3D Whole-Herz Myocardial Gewebeanalyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren für den 3D-Vergleich von ganzem Herzen Herzmuskelgewebe mit MRI. Dies ist für die genaue Beurteilung der intramyokardialer Injektionen in der Infarktrandzone eines chronischen Schweinemodell eines Myokardinfarkts entworfen.

Zusammenfassung

Cardiac regenerative Therapien zielen darauf ab, die verletzten Herzen bei Patienten mit ischämischer Herzkrankheit zu schützen und zu reparieren. Durch die Injektion von Stammzellen oder andere Biologika, die Angio- oder Vaskulogenese in die Infarkt Grenzzone (IBZ), Gewebeperfusion verbessert und das Myokard verbessern kann vor weiteren Schäden geschützt werden. Für eine maximale therapeutische Wirkung, wird angenommen, dass die regenerative Substanz am besten auf die IBZ geliefert wird. Dies erfordert eine genaue Injektionen und hat zur Entwicklung neuer Injektionstechniken geführt. Um diese neuen Techniken zu validieren, haben wir ein Validierungsprotokoll entwickelt, basierend auf Myokardgewebe Analyse. Dieses Protokoll umfasst Ganz Herz Herzmuskelgewebes Verarbeitung, die detaillierten zweidimensionalen (2D) ermöglicht und dreidimensionale (3D) Analyse der Herzanatomie und intramyokardialer Injektionen. In einem Schwein wurde Myokardinfarkt durch eine 90-min Okklusion der linken vorderen absteigenden Koronararterie erstellt. Vier Wochen später ein mixture eines Hydrogels mit superparamagnetischen Eisenoxidteilchen (SPIOs) und fluoreszierenden Kügelchen wurden in der IBZ mit einem minimal-invasiven Ansatz endokardialen injizieren. 1 h nach der Injektion wurde das Schwein getötet und das Herz wurde in Agarose (Agar) ausgeschnitten und eingebettet. Nach dem Erstarren des Agars, Magnetresonanztomographie (MRI), Aufschneiden des Herzens, und die Fluoreszenz-Bildgebung durchgeführt. Nach Bildnachverarbeitung wurde 3D-Analyse durchgeführt, die IBZ Zielgenauigkeit zu beurteilen. Dieses Protokoll stellt ein strukturiertes und reproduzierbares Verfahren für die Beurteilung der Zielgenauigkeit der intramyokardialen Injektion in den IBZ. Das Protokoll kann leicht verwendet werden, wenn die Verarbeitung von Narbengewebe und / oder Validierung der Injektionsgenauigkeit des ganzen Herzens erwünscht ist.

Einleitung

Ischämische Herzkrankheit hat die führende Todesursache weltweit seit den letzten Jahrzehnten ^ein. Akute Behandlung nach Myokardinfarkt zielt darauf ab , den Blutfluss zum Herzmuskel über perkutane koronare Intervention oder koronaren Bypass - Operation wiederherzustellen. In schweren Infarkten ist ein großer Bereich des Herzmuskels vernarbt, und diese Fälle führen oft bei ischämischen Herzinsuffizienz (HF) ^2. Aktuelle Behandlungsmöglichkeiten für HF-Konzentration auf die Prävention und die Erhaltung der Herzfunktion für die HF-Patienten, aber nicht auf die Regeneration.

Im letzten Jahrzehnt haben Herz regenerative Therapien als Behandlungsoption für HF ³ untersucht worden. Diese Therapie zielt darauf ab , biologische Präparate, wie Stammzellen oder Wachstumsfaktoren zu liefern, direkt auf den verletzten Myokard Revaskularisation, Kardiomyozyten Schutz, Differenzierung zu induzieren, und das Wachstum ^4. für eine optimaletherapeutische Wirkung, wird die Hypothese aufgestellt , dass die biologischen in der Infarkt Grenzzone (IBZ) injiziert werden , muß gute Gewebeperfusion für das Überleben der biologischen und für eine optimale Wirkung auf die Zielzone ^{5, 6} zu erleichtern. Mehrere Techniken wurden Identifizierung und Visualisierung der IBZ auszuführen entwickelt intramyokardialen Injektionen Führung ^{7, 8, 9, 10, 11.} Neben der Identifizierung und Visualisierung des IBZ beruht die Lieferung auch auf den Biomaterialien und Injektionskathetern verwendet. Um die Einspritzgenauigkeit der Abgabetechniken, ist eine genaue und reproduzierbare Quantifizierungsmethode Validierung erforderlich ist.

