בנייה והערכה של מודל מאתר Osteolysis Calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo ב התרופפות אספטי

Summary

כתב יד זה מתאר מודל מאתר osteolysis calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo, המהווה מודל חיה אידיאלית להערכת הגומלין שבין חלקיקי ללבישה, תאים שונים התרופפות אספטי.

Abstract

ללבוש חלקיקים-induced osteolysis הוא הגורם העיקרי התרופפות aseptic בכישלון שכיחיםהחלפת, אבל המנגנון הבסיסי נותר לא ברור. בשל זמן מעקב לצורך זיהוי, מופע ספורדי, זה מאתגר כדי להעריך את osteolysis של ofparticle-induced פתוגנזה במקרים קליניים. ומכאן, מודלים בעלי חיים אופטימלי יש צורך בלימודים. המודל מאתר של osteolysis calvarial נוסדה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo הוא כלי יעיל וחוקית להערכת את האינטראקציות בין חלקיקי תאים שונים התרופפות אספטי. במודל זה, חלקיקי CoCrMo קודם מתקבל על ידי זרם גבוה-ואקום 3-אלקטרודה, resuspended בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח-ריכוז של 50 מ"ג/מ"ל. לאחר מכן, µL 50 של ההשעיה וכתוצאה מכך הוחל לאמצע calvaria מאתר לאחר ההפרדה של קרום העצם הגולגולת על ידי חד לנתיחה. אחרי שבועיים, העכברים הוקרבו, דגימות calvaria נבצרו; הערכות כמותיים בוצעו על ידי hematoxylin אאוזין מכתים ו טומוגרפיה מיקרו. נקודות החוזק של מודל זה כוללים פשטות ההליך, הערכה כמותית של איבוד מסת העצם, רגע, osteolysis, להשתמש הפוטנציאל הטרנסגניים או נוקאאוט מודלים ופיתוח בעלות נמוכה יחסית. עם זאת, מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את כוח מכני ואת ההשפעות כרונית של חלקיקי התרופפות אספטי. המודל מאתר osteolysis calvarial שנוצר על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo הוא כלי אידיאלי עבור הערכת את האינטראקציות בין ללבוש חלקיקים שונים תאים, למשל, מקרופאגים, fibroblasts, תאי העצם ובין osteoclasts, ב התרופפות אספטי.

Introduction

התרופפות aseptic הוא הגורם הנפוץ ביותר של שכיחיםהחלפת היפ הכולל (THA) וכישלון שכיחיםהחלפת (TKA) ברך הכולל, אשר דורש ניתוח תיקון¹. עם זאת, המנגנון הבסיסי נותר לא ברור². מעקב ארוך נדרש לזהות חלקיקים-induced osteolysis, אשר מופע נדיר; לכן, זה מאתגר לחקור שלה פתוגנזה במקרים קליניים. לפיכך, מחקרים נוספים התמקדות מנגנונים מורכבים הסלולר ורקמות דורשים שני ניסויים ויוו ב ללבוש מודלים של חלקיקים-induced osteolysis, מבחני במבחנה בתאים הקשורים עצם הומאוסטזיס³. מודל בעלי חיים חוקי חשוב לחשוף את ההשפעות של חלקיקים ללבוש על איבוד העצם, מתן הוכחות נוספות הסלולר מבחני.

מודל osteolysis calvarial מאתר שנבנה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo היא שיטה יעילה וחוקית להערכת את האינטראקציות בין חלקיקי תאים שונים התרופפות אספטי. במודל זה, חלקיקי CoCrMo לגרום calvarial osteolysis על ידי גרימת ציטוקינים דלקתיים ב מקרופאגים, הפעלת osteoclasts, מעכבות התפשטות אוסטאובלסט קידום אוסטאובלסט אפופטוזיס.

זה לוקח רק שבועיים להקים מודל זה. Osteolysis יכול להיות דמיינו לכמת על ידי hematoxylin אאוזין (H & E) מכתים, מיקרו שחושב טומוגרפיה (מיקרו-CT)². בנוסף, מודל זה יש עכבר יחסית בעלות נמוכה, הטרנסגניים ואת נוקאאוט מודלים יכול לשמש למסך מספר רב של תרכובות מינונים שונים³.

