Análise Tecidos do Miocárdio Whole-coração 3D

Resumo

Este protocolo descreve um novo método para a comparação 3D do tecido do miocárdio todo-coração com a RM. Este é concebido para a avaliação precisa de injecções intramiocárdicos na zona de fronteira do enfarte de um modelo suíno crónica de enfarte do miocárdio.

Resumo

terapias regenerativas cardíacos visam proteger e reparar o coração ferido em pacientes com doença isquêmica do coração. Por injecção de células estaminais ou outros produtos biológicos que aumentam a angio- ou vasculogénese para a zona de fronteira do enfarte (IBZ), a perfusão de tecido é melhorada, e o miocárdio pode ser protegido de danos adicionais. Para efeito terapêutico máximo, é a hipótese de que a substância regenerativa é melhor entregue ao IBZ. Isso requer injeções precisas e levou ao desenvolvimento de novas técnicas de injeção. Para validar estas novas técnicas, criamos um protocolo de validação com base na análise de tecido do miocárdio. Este protocolo inclui o processamento do tecido do miocárdio do coração de todo-que permite detalhada bidimensional (2D) e análise tridimensional (3D) da anatomia cardíaca e injecções intramiocárdicos. Em um porco, enfarte do miocárdio foi criado por uma 90-min a oclusão da artéria coronária descendente anterior da artéria coronária. Quatro semanas mais tarde, um mixture de um hidrogel com partículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIOs) e esferas fluorescentes foi injectado no IBZ usando uma abordagem minimamente invasiva endocárdico. 1 h após o procedimento de injecção, o porco foi sujeito a eutanásia, e o coração foi excisado e embebidas em agarose (agar). Depois da solidificação do agar, foram realizadas de imagiologia por ressonância magnética (IRM), o corte do coração, e imagens de fluorescência. Depois de pós-processamento, análise 3D foi realizada para avaliar a precisão da focalização IBZ. Este protocolo fornece um método estruturado e reprodutível de avaliação da precisão de segmentação de injecções intramiocárdicos no IBZ. O protocolo pode ser facilmente utilizado, quando o processamento do tecido cicatricial e / ou de validação da precisão injecção de todo o coração é desejada.

Introdução

Doença cardíaca isquêmica tem sido a principal causa de morte no mundo nas últimas décadas ^1. O tratamento agudo após enfarte do miocárdio tem como objectivo restaurar o fluxo sanguíneo ao miocárdio através de intervenção coronária percutânea ou enxerto de bypass da artéria coronária. Em infartos graves, uma grande área do miocárdio está cicatrizada, e nestes casos, muitas vezes resultar em insuficiência cardíaca isquêmica (IC) ^2. opções de tratamento atuais para foco HF na prevenção e na preservação da função cardíaca dos pacientes com IC, mas não sobre a regeneração.

Na última década, terapias regenerativas cardíacos têm sido investigados como uma opção de tratamento para HF ^3. Esta terapia tem como objectivo entregar produtos biológicos, tais como células estaminais ou factores de crescimento, directamente para o miocárdio lesionado para induzir revascularização, protecção de cardiomiócitos, a diferenciação, o crescimento e ^4. para um óptimoefeito terapêutico, se a hipótese de que a biológica deve ser injectado na zona de fronteira do enfarte (IBZ) para facilitar uma boa perfusão de tecidos para a sobrevivência da biológica e para um efeito óptimo para a zona alvo ^{5, 6.} Várias técnicas têm sido desenvolvidas para realizar a identificação e visualização do IBZ para guiar injecções intramiocárdicos ^{7, 8, 9, 10, 11.} Além identificação e visualização do IBZ, a entrega também depende dos biomateriais e cateteres de injecção utilizados. Para validar a precisão injecção das técnicas de entrega, um método de quantificação precisas e reprodutíveis é necessária.

Nós desenvolvemos um protocolo para todo o coração de processamento de tecido do miocárdio que oferece bidimensional (2D) e três dimensional de imagem (3D), o qual pode ser usado para o estudo qualitativo e quantitativo visa. O protocolo abrange o processo de incorporação e da análise de imagem digital. Neste trabalho, nós demonstramos um protocolo para a avaliação da exactidão segmentação de injecções intramiocárdicos na IBZ em um grande modelo porcino de enfarte do miocárdio crónicas.

Protocolo

A experiência in vivo foi conduzida de acordo com o Guia para o Cuidado e Utilização de Animais de Laboratório preparado pelo Institute of Laboratory Animal Research. O experimento foi aprovado pela Comissão de Experimentação Animal local.