Wir haben ein Protokoll für die Ganz Herz Herzmuskelgewebe Verarbeitung entwickelt, die zweidimensionale (2D) bietet und drei-dimensional (3D) Bildgebung, die für die qualitative und quantitative Studie verwendet werden können soll. Das Protokoll umfasst den Einbettungsprozeß und die digitale Bildanalyse. In diesem Beitrag zeigen wir ein Protokoll für die Beurteilung der Zielgenauigkeit intramyokardialer Injektionen im IBZ in einem großen Schweinemodell des chronischen Myokardinfarkt.

Protokoll

Das In - vivo - Experiment wurde in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren , hergestellt durch das Institut für Labortierforschung durchgeführt. Das Experiment wurde von dem örtlichen Tierversuchen Committee genehmigt.

1. Herstellung von injizierbaren und Embedding-Lösung

1. Bereiten Sie die injizierbaren Gels.
   1. Bereiten 1 ml ureido-pyrimidinon (UPy) Gel gemäß zuvor beschriebenen Protokolle ^{12, 13.}
   2. Hinzufügen superparamagnetische Eisenoxidteilchen (SPIOs) zu der Lösung mit einer Konzentration von 15 ug / ml zu erhalten, und rührt das Gemisch 5 min zur gleichmäßigen Verteilung.
   3. Fügen Sie die fluoreszierenden Mikrokugeln zu der Lösung mit einer Konzentration von 10.000 Perlen / ml zu erhalten und rühren Sie die Mischung für 5 min zur gleichmäßigen Verteilung.
   4. Lagern Sie die resultierende Mischung bei Raumtemperatur in einer dunklen Umgebung. Warm und Wirbel oder rühren ter Lösung kurz vor der Injektion.
2. Bereiten Sie die Einbettungslösung.
   1. Beginnen mit Leitungswasser bei Raumtemperatur und füge Agarose (Agar) in einer Konzentration von 4 Gew%.
   2. die Lösung bis zum Siedepunkt, einen Mikrowellenherd und rühren häufig während der Erwärmung unter Verwendung langsam erwärmen. Nach dem Siedepunkt, Geschäft zu erreichen und halten Sie die Agar-Lösung über 70 ° C für 2 Stunden, damit eingeschlossene Luft an der Oberfläche.
   3. Lassen Sie den Agar auf eine Temperatur, bei Raumtemperatur abkühlen, zwischen 50 und 60 ° C bis zum Zeitpunkt des Einbettens.

2. Injektionsverfahren

1. Führen Prämedikation (anti-arrhythmischen Mittel, Anti-Thrombozyten - Therapie und Schmerzmittel), Anästhesie, venösen Zugang und Intubation, wie zuvor beschrieben ^14.
2. Führen Injektionen eine intramyokardialer Injektionskatheter (Table of Materials) verwendet wird . Für jede Injektion 0.2 ml des Gemisches wird in einem Bolus mit einer konstanten Rate von etwa 0,3 ml / min unter Verwendung einer Einspritzvorrichtung eingespritzt wird. Legen Sie die Injektionen an verschiedenen Positionen entlang der IBZ ^12.
3. Administrieren 0,2 ml / kg (1,0 mmol / ml) eine Gadolinium-Kontrastmittel 15 min vor dem Tier euthanizing.
4. Administrieren 20 ml 7,5% Kaliumchlorid intravenös das Tier euthanize.
5. Sichere mediastinal Zugang folgendes Protokoll Schritte 8,2-8,3, wie Koudstaal et al. ^14. Schneiden Sie die minderwertige Hohlvene 5 cm vom rechten Vorhof und entfernen Sie mit einer Saugvorrichtung ausströmendes Blut. Auszuschneiden das Herz und spülen Sie es mit 0,9% Salzlösung bei Raumtemperatur.

