Construcción y evaluación de un modelo murino Osteolysis Calvarial por exposición a partículas de CoCrMo en aflojamiento aséptico

Resumen

Este manuscrito describe un modelo murino osteolysis calvarial por exposición a partículas de CoCrMo, que constituye un modelo animal ideal para la evaluación de las interacciones entre las partículas de desgaste y diversas células en aflojamiento aséptico.

Resumen

Osteólisis inducida por partículas de desgaste es una de las principales causas del aflojamiento aséptico en el fracaso de la artroplastia, pero el mecanismo subyacente es incierto. Debido al largo seguimiento necesarios para detección y ocurrencia esporádica, es difícil evaluar la osteólisis inducida por el ofparticle de patogenesia en casos clínicos. Por lo tanto, modelos animales óptimos se requieren estudios adicionales. El modelo murino de osteólisis calvarial establecido por la exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta eficaz y válida para evaluar las interacciones entre las partículas y diversas células en aflojamiento aséptico. En este modelo, las partículas de CoCrMo primero fueron obtenidas por alto vacío de tres electrodos corriente y resuspendió en solución salina con tampón fosfato a una concentración de 50 mg/mL. Entonces, 50 μl de la suspensión resultante se aplicó a la mitad de la calvaria murino después de la separación del periostio craneal por agudo disección. Después de dos semanas, los ratones fueron sacrificados y se cosecharon muestras de la calvaria; se realizaron evaluaciones cualitativas y cuantitativas por hematoxilina y eosina y micro tomografía computada. Los puntos fuertes de este modelo incluyen simplicidad de procedimiento, evaluación cuantitativa de la pérdida de masa ósea, rapidez de desarrollo de osteólisis, uso potencial transgénico o knockout modelos y un costo relativamente bajo. Sin embargo, este modelo no puede utilizarse para evaluar la fuerza mecánica y efectos crónicos de las partículas en aflojamiento aséptico. Modelo murino osteolysis calvarial generado por la exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta ideal para evaluar las interacciones entre las partículas de desgaste y varias células, por ejemplo, los macrófagos, fibroblastos, osteoblastos y osteoclastos, en aflojamiento aséptico.

Introducción

Aflojamiento aséptico es la causa más común de artroplastia total de cadera (THA) y fracaso de la artroplastia (TKA) total de la rodilla, que requiere de cirugía de revisión¹. Sin embargo, el mecanismo subyacente permanece claro². Una carta recordativa larga es necesaria para detectar la osteólisis inducida por partículas cuya ocurrencia es rara; por lo tanto, es un reto a explorar su patogenesia en casos clínicos. Por lo tanto, estudios más centrados en mecanismos celulares y tejidos complejos requieren que ambos experimentos en vivo en usan modelos de la osteólisis inducida por partículas y en vitro ensayos en células relacionadas con la homeostasis³del hueso. Un modelo animal válido es importante en revelar los efectos de las partículas de desgaste en la pérdida ósea, proporcionando la evidencia para otros ensayos celulares.

Un modelo murino osteolysis calvarial construido por exposición a partículas de CoCrMo es un método efectivo y válido para evaluar las interacciones entre las partículas y diversas células en aflojamiento aséptico. En este modelo, partículas de CoCrMo causan osteólisis calvarial induciendo citoquinas inflamatorias en macrófagos, activación de osteoclastos, inhibiendo la proliferación de osteoblastos, y promover la apoptosis de osteoblastos.

Sólo se tarda dos semanas para establecer este modelo. Osteólisis puede ser visualizada y cuantificada por hematoxilina y eosina (H & E) coloración y micro computarizada de tomografía (micro-CT)². Además, este modelo tiene un ratón de relativamente bajo costo y transgénico y knockout modelos pueden utilizarse para un gran número de compuestos en diversas dosis³.

El procedimiento para establecer y evaluar este modelo es simple. En primer lugar, las partículas de CoCrMo fueron obtenidas por alto vacío de tres electrodos corriente y resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 50 mg/mL. Entonces, 50 μl de la suspensión resultante se aplicó a la mitad de la calvaria murino después de la separación del periostio craneal por agudo disección. Los ratones fueron sacrificados después de dos semanas, y se cosecharon muestras de la calvaria; se realizaron análisis cualitativos y cuantitativos por H & E tinción andmicro-CT.