הנוהל כדי לבסס והערכה של מודל זה הוא פשוט. ראשית, חלקיקי CoCrMo מתקבל על ידי זרם גבוה-ואקום 3-אלקטרודה, resuspended בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)-ריכוז של 50 מ"ג/מ"ל. לאחר מכן, µL 50 של ההשעיה וכתוצאה מכך הוחל לאמצע calvaria מאתר לאחר ההפרדה של קרום העצם הגולגולת על ידי חד לנתיחה. העכברים הוקרבו אחרי שבועיים ולאחר calvaria דגימות נבצרו; ניתוחים כמותיים בוצעו על ידי H & E מכתים andmicro-טי

מודל osteolysis calvarial מאתר שנבנה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo היא כלי אידיאלי עבור הערכת את האינטראקציות בין חלקיקים CoCrMo תאים שונים, כגון מקרופאגים, fibroblasts, תאי העצם osteoclasts, ב התרופפות אספטי.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת נאנג'ינג.

1. CoCrMo חלקיקים הכנה

1. לקבל CoCrMo חלקיקים באמצעות זרם ישיר של שלוש-אלקטרודה גבוהה-ואקום מפוברק⁴. המקום CoCrMo סגסוגת בכלי תחת 10^-3 הרשות הפלסטינית ואקום, 0.04 ארגון MPa ו מימן 3:2 (v/v), 650 קטודית A הנוכחי.
2. למדוד על הקוטר של חלקיקים CoCrMo.
   1. להוסיף 1 מ ג של CoCrMo חלקיקים לתוך 1.5 מ"ל אתנול נטול מים.
   2. Resuspend CoCrMo חלקיקים באתנול נטול מים ע י ניעור אולטראסוניות-28 kHz ו- 600 W עבור 5 דקות.
   3. החל טיפה אחת (כ- 20 µL) של ההשעיה המתקבלת על השולחן אובייקטיבית של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). לכידת סדרת תמונות TEM ב 200 מתח ההאצה kV והרזולוציה nm 0.24.
   4. להשתמש בתוכנה המצורפת כדי לחשב את מתכוון קוטר חלקיקים בגודל והפצה ב TEM micrographs.
3. Decontaminate endotoxins
   1. אוטוקלב 50 גרם של חלקיקים למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 15 psi.
   2. לאתר endotoxins על ידי Assay כמותית Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (< 0.25% האיחוד האירופי/mL נחשבת לציון אנדוטוקסין היעדרות)⁵.
4. Resuspend החלקיקים בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)-ריכוז של 50 מ"ג/מ"ל בתור פתרון מניות⁶.

2. בניית דגם Calvarial Osteolysis

1. עזים ומתנגד C57BL/J6 6 בן שבועיים עכברים (שישה עכברים לכל קבוצה) withpentobarbital (50 מ"ג/ק"ג). השתמש במבחן קמצוץ כדי להעריך את רמת ההרדמה. למנוע ייבוש של העיניים עם תמיסת מלח.
2. הצב עכברים במצב שכיבה. הסר את הפרווה על הגולגולת עם מכונת הגילוח, לחטא את העור באמצעות כדורי צמר גפן רפואי המכיל 75% אתנול.
3. עבור נקודת לוקליזציה, לזהות שתי נקודות, כולל את האמצע בין שתי העיניים והאוזניים, בהתאמה. לאחר מכן, לקבוע את הגבול בין השניים מעל נקודות, פצעים וחתכים בעור לאורך הקו לעיל עם מספריים (איור 1 א').
4. הסר קרום העצם הגולגולת calvaria עם האזמל (איור 1B)⁶.
5. תפר עור בשני קצותיו בתפר פשוט קטע.
6. הפיכת קו תפר דרך האמצע של החתך ללא knotting. החזק את שני הקצוות של קו התפר.
7. הטבע µL 50 CoCrMo חלקיקים השעיה (50 mg/mL, ב- PBS) באמצע מכונות (איור 1C)².
8. מקמי תפר האחרון בתוך בתפר פשוט קטע (איור 1D).
9. לשמור על עכברים עוד 2 שבועות.

