3D Tüm kalp Miyokard Doku Analizi

Özet

Bu protokol, MRI ile bütün kalp miyokard dokusu 3D karşılaştırmak için yeni bir yöntem tarif eder. Bu miyokard enfarktüsü, kronik domuz modelinde enfarktüs sınır bölgesinde intramiyokardiyal enjeksiyonları tam olarak değerlendirilmesi için tasarlanmıştır.

Özet

Kardiyak rejeneratif tedaviler korumak ve iskemik kalp hastalığı olan hastalarda yaralanan kalbi onarmak amaçlıyoruz. kök hücreler veya enfarktüs sınır bölge (IBZ) içine anjio veya vaskülojenezi artırmak için diğer biyo enjekte ederek, doku perfüzyonu geliştirilir ve miyokardın daha fazla zarar korunabilir. Maksimum terapötik etkisi için yenileyici madde iyi IBZ teslim edilir varsayılmaktadır. Bu doğru iğnesi yapılması gerekir ve yeni enjeksiyon tekniklerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu yeni teknikler geçerli kılmak için, miyokardiyal doku analizine dayalı bir doğrulama protokolü tasarladık. Bu protokol ayrıntılı iki boyutlu (2D) ve kardiyak anatomi ve intramiyokardiyal enjeksiyonların üç boyutlu (3D) analizine olanak tanır bütün kalp miyokard doku işleme içerir. bir domuz olarak, miyokardiyal enfarktüs, koroner arter, sol ön inen bir 90-dakikalık bir oklüzyonundan ve oluşturuldu. Dört hafta sonra, bir mikstsüperparamanyetik demir oksit parçacıkları (SPIOs) ve flüoresan boncuklar ile bir hidrojel ure minimal invaziv endokardiyal yaklaşım kullanılarak IBZ enjekte edilmiştir. 1 saat enjeksiyon işleminden hemen sonra, domuz ötenazi edildi ve Kalp kesilip çıkartılmış ve agaroz gömülü (ağar). agar sertleşmesinden sonra, manyetik rezonans görüntüleme (MRI), kalbin dilimleme ve fluoresans görüntü gerçekleştirilmiştir. görüntü post-processing sonra 3D analiz IBZ hedefleyen doğruluğu değerlendirmek amacıyla yapıldı. Bu protokol, IBZ içine intramiyokardiyal enjeksiyonları hedefleme doğruluk değerlendirme için yapılandırılmış ve yeniden üretilebilir bir usul sağlamaktadır. yara dokusu ve / veya bütün kalp enjeksiyon doğruluk doğrulama işleme istendiği zaman protokolü kolay kullanılabilir.

Giriş

İskemik kalp hastalığı geçmiş yıllarda ¹ ölüm dünyanın önde gelen nedenidir olmuştur. Miyokardiyal enfarktüs sonrası akut tedavi perkütan koroner müdahale ya da koroner arter bypass aşılama yoluyla miyokard kan akışının sağlanması amaçlanmaktadır. Şiddetli enfarktüsü olarak, geniş bir miyokard alanı izlerini taşıyor ve bu vakalar genellikle iskemik kalp yetersizliği (KY) ² sonuçlanabilir. HF önlenmesi odaklanmak ve HF hastalar için kalp fonksiyonunun korunması için mevcut tedavi seçenekleri değil yenilenmesine.

Son on yıl içinde, kardiyak rejeneratif tedaviler HF ³ için tedavi seçeneği olarak incelenmiştir. Bu terapi revaskülarizasyon, kardiyomiyosit koruması, farklılaşmayı etkileyen doğrudan yaralı miyokardiyuma, örneğin kök hücre ya da büyüme faktörleri gibi olarak biyolojik, sağlamayı amaçlar ve büyüme ^4.. optimum içinTerapötik etki, biyolojik olarak biyolojik hayatta kalma ve hedef bölge ^{5, 6} için en uygun etki için iyi bir doku perfüzyonunun kolaylaştırmak için enfarktüs sınır bölgesi (IBZ) enjekte edilmelidir varsayılmaktadır. Çoklu teknikler intramiyokardiyal enjeksiyonları ^{7, 8, 9, 10, 11} rehberlik etmek IBZ belirlenmesini ve görselleştirme gerçekleştirmek için geliştirilmiştir. IBZ tanımlanması ve görselleştirme yanı sıra, teslimat da kullanılabilir biyomalzeme ve enjeksiyon kateter dayanır. uygulama teknikleri püskürtme doğruluğunu doğrulamak için, doğru ve tekrarlanabilir bir nicelendirme yöntemi gerekmektedir.

