Konstruktion und Evaluation eines murinen Calvarial Osteolyse-Modells durch die Einwirkung von CoCrMo Partikel in aseptischen Lockerung

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt einen murinen calvarial Osteolyse Modell durch die Einwirkung von CoCrMo Partikel, die ideale Tiermodell für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Abriebpartikeln und verschiedenen Zellen in aseptischen Lockerung darstellt.

Zusammenfassung

Abnutzung Partikel-induzierte Osteolyse ist eine der Hauptursachen für aseptische Lockerung Endoprothetik scheitern, aber der zugrunde liegende Mechanismus ist unklar. Durch lange Follow-ups nötig für die Erkennung und sporadisch auftreten ist es schwierig um zu beurteilen, die Pathogenese Ofparticle-induzierte Osteolyse in klinischen Fällen. Daher sind optimale Tiermodelle für weitere Studien erforderlich. Das Mausmodell calvarial Osteolyse gegründet durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist ein wirksam und gültig Werkzeug für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Partikeln und verschiedenen Zellen in aseptische Lockerung. In diesem Modell wurden CoCrMo Partikel zuerst von Hochvakuum-drei-Elektrode Gleichstrom und Nukleinsäuretablette in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung in einer Konzentration von 50 mg/mL. Anschließend wurde die entstandene Suspension 50 µL bis zur Mitte des murinen Calvaria angewendet, nach Trennung von der Craniale Periost durch scharfe Dissektion. Nach zwei Wochen die Mäuse wurden geopfert und Calvaria Exemplare wurden geerntet; qualitative und quantitative Auswertungen wurden von Hämatoxylin und Eosin Färbung und Mikro-Computertomographie durchgeführt. Die Stärken dieses Modells gehören Verfahren Einfachheit, quantitative Bewertung des Knochenverlustes, Schnelligkeit der Osteolyse Entwicklung, mögliche Verwendung transgenen oder Ko-Modelle und einen relativ niedrigen Kosten. Jedoch kann dieses Modell verwendet werden, um die mechanische Kraft und chronische Effekte von Partikeln in aseptischen Lockerung zu beurteilen. Murine calvarial Osteolyse Modell generiert durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist ein ideales Werkzeug für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Abriebpartikeln und verschiedenen Zellen, z. B.Makrophagen, Fibroblasten, Osteoblasten und Osteoklasten in aseptische Lockerung.

Einleitung

Aseptische Lockerung ist die häufigste Ursache von total hip Arthroplasty (THA) und Knie-Endoprothetik (TKA) Ausfall, erfordert die Überarbeitung Chirurgie¹. Der zugrunde liegende Mechanismus bleibt jedoch unklar². Eine lange Follow-up ist erforderlich, um die Partikel-induzierte Osteolyse, erkennen deren selten vorkommt; Daher ist es schwierig, um seine Pathogenese in klinischen Fällen zu erkunden. Daher benötigen weitere Studien mit Schwerpunkt auf komplexen Mechanismen der zellulären und Gewebe, dass beide in Vivo -Experimente in der Partikel-induzierte Osteolyse Modelle und in-vitro- Assays in Zellen, die im Zusammenhang mit Homöostase³Knochen tragen. Eine gültige Tiermodell ist wichtig enthüllt hat, die Auswirkungen von Abriebpartikeln auf Knochenschwund, Nachweis für weitere zelluläre Assays.

Ein murinen calvarial Osteolyse Modell konstruiert durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist eine effektive und gültige Methode zur Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Partikeln und verschiedenen Zellen in aseptische Lockerung. In diesem Modell verursachen CoCrMo Partikel calvarial Osteolyse von inflammatorischen Zytokinen in Makrophagen induzieren, Aktivierung von Osteoklasten, Hemmung der Osteoblasten Verbreitung und Förderung der Osteoblasten Apoptose.

Es dauert nur zwei Wochen, dieses Modell zu etablieren. Osteolyse visualisiert und durch Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung quantifiziert werden kann und Mikro Tomographie (Mikro-CT)²berechnet. Darüber hinaus hat dieses Modell eine relativ niedrigen Kosten und transgenen und Knockout Maus Modelle können verwendet werden, um eine große Anzahl von Verbindungen in verschiedene Dosen³Bildschirm.

Das Verfahren zu etablieren und Werten dieses Modell ist einfach. Zunächst wurden CoCrMo Partikel durch Hochvakuum-drei-Elektrode Gleichstrom gewonnen und Nukleinsäuretablette in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 50 mg/mL. Anschließend wurde die entstandene Suspension 50 µL bis zur Mitte des murinen Calvaria angewendet, nach Trennung von der Craniale Periost durch scharfe Dissektion. Die Mäuse wurden geopfert, nach zwei Wochen, und Calvaria Proben wurden geerntet; qualitative und quantitative Analysen wurden von H & E Färbung Andmicro-CT durchgeführt.