3. Embedding Verfahren

1. Bereiten Sie das Herz.
   1. Entfernen Sie den Herzbeutel aus dem Herzen, während die Vorhöfe zu halten und Ventrikel intakt. Präparieren der Aorta ascendens ± 1 cm oberhalb der Aortenklappe unter Verwendung von KlinkenbergSchere. Schneiden Sie die minderwertige Hohlvene ± 1 cm vom Atrium, und das gleiche für die Lungenvenen.
   2. Vernähen die Spitze des Herzens an der Unterseite eines Kunststoffeinbettungsbehälter (17 x 15 x 15 cm, B x D x H) unter Verwendung einer 2-0 Naht Flotation des Herzens während der Einbettung (1A) zu verhindern.
   3. Vernähen den verbleibenden Teil der Aorta zu den Rand des Behälters 2-0 verwenden, um sicherzustellen , dass das Herz zentriert ist und nicht zu berühren die Wände des Behälters (1B).

Abbildung 1: Schematische Übersicht und Fotografie des Embedding Container. (A) Schematische Darstellung des Einbettungsprozesses. Das Herz (rot) in dem Behälter (blau) gesichert mit Nähten. Nachdem das Herz mit der Agar-Lösung füllt, wird der Raum um das Herz gefüllt. Endlich,zwei starre Kunststoffrohre (gelb) in dem Behälter positioniert ist, neben, aber nicht das Herz zu berühren, als Referenz während Bildregistrierung zu dienen. (B) Fotografisches Bild eines Herzens in dem Einbettungs Behälter befestigt. Die Nähte werden an den Rand des Behälters festgeklemmt Moskitoschellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Einbetten das Herz in einem enddiastolischen förmige Geometrie.
   HINWEIS: Die Verhinderung von Luftblasenbildung notwendig ist. Wenn große vorhandene Luft in den Agarlösung Blasen, hält den Agar bei 40 ° C, so dass die Luftblasen an der Oberfläche.
   1. Klemmen Sie die untere Hohlvene Moskitoschellen. injiziert die Flüssigkeit langsam Agar mit 50-ml-Spritze in dem rechten Vorhof über die obere Hohlvene verwendet, bis sowohl das rechte Atrium und Ventrikel vollständig gefüllt sind.
   2. Klemmen Sie die Lungenvenen mit Mosquito Klemmen. passieren sanft ein Agar gefüllten 50-ml-Spritze retrograd durch die Aortenklappen. Langsam injizieren sind, um die Lösung in den linken Ventrikel (LV), bis der LV und dem linken Vorhof vollständig gefüllt ist. Nach der LV Füllung, klemmen die Aorta des Agar in der LV zu halten.
   3. Gießen Sie die restliche Agar in den Behälter, bis das Herz vollständig bedeckt ist. Platzieren zwei starre Kunststoffrohre innerhalb des Einbettungsbehälter als Referenzstrukturen für eine spätere Bildregistrierung (1A) zu dienen. Achten Sie darauf, die Rohre nicht die Wände des Behälters berühren oder das Herz.
   4. Lassen Sie das Agar bei 2 erstarren - 7 ° C.

