3D цельнозерновой сердца Инфаркт Анализ тканей

Резюме

Этот протокол описывает новый метод для сравнения 3D цельной сердечной ткани миокарда с МРТ. Она предназначено для точной оценки интрамиокардиальных инъекций в пограничной зоне инфаркта хронической модели свиньи инфаркт миокарда.

Аннотация

Сердечные регенеративные терапии направлены на защиту и ремонт травмированного сердца у пациентов с ишемической болезнью сердца. Вводя стволовые клетки или другие биологические препараты, которые повышают ангио- или васкулогенез в пограничной зону инфаркта (IBZ), тканевая перфузия улучшается, и миокард может быть защищена от дальнейшего повреждения. Для достижения максимального терапевтического эффекта, он выдвинул гипотезу о том, что регенеративное вещество лучше всего поставлено на IBZ. Это требует точных инъекций и привел к разработке новых методов инъекций. Для проверки этих новых методов, мы разработали протокол проверки на основе анализа ткани миокарда. Этот протокол включает в себя целое сердце обработки ткани миокарда, которая позволяет подробный двумерный (2D) и трехмерной (3D) анализ сердечной анатомии и интрамиокардиальных инъекций. В свинью, инфаркт миокарда был создан 90-минутной окклюзии левой передней нисходящей коронарной артерии. Четыре недели спустя, микстЮр гидрогель с суперпарамагнитными частицами оксида железа (SPIOs) и флуоресцентными шариками вводили в IBZ с использованием минимально-инвазивным эндокардом подхода. 1 ч после процедуры инъекции, свинья была умерщвлены, и сердце вырезали и помещали в агарозе (агар). После затвердевания агара, были проведены магнитно-резонансная томография (МРТ), нарезка сердца и визуализация флуоресценции. После того, как изображение после обработки, 3D-анализ был проведен для оценки точности ориентации IBZ. Этот протокол обеспечивает структурированный и воспроизводимый метод для оценки точности ориентации интрамиокардиальных инъекций в IBZ. Протокол может быть легко использован, когда обработка рубцовой ткани и / или проверки точности впрыска всего сердца желательно.

Введение

Ишемическая болезнь сердца является ведущей в мире причина смерти в течение последних десятилетий ^1. Острое лечение после инфаркта миокарда является восстановление кровотока в миокарде с помощью чрескожного коронарного вмешательства или коронарного шунтирования. В тяжелых инфарктов, большая площадь миокарда шрамы, и эти случаи часто приводят к ишемической сердечной недостаточности (СН) ^2. Современные варианты лечения ВЧ внимание профилактике и сохранению функции сердца для пациентов с СН, но не на регенерацию.

В течение последнего десятилетия, сердечная регенеративная терапия была исследована как вариант лечения для HF ^3. Эта терапия стремится поставлять биопрепараты, такие как стволовые клетки или факторы роста, непосредственно травмированный миокард , чтобы вызвать реваскуляризации, защиту кардиомиоцитов, дифференцировку и рост ^4. Для оптимальнойтерапевтический эффект, она выдвинута гипотеза о том , что биологическое должен быть введен в зону инфаркта границы (IBZ) для облегчения хорошей тканевой перфузии для выживания биологического и для оптимального эффекта в целевой зоне ^{5, 6.} Несколько методы были разработаны , чтобы выполнить идентификацию и визуализацию IBZ , чтобы направлять интрамиокардиальную инъекцию ^{7, 8, 9, 10, 11.} Помимо идентификации и визуализации IBZ, доставка также опирается на биоматериалов и нагнетательных катетеров, используемых. Для проверки точности впрыска методов доставки, требуется точный и воспроизводимый метод количественного определения.

Мы разработали протокол для целого сердца обработки ткани миокарда, который предлагает двумерный (2D) и трех-dimensioNAL (3D) изображения, которые могут быть использованы для качественного и количественного анализа целей. Протокол охватывает процесс встраивания и анализ цифрового изображения. В данной работе мы демонстрируем протокол для оценки точности ориентации интрамиокардиальных инъекций в IBZ в большом свиных модель хронического инфаркта миокарда.

протокол

Эксперимент в естественных условиях был проведен в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных , подготовленных Институтом лабораторных исследований животных. Эксперимент был одобрен Комитетом местного Эксперименты на животных путем.