Ein murinen calvarial Osteolyse Modell konstruiert durch die Einwirkung von CoCrMo Teilchen ist ein ideales Werkzeug für die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen CoCrMo Partikel und verschiedene Zellen wie Makrophagen, Fibroblasten, Osteoblasten und Osteoklasten in aseptische Lockerung.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Universität Nanjing genehmigt.

1. CoCrMo Partikel Vorbereitung

1. Erhalten Sie CoCrMo Partikel mithilfe einer vorgefertigten Hochvakuum-drei-Elektrode Gleichstrom⁴. CoCrMo-Legierung in das Instrument unter 10^-3 Pa Vakuum, 0,04 MPa Argon und Wasserstoff 3:2 (V/V) und 650 A Katode aktuelle zu platzieren.
2. Messen Sie den Durchmesser der CoCrMo Partikel.
   1. Fügen Sie 1 mg CoCrMo Partikel in 1,5 mL wasserfreiem Ethanol.
   2. Aufschwemmen Sie CoCrMo Partikel in wasserfreiem Ethanol durch Ultraschall bei 28 kHz und 600 W für 5 min schütteln.
   3. Die entstandene Suspension auf den objektiven Tisch ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) einen Tropfen (ca. 20 µL) gelten. TEM Fotoserie bei 200 kV Beschleunigungsspannung und 0,24 nm Auflösung zu erfassen.
   4. Verwenden Sie die mitgelieferte Software, um die mittlere Durchmesser und Partikel Größenverteilung in TEM Mikrographen berechnen.
3. Dekontaminieren Endotoxine
   1. Autoklaven 50 g der Partikel für 15 min bei 121 ° C und 15 Psi.
   2. Endotoxine durch einen quantitativen Assay Limulus Amebocyte Lysate (LAL) zu erkennen (< 0,25 % EU/mL wurde als Endotoxin Abwesenheit anzugeben)⁵.
4. Die Partikel in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 50 mg/mL Stammlösung⁶aufzuwirbeln.

2. Konstruktion des Modells Calvarial Osteolyse

1. 6 Wochen alten C57BL/J6 Mäuse (sechs Mäuse pro Gruppe) Withpentobarbital (50 mg/kg) zu betäuben. Verwenden Sie den Kneiftest um das Niveau der Anästhesie zu beurteilen. Verhindert Austrocknen der Augen mit normalen Kochsalzlösung.
2. Mäuse in Bauchlage zu platzieren. Entfernen Sie das Fell auf den Schädel mit einem Rasierer zu und desinfizieren Sie die Haut mit medizinischen Wattebällchen, die 75 % Ethanol enthält.
3. Identifizieren Sie für Punkt Lokalisierung zwei Punkte, einschließlich der Halbsummen zwischen den beiden Augen und Ohren, beziehungsweise. Dann bestimmen Sie die Linie zwischen den beiden oben genannten Punkte, und einzuschneiden Sie die Haut entlang der oben genannten Linie mit einer Schere (Abbildung 1A).
4. Entfernen Sie die Craniale Periost aus der Calvaria mit einem Skalpell (Abbildung 1 b)⁶.
5. Naht Haut an beiden Enden mit einfachen unterbrochenen Naht.
6. Machen Sie eine Naht Linie durch die Mitte des Schnittes ohne verknoten. Halten Sie die beiden Enden der Linie Naht.
7. Einbetten von 50 µL CoCrMo Partikel Suspension (50 mg/mL, mit PBS-Puffer) in der Mitte der Calvarias (Abbildung 1)².
8. Verknoten Sie die letzte Masche in einfachen unterbrochenen Naht (Abbildung 1).
9. Pflegen Sie Mäuse für weitere 2 Wochen.

