 min para la distribución uniforme.
   3. Añadir las microperlas fluorescentes a la solución para obtener una concentración de 10.000 cuentas / ml y se agita la mezcla durante 5 min para la distribución uniforme.
   4. Guarde la mezcla resultante a temperatura ambiente en un ambiente oscuro. Caliente y agitar o remover tque la solución poco antes del procedimiento de inyección.
2. Preparar la solución de incrustación.
   1. Comience con agua del grifo a temperatura ambiente y añadir agarosa (agar) a una concentración de 4% en peso.
   2. Lentamente calentar la solución hasta el punto de ebullición usando un horno de microondas y se agita con frecuencia durante el calentamiento. Al llegar a la ebullición punto, almacenar y mantener la solución de agar por encima de 70 ° C durante 2 h para permitir que el aire atrapado a la superficie.
   3. Dejar que el agar se enfríe a temperatura ambiente a una temperatura entre 50 y 60 ° C hasta el momento de la incrustación.

Procedimiento 2. Inyección

1. Realizar premedicación (agentes anti-arrítmicos, la terapia anti-plaquetas, y medicamentos para el dolor), anestesia, acceso venoso, y la intubación, como se ha descrito previamente ^14.
2. Realizar inyecciones utilizando un catéter de inyección intramiocárdica (Tabla de Materiales). Para cada inyección, 0.2 ml de la mezcla se inyecta en un bolo a una velocidad constante de aproximadamente 0,3 ml / min usando un dispositivo de inyección. Colocar las inyecciones en diferentes posiciones a lo largo del IBZ ^12.
3. Administrar 0,2 ml / kg (1,0 mmol / ml) de un agente de contraste a base de gadolinio 15 min antes de la eutanasia de los animales.
4. Administrar 20 ml de cloruro de potasio 7,5% por vía intravenosa para la eutanasia del animal.
5. Acceso mediastinal Secure siguiente protocolo pasos 8/2 a 8/3, como se describe por Koudstaal et al. ^14. Cortar la vena cava inferior a 5 cm de la aurícula derecha y quitar que fluye hacia la sangre con un dispositivo de succión. Escindir el corazón y enjuagarlo con 0,9% de solución salina a temperatura ambiente.

3. Procedimiento Embedding

1. Preparar el corazón.
   1. Retire el pericardio del corazón, manteniendo las aurículas y los ventrículos intacta. Diseccionar la aorta ascendente ± 1 cm por encima de la válvula aórtica usando Klinkenbergtijeras. Cortar la vena cava inferior ± 1 cm desde la aurícula, y hacer lo mismo para las venas pulmonares.
   2. Suturar el ápice del corazón a la parte inferior de un recipiente de plástico incrustación (17 x 15 x 15 cm, W x D x H) usando una sutura 2-0 para evitar la flotación del corazón durante la incrustación (Figura 1A).
   3. Suturar la parte restante de la aorta a los bordes del recipiente usando 2-0, asegurándose de que el corazón está centrado y no tocar las paredes del recipiente (Figura 1B).

Figura 1: vista general esquemática y Fotografía de la incrustación de Container. (A) Descripción general esquemática del proceso de incrustación. El corazón (rojo) está asegurada en el recipiente (azul) usando suturas. Después de llenar el corazón con la solución de agar, el espacio alrededor del corazón está lleno. Finalmente,dos tubos de plástico rígido (amarillo) se colocan en el recipiente, junto a, pero sin tocar el corazón, para servir como una referencia durante el registro de imagen. (B) Fotografía de un corazón asegurado en el recipiente incrustación. Las suturas se sujetan al borde del recipiente usando abrazaderas de mosquitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Incrustar el corazón en una geometría de fin de diástole-similares.
   NOTA: La prevención de la creación de la burbuja de aire es necesario. Si las burbujas presentes en la solución de agar grande de aire, mantener el agar a 40 ° C, permitiendo que las burbujas de aire a la superficie.
   1. Sujetar la vena cava inferior usando pinzas de mosquito. inyectar lentamente el agar líquido usando una jeringa de 50 mL en la aurícula derecha a través de la vena cava superior hasta tanto en la aurícula y el ventrículo derecho están completamente llenos.
   2. Abrazadera de las venas pulmonares utilizando mosquito abrazaderas. pasar suavemente una jeringa de 50 ml de agar-llenado retrógrada a través de las válvulas aórtica. inyectar lentamente la solución en el ventrículo izquierdo (VI) hasta que la LV y la aurícula izquierda están completamente llenos. Después de llenar el LV, sujetar la aorta para mantener el agar en el VI.
   3. Vierta el agar que queda en el recipiente hasta que el corazón está totalmente cubierto. Coloque dos tubos rígidos de plástico dentro del contenedor de la incrustación para servir como estructuras de referencia para el registro de imágenes después (Figura 1A). Asegúrese de que los tubos no se toquen las paredes del recipiente o el corazón.
   4. Deje que el agar solidifique a 2 - 7 ° C.