Biz bütün kalp miyokard dokusu iki boyutlu (2D) sunmaktadır işleme ve üç dimensio için bir protokol geliştirdilernitel ve nicel çalışma için kullanılabilecek nal (3D) görüntüleme, hedeflemektedir. protokol gömme işlemini ve dijital görüntü analizi kapsar. Bu çalışmada, kronik miyokart enfarktüsü, büyük domuz modelinde IBZ içinde intramiyokardiyal enjeksiyonları hedefleme doğruluk değerlendirme için bir protokol göstermektedir.

Protokol

In vivo deney Laboratuar Hayvan Araştırmaları Enstitüsü tarafından hazırlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım Kılavuzu esaslarına göre ve Kullanımında yürütülmüştür. Deney yerel Hayvan Deneyleri Komitesi tarafından onaylandı.

Enjekte ve Gömme Çözüm hazırlanması 1.

1. Enjekte edilebilir jel hazırlayın.
   1. ^13, daha önce tarif edilen protokollere ¹² uygun olarak üreido-pirimidinon (UPy) jel, 1 mL hazırlayın.
   2. çözeltisine ilave süperparamanyetik demir oksit parçacıkları (SPIOs), 15 ug / mL'lik bir konsantrasyon elde ve homojen dağılımı için, 5 dakika için karıştırın için.
   3. 10.000 boncuk / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için çözeltiye floresan mikroboncuklar ekleyin ve homojen dağılımı için, 5 dakika için karıştırın.
   4. karanlık ortamda, oda sıcaklığında elde edilen karışım saklayın. Sıcak ve girdap veya karıştırma tkısa bir süre enjeksiyon prosedürü önce o çözüm.
2. gömme çözeltisi hazırlayın.
   1. Oda sıcaklığında musluk suyu ile başlayın ve (ağar) ağırlıkça% 4 arasında bir konsantrasyona agaroz ekleyin.
   2. Yavaş yavaş bir mikrodalga fırın kullanılarak kaynama noktasına çözeltinin ısıtılması ve ısıtma sırasında sık sık karıştırılır. kaynama noktası, depolama ulaşan ve 2 saat boyunca 70 ° C'nin üzerinde, agar çözeltisi tutmak üzerine sıkışmış hava yüzey sağlamak için.
   3. ağar gömme zamanına kadar 50 ila 60 ° C arasındaki bir sıcaklıkta, oda sıcaklığında soğumasına izin verin.

2. Enjeksiyon Yöntemi

1. Daha önce ¹⁴ tarif edildiği gibi, önceden ilaç (anti-aritmik maddeler, anti-platelet terapi ve ağrı kesiciler), anestezi, toplardamar erişim ve entübasyon gerçekleştirin.
2. Bir intramiyokardiyal enjeksiyon kateter (Malzemelerin Tablo) kullanılarak enjeksiyon gerçekleştirin. Her enjeksiyon için, 0 için.Karışımın 2 ml bir enjeksiyon cihazı kullanılarak yaklaşık olarak 0.3 mL / dakikalık bir sabit oranda bir bolus olarak enjekte edilir. IBZ ¹² boyunca farklı pozisyonlarda enjeksiyon yerleştirin.
3. önce hayvan ötenazi bir gadolinyum bazlı kontrast madde, 15 dakika, 0.2 ml / kg (1.0 mmol / ml) uygulayınız.
4. intravenöz hayvan euthanize% 7.5 potasyum klorür 20 mL yönetmek.
5. Koudstaal ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi, 8.3 - protokol takip güvenli mediastinal erişim 8.2 adımları tekrarlayın. ^14. Sağ atrium dan aşağı vena kava 5 cm kesin ve bir emme cihazı ile kan akan çıkarın. kalp şekilde kesilmesi ve oda sıcaklığında,% 0.9 tuzlu su ile yıkayın.