1. Preparação de injectáveis ​​e incorporação Solução

1. Prepara-se o gel injectável.
   1. Preparar 1 mL de ureído-pirimidinona gel (UPy) de acordo com protocolos anteriormente descritos ^{12, 13.}
   2. Adicionar partículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIOs) à solução para obter uma concentração de 15 ug / mL e agita-se a mistura durante 5 min para distribuição uniforme.
   3. Adicionar as microesferas fluorescentes à solução para obter uma concentração de 10.000 contas / ml e agita-se a mistura durante 5 min para distribuição uniforme.
   4. Armazenar a mistura resultante à temperatura ambiente em um ambiente escuro. Quente e vortex ou agitação tele solução pouco antes do procedimento de injeção.
2. Preparar a solução de embebimento.
   1. Comece com água da torneira à temperatura ambiente e adiciona-agarose (agar) a uma concentração de 4% em peso.
   2. Lentamente aquecer a solução para o ponto de ebulição usando um forno de microondas e mexa com freqüência durante o aquecimento. Ao atingir o ponto de ebulição, armazenar e manter a solução de agar superior a 70 ° C durante 2 h para permitir que o ar preso para a superfície.
   3. Permitir que a agar de arrefecer à temperatura ambiente, a uma temperatura entre 50 e 60 ° C até ao momento da incorporação.

2. Injeção Procedimento

1. Realizar uma pré-medicação (agentes anti-arrítmicos, a terapia anti-plaquetas, e medicação para a dor), anestesia, o acesso venoso, e intubação, tal como previamente descrito ^14.
2. Realizar injecções, usando um cateter de injeco intramiocardial (Tabela de Materiais). Para cada injecção, 0.2 ml da mistura é injectada em um bólus a uma velocidade constante de cerca de 0,3 mL / min, utilizando um dispositivo de injecção. Coloque as injecções em diferentes posições ao longo da IBZ ^12.
3. Administrar 0,2 ml / kg (1,0 mmol / mL) de uma base de gadolínio-agente de contraste de 15 min antes da eutanásia do animal.
4. Administrar 20 mL de cloreto de potássio a 7,5% por via intravenosa, para eutanásia do animal.
5. Acesso seguro mediastino seguinte protocolo passos 8,2-8,3, tal como descrito por Koudstaal et al. ^14. Cortar a veia cava inferior a 5 cm da aurícula direita e remover efusão de sangue com um dispositivo de sucção. Excisar o coração e lave-o com 0,9% de soro fisiológico à temperatura ambiente.

3. Embedding Procedimento

1. Prepare o coração.
   1. Remover o pericárdio do coração, mantendo os átrios e ventrículos intacta. Dissecar a aorta ascendente ± 1 cm acima da válvula aórtica utilizando Klinkenbergtesouras. Cortar a veia cava inferior ± 1 cm desde o átrio, e fazer o mesmo para as veias pulmonares.
   2. Suturar o vértice do coração para o fundo de um recipiente de plástico incorporando (17 x 15 x 15 cm, W x D x H), utilizando um fio de sutura 2-0 para evitar a flutuação do coração durante a incorporação (Figura 1A).
   3. Suturar a parte restante da aorta aos aros do recipiente usando 2-0, certificando-se de que o coração está centrado e não tocar as paredes do recipiente (Figura 1B).

Figura 1: Vista geral esquemática e fotografia da incorporação de recipiente. (A) vista geral esquemática do processo de embebimento. O coração (vermelho) é fixado no recipiente (azul) utilizando suturas. Após o enchimento do coração com a solução de agar, o espaço em torno do coração está cheio. Finalmente,dois tubos de plástico rígida (amarelo) estão posicionados no recipiente, ao lado de, mas não tocando o coração, para servir como uma referência durante o registo de imagens. (B) fotografia de um coração fixado no recipiente de incorporação. As suturas são presas até a borda do recipiente utilizando grampos de mosquito. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Incorporar o coração em uma geometria diastólica final-like.
   NOTA: A prevenção da criação de bolhas de ar é necessária. Se grandes bolhas de ar presentes na solução de agar, manter o agar a 40 ° C, permitindo que as bolhas de ar à superfície.
   1. Prender o cava inferior veia usando braçadeiras de mosquito. Lentamente injectar o líquido de agar utilizando uma seringa de 50 ml no átrio direito, através da veia cava superior, até que tanto a aurícula e o ventrículo direito são completamente preenchido.
   2. Fixar as veias pulmonares usando MosquitO grampos. Suavemente passar uma seringa cheia de agar-50-mL retrogradamente através das válvulas aórticas. Lentamente, injectar a solução no ventrículo esquerdo (VE) até que o LV e o átrio esquerdo está completamente cheia. Após o enchimento do VE, prender a aorta para manter o agar no VE.
   3. Verter a ágar remanescente para dentro do recipiente até que o coração está totalmente coberta. Colocar dois tubos de plástico rígido no interior do recipiente incorporando a servir como estruturas de referência para o registo de imagem mais tarde (Figura 1A). Certifique-se os tubos não toque nas paredes do recipiente ou o coração.
   4. Deixar o agar solidificar a 2-7 ° C.