4. Adquisición de imágenes

1. Realizar transversales ex vivo imágenes por resonancia magnética del corazón que está incrustado en el contenedor.
   1. Coloque el recipiente con el corazón incrustado dentro de una bobina de cabeza (Tabla de Materiales).
   2. Dispuesto en ángulo de las rodajas paralelas a la parte inferior del recipiente. Utilizarla misma orientación y la angulación en cada secuencia ex vivo MRI.
   3. Para visualizar miocardio, realizar una recuperación inversa fluido atenuada secuencia (FLAIR) con los siguientes parámetros: tiempo de repetición [TR] / tiempo de eco [TE] = 10 s / 140 ms, ángulo flip = 90 °, tamaño de píxel = 0,5 x 0,5 mm, campo de visión [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 de matriz, y grosor de corte 3-mm.
   4. Para visualizar el infarto de miocardio, realice una tarde-gadolinio mejorado (LGE) de secuencia con los siguientes parámetros: [TR] / [TE] = 5,53 ms / 1,69 ms, ángulo flip = 25 °, tamaño de píxel = 1,0 x 1,0 mm, [ FOV] = 169 x 169 mm, 176 x 176 de matriz, y grosor de corte 3-mm.
   5. Para visualizar SPIOs, realizar una T2 * gradient-ponderada secuencia de eco con los siguientes parámetros: [TR] / [TE] = 88,7 ms / 15 TEs distribuidos igualmente con un rango de 1.9 - 24.6 ms, ángulo flip = 15 °, pixel size = 0,5 x 0,5 mm, [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 de matriz, y grosor de corte 3-mm.
2. proces de tejidocanta
   1. Girar el recipiente boca abajo y permitir que el aire entre el agar y los lados del recipiente para eliminar la solución de agar sólido, incluyendo el corazón, desde el recipiente. Retire las varillas de plástico del agar sólido.
   2. Sección del bloque de agar que contiene el corazón en rebanadas de 5 mm desde el vértice hasta la base del corazón usando una máquina de cortar carne. Mantener la angulación de las rodajas cortadas las mismas que en las imágenes de RM adquiridos por el corte paralelo a la parte inferior del bloque de agar.
   3. Tinción de las rodajas de agar (incluyendo el corazón) durante 15 min en 1% en peso de 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) disuelto en 0,9% de solución salina a 37 ° C, y fotografiar las rodajas en ambos lados desde una vista perpendicular (figura 2A). A continuación, enjuagar cuidadosamente las rodajas en 0,9% de solución salina.
      NOTA: En este estudio, se utilizó una configuración de DSLR con una lente / objetivo apropiado, un trípode, y la iluminación uniforme. Sin embargo, las fotografías sólo sirvieron como control para la evaluación de la región de la cicatriz,así que podría haber utilizado una configuración diferente.
3. imágenes de fluorescencia
   NOTA: Dependiendo de la excitación y de emisión de longitudes de onda de las microperlas fluorescentes, seleccionar los láseres de bloque de filtro y de excitación apropiada (por ejemplo, las microperlas rojos utilizados aquí tienen excitación y emisión longitudes de onda de 580 nm y 605 nm, respectivamente, por lo tanto, el láser de excitación seleccionado y los filtros de paso de banda se fijaron a 532 nm, 580/30 nm y 610/30 nm, respectivamente).
   1. Seleccionar las imágenes en modo de fluorescencia en el escáner en modo variable. Ajuste el tubo fotomultiplicador a 430 V o equivalente y el tamaño de píxel de 100 x 100 m. Seleccionar un láser de excitación (532 nm) más cercana a la longitud de onda de excitación de las microperlas fluorescentes.
   2. Para el primer bloque de filtro, seleccione un filtro de paso de banda (580/30 nm) que se superpone con la longitud de onda de emisión de las perlas de fluorescencia inyectados (canal 1). Selecciona un filtro de paso de banda para el bloque segundo filtro (610/30) fuera del correolongitud de onda de misión (canal 2).
      NOTA: El segundo bloque de filtro sirve como un control negativo y para eliminar auto-fluorescencia, manteniendo intactos los sitios de inyección.
   3. Escanear ambos lados de las rodajas de agar en el modo de fluorescencia del escáner láser de modo variable usando los dos canales. Asegúrese de que cada rodaja se escanea completamente, incluyendo los agujeros de referencia.