1. Подготовка и внедрение инъекционными Solution

1. Подготовьте инъекционный гель.
   1. Подготовить 1 мл уреидо-пиримидинона (UPy) гель в соответствии с ранее описанными протоколами ^{12, 13.}
   2. Добавить суперпарамагнитных частицы оксида железа (SPIOs) к раствору, чтобы получить концентрацию 15 мкг / мл и перемешивали смесь в течение 5 мин для равномерного распределения.
   3. Добавьте флуоресцентные микрошарик к раствору, чтобы получить концентрацию 10000 бусин / мл и перемешивали смесь в течение 5 мин для равномерного распределения.
   4. Хранить полученную смесь при комнатной температуре в темном помещении. Теплый и вихревым или размешать тон раствор незадолго до процедуры инъекции.
2. Приготовьте раствор вложенности.
   1. Начну с водопроводной водой при комнатной температуре и добавляют агарозов (агар) до концентрации 4% масс.
   2. Медленно нагревать раствор до температуры кипения с использованием микроволновой печи и часто перемешивают во время нагревания. При достижении точки кипения, хранить и держать агар раствора выше 70 ° С в течение 2 ч, чтобы захваченный воздух к поверхности.
   3. Разрешить агар не остыть при комнатной температуре до температуры в диапазоне от 50 до 60 & deg; С до времени внедрения.

Процедура 2. Инъекции

1. Выполните премедикацию (антиаритмические агент, анти-тромбоциты терапию и обезболивающую), анестезию, венозный доступ и интубацию, как описано выше ^14.
2. Выполнение инъекции с использованием катетера интрамиокардиальной инъекции (таблица материалов). Для каждой инъекции, 0.2 мл смеси вводят в один болюс с постоянной скоростью приблизительно 0,3 мл / мин с использованием устройства для инъекций. Поместите инъекции в различных положениях вдоль IBZ ^12.
3. Администрирование 0,2 мл / кг (1,0 ммоль / мл) в гадолиний-контрастный агент на основе 15 мин до эвтаназии животных.
4. Администрирование 20 мл 7,5% хлорида калия внутривенно эвтаназии животных.
5. Безопасный медиастинальная доступ в соответствии с протоколом шаги 8.2 - 8.3, как описано Koudstaal и соавт. ^14. Обрежьте нижнюю полую вену 5 см от правого предсердия и удалить вытекания крови с всасывающим устройством. Акцизный сердце и промыть его с 0,9% физиологическим раствором при комнатной температуре.

3. Порядок Встраивание

1. Подготовьте сердце.
   1. Удалить перикард из сердца, сохраняя предсердия и желудочки нетронутыми. Рассеките восходящую аорту ± 1 см выше аортального клапана с использованием Клинкенберганожницы. Обрежьте нижнюю полую вену ± 1 см от предсердия, и сделать то же самое для легочных вен.
   2. Шовная верхушку сердца к нижней части пластикового контейнера встраивания (17 х 15 х 15 см, Ш х Г х В ) с помощью 2-0 шва , чтобы предотвратить плавучесть сердца во время погружения (Рисунок 1А).
   3. Шовный оставшуюся часть аорты на краях контейнера с использованием 2-0, убедившись , что сердце центрируется и не касаясь стенок контейнера (Фиг.1В).

Рисунок 1: Схема и фотография Встраивание контейнера. (А) Схематический обзор процесса погружения. Сердце (красный) закреплено в контейнере (синий) с помощью наложения швов. После заполнения сердца раствора агара, пространство вокруг сердца заполнено. В заключение,две жесткие пластиковые трубы (желтые) расположены в контейнере, рядом, но не касаясь сердца, чтобы служить в качестве эталона при регистрации изображений. (В) Фотографии сердца , обеспеченном в контейнере вложения. Швы прижимаются к ободу емкости с использованием противомоскитных зажимов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Встраивание сердца в конечной диастолическом типе геометрии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвращение создания пузырьков воздуха необходимо. Если большие воздушные пузырьки присутствуют в растворе агара, держать агар при 40 ° С, что позволяет пузырьки воздуха к поверхности.
   1. Зажмите нижней полой вены с помощью москитных зажимов. Медленно вводит жидкий агар с помощью шприца 50 мл в правом предсердии через верхнюю полую вену, пока оба правое предсердие и желудочек не полностью заполнены.
   2. Хомут легочных вен с использованием Москитуплотнительные зажимы. Осторожно пройти агар заполненных 50-мл шприцев ретроградны через аортальные клапаны. Медленно вводит раствор в левом желудочке (ЛЖ) до левого желудочка и левого предсердия было полностью заполнены. После заполнения LV, зажим аорту, чтобы держать агар в ЛЖ.
   3. Влить оставшийся агар в контейнер, пока сердце не будет полностью покрыто. Поместите два жестких пластиковые трубы внутри контейнера вложения , чтобы служить в качестве опорных структур для последующей регистрации изображений (рис 1А). Убедитесь, что трубки не касаться стенок контейнера или сердца.
   4. Пусть агар затвердевать при 2 - 7 ° C.