3. הערכה של מודל Calvarial Osteolysis על-ידי סריקה מיקרו-CT

1. להקריב העכברים עם פחמן דו-חמצני. לערוף העכברים במישור האופקי. להסיר את רקמת המוח בתוך העור, פרווה בחוץ. לקצור את מכונות לניסויים נוספים.
2. לנקות בעדינות את כל הרקמות הרכות על calvaria עם פינצטה. לתקן מכונות שנוקה ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C עבור ה 24 Immerse את מכונות ב- PBS 24 h לפני סריקת CT-מיקרו.
3. לנתח את מכונות עכברים ידי מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה של פתרון איזומטרי של מיקרומטר 18 ו רנטגן הגדרות האנרגיה של 45 kV, 550 mA.
4. לבצע שחזור תלת מימדי של מיקרו-CT נתונים עם התוכנה.
5. איכותי וניתוח כמותי.
   1. ראשית, בחר את אזור ריבוע מסביב התפר קו האמצע אזור בעל עניין.
   2. שנית, למדוד צפיפות המינרלים של העצם (BMD), עצם נפח/סה כ נפח (BV/טלוויזיה), trabecular (Tb.N), עובי trabecular (Tb.Th), ההפרדה/ריווח trabecular (Tb.Sp) ומספר אחוז נקבוביות סה עם התוכנה שסופקה לסי-מיקרו
   3. שלישית, השווה לשלוש הקבוצות למדידות שונים מאת אנובה בכיוון אחד. עבור הוק לאחר ניתוח השונות, להחיל את שיטת Bonferroni².

4. הערכה של מודל Calvarial Osteolysis על ידי צביעת המטוקסילין

1. Decalcify calvaria דגימות ב- 15% אתילן diamine ב tetraacetic חומצה (EDTA)-PBS ב 4 º C. לשנות את הפתרון decalcification כל יום במשך 3 שבועות.
2. להטביע את הדגימות decalcified פרפין עבור 2 ס"מ על 1 ס"מ x 1 ס מ קוביה, לחתוך אותם למקטעים 2 מיקרומטר באזור של חלקיקים התצהיר.
3. כתם הסעיפים עם hematoxylin ותיאר אאוזין כאמור⁷.
4. Micrographs של pathomorphism הכוללת מידיהם של מיקרוסקופ אור.

תוצאות

חלקיקי ננו המיוצר ללא צורך במיקור חוץ CoCrMo היו בסביבות 50 ננומטר (שגיאת תקן של 3.56) בקוטר, כפי לכמת על ידי TEM (איור 2). לאחר חשיפה של העכבר מכונות CoCrMo חלקיקים, החיות (n = 6 לכל קבוצה) היו נשמרות רק בעוד שבועיים. בתוך השבועיים, החתך calvarial נרפא לחלוטין, התפר עלול ליפול. ?...

Discussion

ישנן שתי שיטות עיקריות עבור ללבוש חלקיקים-induced osteolysis בעכברים: המודל אוויר-נרתיק ודגם calvarial osteolysis. במודל כיס אוויר, אוויר-נרתיק subcutaneously שנוצר קודם נוסדה, ואחריו ללבוש חלקיקים מבוא השרשה לתוך רקמת העצם⁸. הקיר נרתיק מחקה קרום העצם, התרופפות אספטי. עם זאת, עצם ההשתלה הוא nonvascular עם אי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CoCrMo alloy from prosthesis	Waldemar Link GmbH & Co	GEMINI MK II	Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current	College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology		Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice	Model animal research center of Nanjing University	N000013
100% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691514023	Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W603
Microanalytical balance	Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD	EX125DZH
Ultrasonic shaker	Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD	YH-200DH	To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G20
SimplePCI software	Compix Inc.	6.6 version	To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan	QIULONGYIQI	KYQL-100DS	To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay	Charles River	R13025	To detect endotoxin
15 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Suyi Medical	B122
Phosphate-buffered saline	Boster Biological Technology	AR0030	Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium	Sigma	P3761	To anesthetize mice
Normal saline	SACKLER	SR8572EP-15	To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691560275	Disinfection
Medical cotton ball	Shuitao	1278298933	Disinfection
Shaver	Kemei	KM-3018	To shave the fur
Scissor	RWD LIFE SCIENCE	S12005-10	To incise skin
Suture	RWD LIFE SCIENCE	F34001-01	To suture skin
Needle holder	RWD LIFE SCIENCE	F33001-01	To suture skin
Needle	RWD LIFE SCIENCE	R14003-12	To suture skin
Vessel forceps	RWD LIFE SCIENCE	F22003-09	To suture skin
Scalpel	RWD LIFE SCIENCE	S31010-01	To harvest calvaria
Tweezers	RWD LIFE SCIENCE	F12006-10	To harvest calvaria
100 µL pipettes	Eppendorf	3120000240	To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips	AXYGEN	T-200-Y	To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W621
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Fixation
Micro Computed Tomography	SkyScan	SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid	Servicebio	G1105	Decalcification
Paraffin	Servicebio	#0001
Paraffin slicing machine	Leica	RM2125RTS
Glass slide	Servicebio	G6004
Cover glass	Servicebio	200
HE staining kit	Servicebio	#1-5	HE staining
Light microscope	Nikon	E200