5. Post-procesamiento

NOTA: El primer paso en la imagen post-procesamiento es la segmentación manual del miocardio mediante scripts desarrollados internamente para trazar la endo y epicárdicos fronteras, así como los sitios de inyección. Este es el mismo tanto para las exploraciones de resonancia magnética y de fluorescencia.

1. Segmento del miocardio en las imágenes por resonancia magnética.
   1. Segmento del endocardio y de LV borders epicardio en la secuencia de imágenes de resonancia magnética FLAIR.
   2. Copiar la segmentación LV desde el paso 5.1.1 al conjunto de datos LGE-RM y el segmento de la cicatriz en la secuencia de LGE MRI.
   3. Copiar la segmentación miocardio desde el paso 5.1.1 a la T2 * de conjunto de datos-ponderada y segmentar las deposiciones SPIO en el miocardio LV.
2. Procesar las imágenes de fluorescencia y realizar segmentaciones.
   1. Cargar los archivos obtenidos desde el escáner en modo variable y hacer una imagen separada de cada rebanada corazón de la sección transversal.
   2. Voltear las rebanadas que fueron escaneados en la base al ápice orientación y ordenar las imágenes de fluorescencia en una pila para ambos canales que está orientado desde el vértice a la base.
   3. Segmento del endocardio y de LV borders epicardio en las imágenes de fluorescencia.
   4. Segmento de la cicatriz de forma manual en las imágenes de fluorescencia y el uso de la LGE-resonancia magnética y las fotografías para confirmar la morfología de la cicatriz.
   5. Restar la pila de imágenes del canal 2 de la pila de imagen del canal 1 para excluir auto-fluorescencia. segmento manualmente las deposiciones de microesferas fluorescentes y usar el T2 * imágenes para su confirmación.
3. Crearuna geometría 3D anatómicamente correcta, se realiza un registro rígida de las rebanadas en la pila de imagen basada en las estructuras de referencia (los agujeros creados por los tubos rígidos). Calcular y almacenar la traslación y rotación aplicada de cada imagen.
4. Aplicar las transformaciones almacenados para las pilas de imágenes y las segmentaciones. Linealmente interpolar las segmentaciones de ambos lados de las rebanadas de reconstruir el grosor del corte original y para crear un modelo 3D de los datos.

6. Análisis

1. Realizar mediciones 2D y / o 3D de la distancia entre los centros de los sitios de inyección y la IBZ para evaluar la precisión de la inyección. Medir la distancia a lo largo del borde endocárdico de la segmentación del ventrículo izquierdo. En la Figura 2C y 2F, un ejemplo de las mediciones 2D y 3D se indica por la línea roja.

Resultados

incrustación de tejidos

A través del proceso de incrustación, se estableció una geometría telediastólico-similares. El agar adherido con éxito para el tejido del corazón, lo que permite que el tejido a cortar en la angulación deseada con espesores rebanada iguales (Figura 2A y 2C).

Evaluación del SCAR y el lugar de inyección

Discusión

Whole-corazón de procesamiento del tejido de miocardio en 3D de acuerdo con este protocolo proporciona un método estructurado que permite el análisis en 3D del infarto, la IBZ, y las inyecciones realizadas con respecto a la anatomía cardiaca. El volumen de llenado del corazón depende del análisis deseado. En este estudio, para evaluar la exactitud de la inyección, que tuvo como objetivo llenar el corazón para parecerse a la geometría de fin de diástole lo más cerca posible. Para cumplir esto, el ápice LV se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Braun
Agarose	Roche Diagnostics		Scientific grade multipurpose agar
Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410	GE Healthcare
Embedding container			Plastic, dimensions 17 x 14.5 x 14 cm
FluoSpheres Polystyrene Microspheres	Invitrogen	F8834	red, 10 µm
Gadolinium	Gadovist		1.0 mmol/mL
dS 32 channel head coil	Philips		Or similar
Matlab	Mathworks		To insure compatability 2015a or newer
Meat slicer	Berkel
Myostar injection catheter	Biosense Webster
Super paramagnetic iron oxide particles	Sinerem
Triphenyl-tetrazolium chloride	Merck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0	Ethicon