4. Image Acquisition

1. Führen Quer ex vivo MRT - Aufnahmen des Herzens , die in dem Behälter eingebettet ist.
   1. Stellen Sie den Behälter mit dem eingebetteten Herz im Inneren einer Kopfspule (Table of Materials).
   2. Angulate die Scheiben auf den Boden des Behälters parallel ist. Benutzendie gleiche Ausrichtung und Angula in jeder ex vivo MRI - Sequenz.
   3. Zur Visualisierungen Myokard, führen eine fluide abgeschwächte inverse Recovery (FLAIR) -Sequenz mit den folgenden Parametern: Wiederholzeit [TR] / Echozeit [TE] = 10 s / 140 ms, Flipwinkel = 90 °, Pixelgrße = 0,5 x 0,5 mm, Sehfeld [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 Matrix und 3 mm Schichtdicke.
   4. Um den Myokardinfarkt zu visualisieren, führt ein late-Gadolinium verstärkt (LGE) -Sequenz mit folgenden Parametern: [TR] / [TE] = 5,53 ms / 1,69 ms, Flipwinkel = 25 °, Pixelgrße = 1,0 x 1,0 mm, [ FOV] = 169 x 169 mm, 176 x 176 Matrix und 3 mm Schichtdicke.
   5. Zur Visualisierung SPIOs, führen Sie einen T2 * -gewichteten Gradientenecho-Sequenz mit den folgenden Parametern: [TR] / [TE] = 88,7 ms / 15 gleichmäßig verteilt TEs mit einem Bereich von 1,9 bis 24,6 ms, Flipwinkel = 15 °, Pixel size = 0,5 x 0,5 mm, [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 Matrix und 3 mm Schichtdicke.
2. Gewebe Vorarbsingen
   1. Drehen Sie den Behälter auf den Kopf und damit die Luft zwischen dem Agar und den Seiten des Behälters der festen Agar-Lösung, einschließlich des Herzens zu entfernen, aus dem Behälter. Entfernen Sie die Kunststoffstäbe aus dem festen Agar.
   2. Abschnitt des Agar-Block das Herz in 5-mm-Scheiben von der Spitze zur Basis des Herzens unter Verwendung einer Schneidemaschine enthält. Halten Sie die Abwinkelung der geschnittenen Scheiben der gleichen wie in den aufgenommenen MR-Bildern, die durch die parallel zu dem Boden des Agarblock schneiden.
   3. Beflecken den Agar Scheiben (einschließlich des Herzens) für 15 min in 1 Gew% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) bei 37 ° C in 0,9% Kochsalzlösung gelöst, und fotografieren die Scheiben auf beiden Seiten von einer senkrechten Ansicht (Fig 2A). Als nächstes sorgfältig die Scheiben in 0,9% Kochsalzlösung spülen.
      HINWEIS: In dieser Studie verwendeten wir eine dSLR Setup mit einem entsprechenden Objektiv / Objektiv, ein Stativ und eine gleichmäßige Beleuchtung. Allerdings dienten die Fotos nur als Kontrolle für die Beurteilung der Narbe Region,so hätten wir eine andere Einstellung verwendet.
3. Fluoreszenz-Imaging
   HINWEIS: In Abhängigkeit von den Anregungs- und Emissionswellenlängen der fluoreszierenden Mikrokugeln, wählen Sie den entsprechenden Filterblock und Anregungslaser ( zum Beispiel der roten Microbeads hier haben Anregungs- und Emissionswellenlängen von 580 nm und 605 nm, jeweils verwendet, weshalb der Laser ausgewählten Anregungs und Bandpaß-Filter wurden auf 532 nm eingestellt, 580/30 und 610/30 nm nm, jeweils).
   1. Wählen Sie Fluoreszenz-Mode-Bildgebung auf dem variabler Modus Scanner. Stellen Sie die Photovervielfacherröhre auf 430 V oder gleichwertig und die Pixelgröße zu 100 x 100 um. Wählen eines Anregungslaser (532 nm) am nächsten zu der Anregungswellenlänge der fluoreszierenden Mikroperlen.
   2. Für den ersten Filterblock, wählen Sie einen Bandpassfilter (580/30 nm), die mit der Emissionswellenlänge der injizierten Fluoreszenzkügelchen (Kanal 1) überlappt. Wählen eines Bandpaßfilters zum zweiten Filterblock (610/30) außerhalb der eMission Wellenlänge (Kanal 2).
      HINWEIS: Der zweite Filterblock als negative Kontrolle dient und Autofluoreszenz zu entfernen, während der Injektionsstellen intakt zu halten.
   3. Abtasten beide Seiten des Agars Scheiben im Fluoreszenzmodus des variablen Modus-Laserscanner mit den beiden Kanälen. Stellen Sie sicher, dass jede Scheibe vollständig abgetastet wird, einschließlich der Bezugslöcher.

5. Nachverarbeitung

HINWEIS: Der erste Schritt bei der Bildnachbearbeitung ist die manuelle Segmentierung des Myokards in-house entwickelte Skripte mit der Endo- und epikardialen Grenzen zu verfolgen, sowie die Injektionsstellen. Dies ist das gleiche für beide MRI und Fluoreszenz-Scans.