4. Aquisição de Imagem

1. Execute transversais ex vivo exames de ressonância magnética do coração que está incorporado no recipiente.
   1. Colocar o recipiente com o coração encaixado no interior de uma bobina de cabeça (Tabela de Materiais).
   2. Angulate as fatias paralelas ao fundo do recipiente. Usara mesma orientação e angulação em cada sequência ex vivo de ressonância magnética.
   3. Para visualizar miocárdio, executar uma recuperação inversa atenuada-fluido sequência (DOM) com os seguintes parâmetros: tempo de repetição [TR] / tempo de eco [TE] = 10 s / 140 ms, ângulo aleta = 90 °, o tamanho de pixel = 0,5 x 0,5 mm, campo de visão [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 da matriz, e a espessura do corte de 3 mm.
   4. Para visualizar o enfarte do miocárdio, realizar um fim de gadolínio sequência (LGE) com os seguintes parâmetros: [TR] / [TE] = 5,53 ms / 1,69 ms, ângulo aleta = 25 °, o tamanho de pixel = 1,0 x 1,0 mm, [ FOV] = 169 x 169 mm, 176 x 176 da matriz, e de 3 mm de espessura de corte.
   5. Para visualizar SPIOs, executar um gradiente ponderadas em T2 * sequência de eco com os seguintes parâmetros: [TR] / [TE] = 88,7 ms / 15 EA igualmente distribuídos com uma gama de 1,9 - 24,6 ms, ângulo aleta = 15 °, de pixel tamanho = 0,5 x 0,5 mm, [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 da matriz, e de 3 mm de espessura de corte.
2. proces tecidocantar
   1. Fazer rodar o recipiente de cabeça para baixo e permitir que o ar entre o agar e os lados do recipiente para remover a solução de agar sólido, incluindo o coração, a partir do recipiente. Retirar as hastes de plástico a partir do agar sólido.
   2. Secção do bloco de agar contendo o coração em fatias de 5 mm a partir do vértice para a base do coração utilizando um cortador de carne. Manter a angulação das fatias cortadas da mesma forma que nas imagens de RM adquiridos por corte paralelo à parte inferior do bloco de agar.
   3. Manchar as fatias de agar (incluindo o coração) durante 15 min em 1% em peso de 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) dissolvido em 0,9% de solução salina a 37 ° C, e fotografar as fatias de ambos os lados a partir de uma vista perpendicular (Figura 2A). Em seguida, lavar cuidadosamente as fatias em 0,9% de soro fisiológico.
      NOTA: Neste estudo, foi utilizada uma configuração de DSLR com uma lente / objetivo for o caso, um tripé e iluminação uniforme. No entanto, as fotografias só serviu como um controle para a avaliação da região da cicatriz,portanto, poderíamos ter usado uma configuração diferente.
3. imagens de fluorescência
   NOTA: Dependendo das excitação e emissão de comprimentos de onda das microesferas fluorescentes, seleccionar os blocos de filtro e de excitação lasers apropriados (por exemplo, as microesferas vermelhos usados aqui têm excitação e emissão de comprimentos de onda de 580 nm e 605 nm, respectivamente e, portanto, o laser de excitação seleccionado e filtros de banda de passagem foram ajustados para 532 nm, 580/30 nm e 610/30 nm, respectivamente).
   1. Selecionar imagens em modo de fluorescência no scanner de modo variável. Definir o tubo fotomultiplicador para 430 V ou equivalente e o tamanho do pixel de 100 x 100 mm. Selecione um laser de excitação (532 nm) mais próximo ao comprimento de onda de excitação das microesferas fluorescentes.
   2. Para o primeiro bloco de filtragem, selecionar um filtro passa-banda (nm 580/30) que se sobrepõe com o comprimento de onda de emissão de fluorescência das esferas injectados (canal 1). Seleccionar um filtro passa-banda para o segundo bloco de filtro (610/30) do lado de fora da ecomprimento de onda missão (canal 2).
      NOTA: O segundo bloco de filtro serve como um controlo negativo e para remover auto-fluorescência, mantendo os locais de injecção intacta.
   3. Digitalizar ambos os lados das fatias de agar no modo de fluorescência do scanner a laser de modo variável usando os dois canais. Certifique-se de que cada fatia é completamente digitalizado, incluindo os furos de referência.