4. Получение изображения

1. Выполнение поперечной бывшей естественных условий МРТ сердца, внедренная в контейнере.
   1. Поместите контейнер со встроенным сердцем внутри головки катушки (таблица материалов).
   2. Угловыми ломтики параллельно нижней части контейнера. использованиета же ориентация и углы в каждой экс виво последовательности МРТ.
   3. Для визуализации миокарда, выполнить жидкости ослабленной обратной восстановления (FLAIR) последовательности со следующими параметрами: повторение раз [TR] / эхо времени [TE] = 10 с / 140 мс, флип угол = 90 °, размер пиксела = 0,5 х 0,5 мм, поле обзора FOV [] = 169 х 169 мм, 320 х 320 матрицы, а также 3-мм толщина среза.
   4. Для того, чтобы визуализировать инфаркт миокарда, выполнить позднюю-гадолиний расширенной (LGE), последовательность со следующими параметрами: [TR] / [ТЕ] = 5,53 мс / 1,69 мс, флип угол = 25 °, размер пиксела = 1,0 х 1,0 мм, [ FOV] = 169 х 169 мм, 176 176 матрицы, а также 3-мм толщина среза.
   5. Для того, чтобы визуализировать SPIOs, выполнить Т2 * -weighted градиент эхо последовательности со следующими параметрами: [TR] / [ТЕ] = 88,7 мс / 15 одинаково распределенных СПЭ с диапазоном 1,9 - 24,6 мс, флип угол = 15 °, пиксель размер = 0,5 х 0,5 мм, [FOV] = 169 х 169 мм, 320 х 320 матрицы, а также 3-мм толщина среза.
2. Тканевые процеспеть
   1. Переверните контейнер вверх дном и позволить воздуху между агара и стенками контейнера для удаления твердого раствора агара, в том числе сердца, из контейнера. Удалите пластиковые стержни из твердого агара.
   2. Раздел агар блок, содержащий сердце в 5-мм кусочки от вершины к основанию сердца с помощью резки мяса. Хранить ангуляцию из разрезанных ломтиков такие же, как в полученных изображениях МРА путем разрезания параллельно нижнюю частью агара блока.
   3. Пятно агар ломтиков ( в том числе сердца) в течение 15 мин в 1% масс 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) , растворенного в 0,9% солевом растворе при 37 ° C, и сфотографировать ломтики с обеих сторон от перпендикулярного зрения (рис 2А). Затем, тщательно промыть ломтики в 0,9% солевом растворе.
      Примечание: В данном исследовании мы использовали установку цифровой зеркальной камеры с соответствующей линзы / объектива, штатив, и равномерное освещение. Тем не менее, фотографии служили только в качестве контроля для оценки области рубца,таким образом, мы могли бы использовать различные настройки.
3. флуоресцентные изображения
   Примечание: В зависимости от возбуждения и излучения длин волн флуоресцентных микрогранул, выберите соответствующий блок фильтра и возбуждения лазеров (например, красные микросферы , используемые здесь , имеют возбуждения и эмиссии длинами волн 580 нм и 605 нм, соответственно, поэтому выбранный лазер возбуждения и полосовые фильтры были установлены на 532 нм, 580/30 нм и 610/30 нм, соответственно).
   1. Выберите флуоресцентной режим формирования изображения на сканере с переменным режимом. Установите фотоэлектронный умножитель до 430 В или эквивалентном и размер пикселя до 100 х 100 мкм. Выбор лазерного возбуждения (532 нм), ближе всего к длине волны возбуждения флуоресцентных микрогранул.
   2. Для первого блока фильтров, выберите полосовой фильтр (580/30 нм), который перекрывается с длиной волны излучения инжектированных бусин флуоресценции (канал 1). Выберите полосовой фильтр для блока второго фильтра (610/30) вне еДлина волны миссии (канал 2).
      Примечание: Второй блок фильтра служит в качестве отрицательного контроля и удаление автофлуоресценции при сохранении инъекции сайтов нетронутыми.
   3. Сканирование обоего сторон агаровых срезов в режиме флуоресценции лазерного сканера с переменным режимом с использованием двух каналов. Убедитесь, что каждый кусочек полностью сканируется, в том числе опорных отверстий.