1. Segment des Myokard in dem MRI-Scans.
   1. Segment der endokardialen und epikardialen LV grenzt an die FLAIR-MRT Sequenzbildern.
   2. Kopieren der LV Segmentierung von Schritt 5.1.1 auf den LGE-MRI-Datensatz und das Segment die Narbe auf der LGE MRI Sequenz.
   3. Kopieren den Myokards Segmentierung von Schritt 5.1.1 auf den T2 * -gewichteten Daten-Set und das Segment der SPIO Abscheidungen im LV Myokard.
2. Die Fluoreszenzbilder verarbeiten und führen Segmentierungen.
   1. Laden Sie die Dateien aus dem variablen Modus Scanner erhalten und ein separates Bild jeder Querschnittsherzscheibe machen.
   2. Flip die Scheiben, die in der Basis abgetastet wurden Orientierung Apex und sortieren die Fluoreszenzbilder zu einem Stapel für beide Kanäle, die von der Spitze zur Basis ausgerichtet ist.
   3. Segment der endokardialen und epikardialen LV grenzt an die Fluoreszenzbilder.
   4. Segment die Narbe manuell auf die Fluoreszenzbilder und verwenden Sie die LGE-MRT-Untersuchung und die Fotos Narbe Morphologie zu bestätigen.
   5. Subtrahiert den Bildstapel von Kanal 2 aus dem Bildstapel von Kanal 1 zu Autofluoreszenz auszuschließen. Manuell Segment der fluoreszierenden Mikroperlen-Abscheidungen und verwenden, um die T2 * Bilder zur Bestätigung.
3. Erschaffeneine anatomisch korrekte 3D-Geometrie, eine starre Ausrichtung der Scheiben in dem Bildstapel durchzuführen, basierend auf den Referenzstrukturen (die durch die starren Rohre geschaffen Löcher). Berechnen und speichern, die angewandt Translation und Rotation für jedes Bild.
4. Wenden Sie die gespeicherten Transformationen auf die Bildstapeln und den Segmentierungen. interpoliert linear die Segmentierungen von beiden Seiten der Scheiben des ursprünglichen Schichtdicke zu rekonstruieren und ein 3D-Modell der Daten zu erstellen.

6. Analyse

1. Führen Sie 2D- und / oder 3D-Messungen des Abstandes zwischen den Zentren der Injektionsstellen und den IBZ der Injektionsgenauigkeit zu beurteilen. Messen Sie den Abstand entlang der Endokardgrenze der LV Segmentierung. In 2C und 2F ist ein Beispiel für die 2D- und 3D - Messungen wird durch die rote Linie angezeigt.

Ergebnisse

Gewebeein

Durch die Einbettung, eine enddiastolische förmige Geometrie hergestellt wurde. Der Agar erfolgreich an das Herzgewebe eingehalten, um das Gewebe ermöglicht , in der gewünschten Abwinkelung mit gleichen Schichtdicken (2A und 2C) wird in Scheiben geschnitten.

Beurteilung Narben und die Injektionsstelle

Diskussion

Whole-heart 3D Myokardgewebe Verarbeitung gemäß diesem Protokoll stellt ein strukturiertes Verfahren, das die 3D-Analyse des Infarkts ermöglicht, die IBZ, und die durchgeführten Injektionen in Bezug auf die Herzanatomie. Das Füllvolumen des Herzens hängt von der gewünschten Analyse. In dieser Studie wurden die Injektionsgenauigkeit beurteilen zu können, war es unser Ziel, das Herz ähneln der enddiastolischen Geometrie so nah wie möglich zu füllen. Zur Durchsetzung dieser wird der LV-Apex zum Boden des Behält...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Braun
Agarose	Roche Diagnostics		Scientific grade multipurpose agar
Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410	GE Healthcare
Embedding container			Plastic, dimensions 17 x 14.5 x 14 cm
FluoSpheres Polystyrene Microspheres	Invitrogen	F8834	red, 10 µm
Gadolinium	Gadovist		1.0 mmol/mL
dS 32 channel head coil	Philips		Or similar
Matlab	Mathworks		To insure compatability 2015a or newer
Meat slicer	Berkel
Myostar injection catheter	Biosense Webster
Super paramagnetic iron oxide particles	Sinerem
Triphenyl-tetrazolium chloride	Merck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0	Ethicon