5. Pós-processamento

NOTA: O primeiro passo para pós-processamento é a segmentação manual do miocárdio usando scripts in-house desenvolvidos para traçar a endo e fronteiras do epicárdio, bem como os locais de injecção. Este é o mesmo para ambos ressonância magnética e exames de fluorescência.

1. Segmento do miocárdio nos exames de ressonância magnética.
   1. Segmento do endocárdio e LV borders epicárdio nas imagens da sequência FLAIR ressonância magnética.
   2. Copiar a segmentação LV do passo 5.1.1 ao conjunto de dados LGE-MRI e segmento a cicatriz na sequência LGE MRI.
   3. Copie a segmentação do miocárdio do passo 5.1.1 do T2 * conjunto de dados ponderadas e segmento dos depoimentos SPIO no miocárdio LV.
2. Processar as imagens de fluorescência e realizar segmentações.
   1. Carregar os arquivos obtidos a partir do scanner de modo variável e fazer uma imagem separada de cada fatia coração transversal.
   2. Virar as fatias que foram digitalizados em base para o ápice orientação e classificar as imagens de fluorescência para uma pilha para ambos os canais que é orientada a partir do vértice para a base.
   3. Segmento do endocárdio e LV borders epicárdio nas imagens de fluorescência.
   4. Segmento da cicatriz manualmente nas imagens de fluorescência e utilizar a LGE-exame de ressonância magnética e as fotografias para confirmar a morfologia da cicatriz.
   5. Subtrair a pilha de imagens do canal 2 a partir da pilha de imagem de um canal de excluir auto-fluorescência. segmento manualmente os depoimentos e microbead fluorescentes usar o T2 * imagens para confirmação.
3. Para criaruma geometria 3D-anatomicamente correcto, executar um registo rígida das fatias na pilha de imagem com base nas estruturas de referência (os furos criados pelos tubos rígidos). Calcular e armazenar a tradução aplicada e rotação de cada imagem.
4. Aplicar as transformações armazenados para as pilhas de imagens e as segmentações. Linearmente interpolar os segmentações de ambos os lados das fatias para reconstruir a espessura da fatia original e para criar um modelo 3D dos dados.

6. Análise

1. Realizar medições 2D e / ou 3D da distância entre os centros dos locais de injecção e do IBZ para avaliar a precisão da injeção. Medir a distância ao longo da fronteira endocárdica da segmentação LV. Na Figura 2C e 2F, um exemplo das medições de 2D e 3D é indicado pela linha vermelha.

Resultados

Embedding Tissue

Através do processo de incorporação, uma geometria diastólica final semelhante foi estabelecido. O ágar aderido com sucesso ao tecido do coração, permitindo que o tecido a ser cortado no desejado angulação com espessuras iguais (Figura 2A e 2C).

Avaliação Scar- e no local da injecção

Discussão

Total de coração de processamento de tecido do miocárdio 3D de acordo com este protocolo proporciona um método estruturado que permite a análise 3D do enfarte, o IBZ, e as injecções realizadas com respeito à anatomia cardíaca. O volume de enchimento do coração depende da análise desejada. Neste estudo, para avaliar a precisão da injeção, que teve como objetivo preencher o coração para assemelhar-se a geometria diastólica final, tanto quanto possível. Para aplicar este, o apex LV é fixado ao fundo do ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	Braun
Agarose	Roche Diagnostics		Scientific grade multipurpose agar
Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410	GE Healthcare
Embedding container			Plastic, dimensions 17 x 14.5 x 14 cm
FluoSpheres Polystyrene Microspheres	Invitrogen	F8834	red, 10 µm
Gadolinium	Gadovist		1.0 mmol/mL
dS 32 channel head coil	Philips		Or similar
Matlab	Mathworks		To insure compatability 2015a or newer
Meat slicer	Berkel
Myostar injection catheter	Biosense Webster
Super paramagnetic iron oxide particles	Sinerem
Triphenyl-tetrazolium chloride	Merck
UPy-PEG10k
Vicryl 2-0	Ethicon