3. Gömme Prosedürü

1. kalbi hazırlayın.
   1. bozulmamış Atriumlarm ve ventriküllere tutarken kalpten perikard çıkarın. ± 1 cm Klinkenberg kullanılarak aort kapağının çıkan aort teşrihmakas. atriyum aşağı vena kava ± 1 cm kesin ve pulmoner venlerin için aynı işlemi.
   2. Plastik bir gömme kap (17 x 15 x 15 cm, G x D x H) gömme sırasında kalbin yüzmesini önlemek için 2-0 sütür ile (Şekil 1A) tabanına kalbin apeksi dikin.
   3. Kalp ortalanmış emin ve kabın (Şekil 1B) duvarlarını temas etmeyen, 2-0 kullanılarak kabın jantlara aort kalan kısmını dikin.

Şekil 1: Şematik genel ve katıştırma Konteyner fotoğrafı. (A), gömme işleminin şematik gösterimi. Kalp (kırmızı) sütür kullanılarak konteyner (mavi) içinde sabitlenir. Agar çözeltisi ile kalbi doldurduktan sonra kalbin çevresinde boşluk doldurulur. En sonunda,iki sert plastik tüpler (sarı) görüntü kaydı sırasında bir referans olarak hizmet etmek üzere, kalp dokunmadan değil, yan yana, bir kap içinde konumlandırılır. Gömme kap içinde sabitlenmiş bir kalbin (B) fotoğrafı. Dikişler sivrisinek kelepçeler kullanılarak kap kenarına sabitlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

2. bir uç-diastolik geometriye kalbin yerleştirin.
   NOT: hava kabarcığı yaratılış önlenmesi gereklidir. Büyük hava agar çözeltisi içinde mevcut kabarcıklar halinde hava kabarcıkları yüzey sağlayan, 40 ° C 'de agar tutun.
   1. sivrisinek kelepçeler kullanılarak ven inferior vena Kelepçe. Yavaş yavaş sağ atriyum ve ventrikül de tamamen dolana kadar üstün kaval damar yoluyla sağ atriyum içinde 50 mL'lik bir şırınga kullanılarak sıvı agar enjekte edilir.
   2. Mosquit kullanılarak pulmoner venlerin KelepçeO kelepçeler. Yavaşça aort valfler üzerinden retrograd bir agar doldurulmuş 50 ml hava geçmektedir. Yavaş yavaş LV ve sol atriyum tamamen dolana kadar sol ventrikül (LV) solüsyonu enjekte edilir. LV doldurduktan sonra LV içinde agar tutmak için aort kelepçe.
   3. Kalp tamamen kaplıdır kadar kaba kalan agar dökün. Daha sonra görüntü kaydı (Şekil 1A) referans yapılar olarak hizmet etmek için gömme kap içinde iki katı plastik tüpler yerleştirin. Tüpler konteyner veya kalbin duvarlara dokunmayın emin olun.
   4. 7 ° C - agar 2 katılaşmaya olsun.