Un modelo murino osteolysis calvarial construido por exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta ideal para evaluar las interacciones entre las partículas de CoCrMo y varias células, como macrófagos, fibroblastos, osteoblastos y osteoclastos, en aflojamiento aséptico.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Nanjing.

1. preparación de la partícula CoCrMo

1. Obtener partículas de CoCrMo mediante alto vacío fabricadas tres electrodos corriente⁴. Aleación de CoCrMo lugar en el instrumento bajo 10^-3 Pa vacío, 0,04 MPa argón y 3:2 (v/v) de hidrógeno y 650 A cátodo actuales.
2. Medir los diámetros de las partículas de CoCrMo.
   1. Añadir 1 mg de CoCrMo partículas en 1,5 mL de etanol anhidro.
   2. Resuspender las partículas CoCrMo en etanol anhidro por agitación ultrasónica a 28 kHz y 600 W durante 5 minutos.
   3. Aplicar una gota (aproximadamente 20 μl) de la suspensión resultante de la tabla objetivo de microscopio electrónico de transmisión (TEM). Serie de fotos TEM en el voltaje de aceleración de 200 kV y 0,24 nm resolución de captura.
   4. Utilice el software suministrado para calcular la distribución tamaño medio diámetro y partícula en micrografías TEM.
3. Descontaminación de endotoxinas
   1. Autoclave de 50 g de partículas durante 15 min a 121 ° C y 15 psi.
   2. Detectar endotoxinas por un análisis cuantitativo de amebocitos de Limulus Lysate (LAL) (< 0,25% consideró indican ausencia de endotoxina UE/mL)⁵.
4. Resuspender las partículas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 50 mg/mL solución stock⁶.

2. construcción del modelo Calvarial Osteolysis

1. Anestesiar el 6 semana de edad C57BL/J6 (seis ratones por grupo) withpentobarbital (50 mg/kg). Utilice la prueba del pellizco para evaluar el nivel de anestesia. Prevenir la resequedad de los ojos con solución salina normal.
2. Lugar de ratones en la posición propensa. Quitar la piel sobre el cráneo con una afeitadora y desinfectar la piel utilizando las bolas de algodón médico que contiene el etanol del 75%.
3. Para el punto de localización, identificar dos puntos, incluyendo los puntos medios entre los dos ojos y las orejas, respectivamente. Luego, determinar la línea entre los dos más puntos y haga una incisión en la piel a lo largo de la línea de arriba con unas tijeras (figura 1A).
4. Retire el periostio craneal del calvaria con un bisturí (figura 1B)⁶.
5. Piel en ambos extremos de la sutura con sutura interrumpida simple.
6. Hacer una línea de sutura a través del centro de la incisión sin anudar. Sujete los dos extremos de la línea de sutura.
7. Incorporar 50 μl de suspensión de partículas de CoCrMo (50 mg/mL en PBS) en medio de la calvarias (figura 1)².
8. Nudo la última puntada de la sutura interrumpida simple (figura 1).
9. Mantener los ratones durante otras 2 semanas.

3. evaluación del modelo de osteólisis Calvarial por la exploración Micro-CT

1. Sacrificar a los ratones con dióxido de carbono. Decapita a los ratones en el plano horizontal. Retire el tejido cerebral dentro y la piel y la piel exterior. La cosecha la calvarias para experimentos adicionales.
2. Aclarar suavemente todo el tejido suave en el calvaria con pinzas. Fijar el calvarias despejado en paraformaldehído al 4% a 4 ° C por 24 h. sumergir calvarias en PBS 24 h antes de la exploración micro-CT.
3. Analizar la calvarias ratones mediante micro-CT en alta resolución en una resolución isométrica de 18 μm y la configuración de energía de rayos x de 45 kV y 550 mA.
4. Llevar a cabo la reconstrucción tridimensional de los datos con el software micro-CT.
5. Análisis cuantitativo y cualitativo.
   1. En primer lugar, seleccione la región cuadrada alrededor de la sutura de la línea media como la región de interés.
   2. En segundo lugar, medir la densidad mineral ósea (DMO), osea el volumen total volumen (BV/TV), número trabecular (Tb.N), espesor trabecular (Tb.Th), separación/separación trabecular (Tb.Sp) y porcentaje de porosidad total con el software suministrado para micro-CT.
   3. En tercer lugar, comparar los tres grupos para las distintas medidas por ANOVA unidireccional. Para el análisis post-hoc de la varianza, aplicar el método de Bonferroni².