5. Последующая обработка

Примечание: первый шаг в изображении после обработки является ручной сегментацией миокарда с использованием собственной разработкой сценариев для отслеживания эндо- и эпикардиальные границ, а также в местах инъекций. Это же как для МРТ и флуоресцентного сканирования.

1. Сегмент миокард в МРТ.
   1. Сегментация эндокарда и эпикарда Лв Бордерс на изображение последовательности FLAIR МРТ.
   2. Скопируйте сегментацию LV с шага 5.1.1 к набору данных LGE-МРТ и сегмента рубца на последовательности LGE МРТ,
   3. Скопируйте сегментацию миокарда, начиная с шага 5.1.1 Т2 * -weighted набора данных и сегментировать отложений Spio в миокарде ЛЖ.
2. Процесс флуоресценции изображений и выполнения сегментирования.
   1. Загрузите файлы, полученные от сканера переменного режима и сделать отдельное изображение каждого поперечного сечение среза сердца.
   2. Флип ломтики, которые были отсканированы в основания к вершине ориентации и сортировки флуоресцентных изображений в стеке для обоих каналов, которые ориентированы от вершины к основанию.
   3. Сегментация эндокарда и эпикарда Лв Бордерс на изображениях флуоресценции.
   4. Сегмент рубец вручную на изображении флуоресцентного и использовать LGE-МРТ и фотографии, чтобы подтвердить рубцовую морфологию.
   5. Вычтите стек изображения канала 2 из стека изображения канала 1, чтобы исключить автоматическую флуоресценцию. сегмент вручную флуоресцентное микросферическое осаждение и использовать T2 * изображения для подтверждения.
3. Создаватьанатомически-правильное 3D геометрии, выполнить жесткую регистрацию срезов в стеке изображения на основании опорных структур (отверстий, созданных жестких трубок). Рассчитать и хранить прикладной сдвиг и поворот каждого изображения.
4. Применить сохраненные преобразования для изображения стеки и сегментирования. Линейно интерполировать сегментирование обоего сторон ломтиков, чтобы восстановить первоначальную толщину среза и создать 3D модель данных.

6. Анализ

1. Провести измерения 2D и / или 3D расстояния между центрами в местах инъекций и IBZ для оценки точности впрыска. Измерьте расстояние вдоль границы эндокарда сегментации ЛЖ. На фигуре 2C и 2F, пример измерений 2D и 3D обозначается красной линией.

Результаты

Ткань Встраивание

С помощью процесса погружения, была создана конечно-диастолический типа геометрии. Агар успешно приклеен к ткани сердца, что позволяет ткань , чтобы быть нарезан на желаемой ангуляции с равными срезами толщиной (р...

Обсуждение

Всего-сердце 3D обработки ткани миокарда в соответствии с этим протоколом обеспечивает структурированный метод, который позволяет 3D-анализ миокарда, в IBZ и выполненные инъекций по отношению к сердечной анатомии. Объем наполнения сердца зависит от желаемого анализа. В данном исследован...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Braun
Agarose	Roche Diagnostics		Scientific grade multipurpose agar
Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410	GE Healthcare
Embedding container			Plastic, dimensions 17 x 14.5 x 14 cm
FluoSpheres Polystyrene Microspheres	Invitrogen	F8834	red, 10 µm
Gadolinium	Gadovist		1.0 mmol/mL
dS 32 channel head coil	Philips		Or similar
Matlab	Mathworks		To insure compatability 2015a or newer
Meat slicer	Berkel
Myostar injection catheter	Biosense Webster
Super paramagnetic iron oxide particles	Sinerem
Triphenyl-tetrazolium chloride	Merck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0	Ethicon