4. Görüntü Alma

1. Kap içinde gömülü olduğu kalbin enine ex vivo MR taramaları gerçekleştirin.
   1. Bir kafa bobin içinde gömülü kalp (Malzemelerin Tablo) kap yerleştirin.
   2. Dilimler, kabın tabanına paralel Angulate. kullanımHer bir ex vivo MR dizisinde aynı yönlendirme ve bir açı vardır.
   3. miyokardı görselleştirmek için, bir sıvı-zayıflatılmış ters kurtarma aşağıdaki parametrelerle (FLAİR) sekansı gerçekleştirmek: tekrar zamanı [TR] / eko zamanı [TE] = 10 s / 140 ms, dönüş açısı = 90 °, piksel boyutu = 0.5 x 0.5 mm, [FOV] = 169 x 169 mm alanı, 320 x 320 matris ve 3 mm kesit kalınlığı.
   4. [TR] / [TE] = 5.53 ms / 1.69 ms, dönüş açısı = 25 °, piksel boyutu = 1.0 x 1.0 mm, [miyokard enfarktüsü görselleştirmek için aşağıdaki parametrelerle (LGE) sekansı geliştirilmiş bir geç-gadolinyum gerçekleştirmek FOV] = 169 x 169 mm, 176 x 176 matris ve 3 mm kesit kalınlığı.
   5. - 24.6 ms, dönüş açısı = 15 °, piksel [TR] / [TE] = 88.7 ms / 1.9 bir dizi ile 15 eş dağılmış TEler: bir T2, aşağıdaki parametreler ile * -ağırlıklı gradyan eko dizisi yerine, SPIOs görselleştirmek için boyutu = 0.5 x 0.5 mm, [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 matris ve 3 mm kesit kalınlığı.
2. Doku süreçşarkı söyle
   1. baş aşağı kabı çevirin ve kaptan, kalp de dahil olmak üzere, katı agar çözüm kaldırmak için agar ve kabın kenarları arasındaki havayı bekleyin. katı agar plastik çubuklar çıkarın.
   2. Bölüm et dilicisi kullanılarak kalbin tabanına apeksten 5 mm dilimleri kalp içeren agar bloğu. Agar bloğun altına paralel keserek kesik dilimler edinilen MR görüntülerinde aynı açısal şeklinin tutun.
   3. 37 ° C'de% 0.9 salin içinde çözülmüş 2,3,5-trifenil-(TTC) ile 1 ağırlık% 'si, 15 dakika boyunca (kalp de dahil), agar dilimleri Leke ve dik bir görünüm, her iki tarafta da dilim fotoğraf (Şekil 2A). Daha sonra, dikkatli bir şekilde% 0.9 salin içinde dilimleri yıkayın.
      NOT: Bu çalışmada, uygun bir lens / objektif, bir tripod ve tekdüze aydınlatma ile dSLR kurulum kullandı. Ancak, fotoğraflar, sadece yara bölgenin değerlendirilmesi için bir kontrol olarak görev yaptıbu yüzden farklı bir düzenleme kullanmış olabilir.
3. floresan görüntüleme
   NOT: bu nedenle seçilen uyarım lazer floresan mikrotaneciklerin uyarma ve emisyon dalga boyları bağlı olarak (örneğin, burada kullanılan kırmızı microboncuklar sırasıyla 580 nm ve 605 nm uyarma ve emisyon dalga boylarına sahiptir uygun filtre bloğu ve uyarma lazerler seçmek ve bant geçiş filtreleri, 532 nm, 580/30 nm ve 610/30 nm, sırasıyla) ayarlanmıştır.
   1. Değişken modu tarayıcı üzerinde Seç floresan modu görüntüleme. 430 V veya eşdeğeri fotomultiplikatör tüpü ve 100 x 100 um piksel boyutunu ayarlayın. Floresan mikro boncuklar uyarılma dalga boyunda bir uyarım lazer (532 nm), en yakın seçin.
   2. Birinci filtre blok için, enjekte edilen flüoresan boncuklar (kanal 1) emisyon dalga boyu ile örtüşen bir bant geçiş filtresi (580/30 nm) seçin. dışındaki bir ikinci filtre bloğu (610/30) için bir bant geçiren filtre seçinGörev dalga boyu (kanal 2).
      İkinci filtre bloğu bir negatif kontrol olarak hizmet eder ve bozulmamış enjeksiyon bölgeleri tutarken otomatik floresan kaldırmak için: NOT.
   3. İki kanalları kullanarak değişken modlu lazer tarayıcının floresan modunda Agar dilim her iki tarafını tarayın. Her dilim tamamen referans delikleri dahil taranır emin olun.

5. Post-işleme

NOT: görüntü post-processing ilk adım endo- ve epikardiyal sınırları yanı sıra enjeksiyon yerlerini iz in-house geliştirilen komut dosyalarını kullanarak miyokard manuel segmentasyondur. Bu MR ve floresan taramaları ikisi için aynıdır.