4. evaluación del modelo de osteólisis Calvarial por tinción H & E

1. Descalcificar muestras de calvaria en 15% ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)-PBS a 4 ° C. Cambiar la solución de descalcificación cada día durante 3 semanas.
2. Incrustar las muestras descalcificadas en parafina para un 2 x 1 cm x 1 cubo de cm y cortar en secciones de 2 μm en la zona de deposición de partículas.
3. Mancha las secciones con hematoxilina y eosina como describió anteriormente⁷.
4. Capturar imágenes de la pathomorphism general por microscopia ligera.

Resultados

Las partículas de nanoescala producido interno CoCrMo fueron alrededor de 50 nm (error estándar de 3.56) de diámetro, como cuantificado por TEM (figura 2). Después de la exposición de ratón calvarias a partículas de CoCrMo, los animales (n = 6 por grupo) se mantuvieron durante dos semanas. Dentro de dos semanas, la incisión calvarial fue curada completamente, y la sutura puede caer. Cualquier infección local o no sindical puede afectar la evaluación...

Discusión

Existen dos métodos principales para la osteólisis inducida por partículas de desgaste en ratones: el modelo de bolsa de aire y el modelo de osteólisis calvarial. En el modelo de bolsa de aire, una bolsa de aire subcutáneo generada se establece primero, seguido por la introducción de partículas de desgaste y la implantación en el tejido óseo del⁸. La pared de bolsa imita el periostio en aflojamiento aséptico. Sin embargo, la implantación de hueso es no vascular sin actividad biológica,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CoCrMo alloy from prosthesis	Waldemar Link GmbH & Co	GEMINI MK II	Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current	College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology		Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice	Model animal research center of Nanjing University	N000013
100% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691514023	Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W603
Microanalytical balance	Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD	EX125DZH
Ultrasonic shaker	Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD	YH-200DH	To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G20
SimplePCI software	Compix Inc.	6.6 version	To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan	QIULONGYIQI	KYQL-100DS	To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay	Charles River	R13025	To detect endotoxin
15 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Suyi Medical	B122
Phosphate-buffered saline	Boster Biological Technology	AR0030	Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium	Sigma	P3761	To anesthetize mice
Normal saline	SACKLER	SR8572EP-15	To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691560275	Disinfection
Medical cotton ball	Shuitao	1278298933	Disinfection
Shaver	Kemei	KM-3018	To shave the fur
Scissor	RWD LIFE SCIENCE	S12005-10	To incise skin
Suture	RWD LIFE SCIENCE	F34001-01	To suture skin
Needle holder	RWD LIFE SCIENCE	F33001-01	To suture skin
Needle	RWD LIFE SCIENCE	R14003-12	To suture skin
Vessel forceps	RWD LIFE SCIENCE	F22003-09	To suture skin
Scalpel	RWD LIFE SCIENCE	S31010-01	To harvest calvaria
Tweezers	RWD LIFE SCIENCE	F12006-10	To harvest calvaria
100 µL pipettes	Eppendorf	3120000240	To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips	AXYGEN	T-200-Y	To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W621
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Fixation
Micro Computed Tomography	SkyScan	SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid	Servicebio	G1105	Decalcification
Paraffin	Servicebio	#0001
Paraffin slicing machine	Leica	RM2125RTS
Glass slide	Servicebio	G6004
Cover glass	Servicebio	200
HE staining kit	Servicebio	#1-5	HE staining
Light microscope	Nikon	E200