3. Bewertung des Calvarial Osteolyse-Modells von Mikro-CT-Scan

1. Die Mäuse mit Kohlendioxid zu opfern. Die Mäuse in der Horizontalebene zu enthaupten. Entfernen Sie das Hirngewebe im Inneren und die Haut und Fell außerhalb. Ernten Sie die Calvarias für weitere Experimente.
2. Das weiche Gewebe auf die Calvaria klären Sie vorsichtig mit einer Pinzette. Fix die geräumte Calvarias in 4 % Paraformaldehyd bei 4 ° C für 24 h Tauchen Calvarias in PBS 24 h vor dem Mikro-CT-Scan.
3. Analysieren der Mäuse Calvarias durch hochauflösende Mikro-CT bei einer isometrischen Auflösung von 18 µm und Röntgen-Energieeinstellungen 45 kV und 550 mA.
4. Durchzuführen Sie dreidimensionale Rekonstruktion von Mikro-CT-Daten mit der Software.
5. Qualitative und Quantitative Analyse.
   1. Wählen Sie zunächst den quadratischen Bereich rund um die Mittellinie Naht als die Region von Interesse.
   2. Zweitens, Messung der Knochendichte (BMD), Knochen Volumen/Gesamt Volumen (BV/TV), trabekuläre Anzahl (Tb.N), trabekuläre Dicke (Tb.Th), trabekuläre Trennung/Abstand (Tb.Sp) und Prozentsatz der gesamten Porosität mit der mitgelieferten Software für Mikro-CT.
   3. Drittens vergleichen Sie die drei Gruppen für verschiedene Messungen durch einfache ANOVA. Post-hoc-Analyse der Varianz beantragen Sie die Bonferroni-Methode².

4. Bewertung des Calvarial Osteolyse-Modells von H & E Färbung

1. Entkalken Calvaria Proben in 15 % Ethylen Diamin Tetraacetic Säure (EDTA)-PBS bei 4 ° C. Wechseln Sie die Entkalkung Lösung 3 Wochen lang jeden Tag.
2. Betten Sie die Entkalkung Proben in Paraffin für eine 2 x 1 cm x 1 cm-Würfel, und schneiden Sie sie in 2 µm Abschnitte im Bereich der Partikelabscheidung.
3. Fleck in den Abschnitten mit Hämatoxylin und Eosin wie oben beschrieben⁷.
4. Aufnahmen des gesamten Pathomorphism durch Lichtmikroskopie zu erfassen.

Ergebnisse

Die hauseigene erzeugten nanoskaligen CoCrMo Partikel wurden rund 50 nm (Standardfehler von 3,56) im Durchmesser, wie durch TEM (Abbildung 2) quantifiziert. Nach Exposition der Maus Calvarias CoCrMo Teilchen, die Tiere (n = 6 pro Gruppe) wurden für weitere zwei Wochen beibehalten. Innerhalb der zwei Wochen der calvarial Schnitt war vollständig geheilt, und die Naht kann fallen. Keine lokale Infektion oder Pseudarthrose Mai Knochen Verlust Bewertung beeinflu...

Diskussion

Es gibt zwei Hauptmethoden für Abnutzung Partikel-induzierte Osteolyse bei Mäusen: die Luft-Beutel und das Modell calvarial Osteolyse. In der Luft-Beutel-Modell wird zuerst ein subkutan erzeugte Luft-Beutel hergestellt, gefolgt von Abnutzung Partikel Einführung und Implantation in die Knochen Gewebe⁸. Die Beutel Wand imitiert das Periost in aseptische Lockerung. Implantation von Knochen ist jedoch nonvascular ohne biologische Aktivität, wodurch es schwierig zu beurteilen, direkte Wechselwirkun...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CoCrMo alloy from prosthesis	Waldemar Link GmbH & Co	GEMINI MK II	Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current	College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology		Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice	Model animal research center of Nanjing University	N000013
100% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691514023	Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W603
Microanalytical balance	Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD	EX125DZH
Ultrasonic shaker	Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD	YH-200DH	To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G20
SimplePCI software	Compix Inc.	6.6 version	To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan	QIULONGYIQI	KYQL-100DS	To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay	Charles River	R13025	To detect endotoxin
15 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Suyi Medical	B122
Phosphate-buffered saline	Boster Biological Technology	AR0030	Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium	Sigma	P3761	To anesthetize mice
Normal saline	SACKLER	SR8572EP-15	To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691560275	Disinfection
Medical cotton ball	Shuitao	1278298933	Disinfection
Shaver	Kemei	KM-3018	To shave the fur
Scissor	RWD LIFE SCIENCE	S12005-10	To incise skin
Suture	RWD LIFE SCIENCE	F34001-01	To suture skin
Needle holder	RWD LIFE SCIENCE	F33001-01	To suture skin
Needle	RWD LIFE SCIENCE	R14003-12	To suture skin
Vessel forceps	RWD LIFE SCIENCE	F22003-09	To suture skin
Scalpel	RWD LIFE SCIENCE	S31010-01	To harvest calvaria
Tweezers	RWD LIFE SCIENCE	F12006-10	To harvest calvaria
100 µL pipettes	Eppendorf	3120000240	To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips	AXYGEN	T-200-Y	To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W621
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Fixation
Micro Computed Tomography	SkyScan	SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid	Servicebio	G1105	Decalcification
Paraffin	Servicebio	#0001
Paraffin slicing machine	Leica	RM2125RTS
Glass slide	Servicebio	G6004
Cover glass	Servicebio	200
HE staining kit	Servicebio	#1-5	HE staining
Light microscope	Nikon	E200