1. Segment MR taramalarında miyokard.
   1. Segment FLAIR MR dizisi görüntülerde endokardiyal ve epikardiyal LV borders.
   2. LGE MR dizisine IgE MR veri kümesi ve segmente aşama 5.1.1 gelen yara AG bölümleme kopyalama.
   3. AG miyokardiyumda * -ağırlıklı veri kümesi ve kademeli SPIO çökelmeler T2 aşama 5.1.1 den miyokardiyum bölümleme kopyalar.
2. floresan görüntüleri işleyin ve segmentasyonları gerçekleştirin.
   1. Değişken modlu tarayıcı elde edilen dosyaları yükleyin ve her kesit kalp dilim ayrı bir görüntüsünü oluşturuyor.
   2. yönünü apekse ve apeksinden tabanına dönük olan iki kanal için bir istif halinde flüoresan görüntülerini sıralamak için bir baz tarandı dilimleri çevirin.
   3. floresan görüntülerde Segment endokardiyal ve epikardiyal LV borders.
   4. Segment floresan görüntülerde el yara ve kullanımı LGE-MRI taraması ve fotoğraflar yara morfolojiyi onaylamak için.
   5. otomatik floresan hariç tutmak için kanal 1 görüntü yığınından kanal 2 Görüntü yığını çıkarın. Elle segmenti floresan microbead ifadelerin veya onay için * görüntüleri T2 kullanın.
3. YaratmakBir anatomik doğru 3 boyutlu geometri, referans yapılarının (sert tüpler tarafından oluşturulan delikler) göre görüntü yığını içinde dilimlerinin bir katı kaydını gerçekleştirilir. Hesaplayın ve her resmin tatbik çeviri ve döndürme saklayın.
4. görüntü yığınlarından ve segmentasyon için saklanan dönüşümleri uygulayın. Doğrusal Olarak orijinal kesit kalınlığı yeniden yapılandırmak ve verilerin bir 3D modeli oluşturmak için dilimlerin her iki tarafın segmentlerini sokmak.

6. analizi

1. Enjeksiyon doğruluğunu değerlendirmek için enjeksiyon sitelerin merkezleri ve IBZ arasındaki mesafenin 2D ve / veya 3D ölçümlerini gerçekleştirin. LV Segmentasyonun endokardiyal sınırı boyunca mesafeyi ölçün. Şekil 2C ve 2F'de ise, 2 ve 3 boyutlu ölçümler örnek kırmızı çizgi ile gösterilir.

Sonuçlar

Doku Gömme

gömme işlemi sayesinde, bir uç-diastolik benzeri geometri kurulmuştur. Başarılı bir şekilde doku sağlayarak, kalp dokusuna yapışık agar eşit kesit kalınlıkları (Şekil 2A ve 2C) ile istenilen açı ile dilimlenmiş.

Scar- ve Enjeksiyon yerinde Değerlendirmesi

Tartışmalar

Bu protokole göre bütün kalp 3D miyokardiyal doku işleme enfarktüs, IBZ ve kardiyak anatomiye göre yapılan enjeksiyon 3D analiz sağlar yapısal bir yöntem sağlar. Kalbin dolum hacmi istenen analizine bağlıdır. Bu çalışmada, enjeksiyon doğruluğunu değerlendirmek için, biz mümkün olduğunca yakından diyastol sonu geometriyi benzemeye kalp doldurmak amaçladık. Bu zorlamak için, LV apeks kabın tabanına sabitlenir ve pulmoner venler sıkıştırılmış iken AG agar ile doldurulur. LV doldurulduğ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Braun
Agarose	Roche Diagnostics		Scientific grade multipurpose agar
Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410	GE Healthcare
Embedding container			Plastic, dimensions 17 x 14.5 x 14 cm
FluoSpheres Polystyrene Microspheres	Invitrogen	F8834	red, 10 µm
Gadolinium	Gadovist		1.0 mmol/mL
dS 32 channel head coil	Philips		Or similar
Matlab	Mathworks		To insure compatability 2015a or newer
Meat slicer	Berkel
Myostar injection catheter	Biosense Webster
Super paramagnetic iron oxide particles	Sinerem
Triphenyl-tetrazolium chloride	Merck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0	Ethicon