İnşaat ve bir fare grefti Osteoliz modeli aseptik gevşeme içinde CoCrMo parçacıklar maruz tarafından değerlendirilmesi

Özet

Bu el yazması CoCrMo parçacıklar, aşınma partikülleri ve aseptik gevşeme çeşitli hücreler arasındaki etkileşimler değerlendirmek için ideal bir hayvan modeli oluşturan maruz bir fare grefti Osteoliz modeli açıklar.

Özet

Aşınma parçacık kaynaklı Osteoliz aseptik gevşeme artroplasti başarısızlık büyük bir nedeni ama altta yatan mekanizma belirsizdir. Algılama ve sporadik oluşumu için gerekli takibi nedeniyle uzun, Patogenez ofparticle kaynaklı Osteoliz klinik durumlarda değerlendirmek için davet ediyor. Bu nedenle, en iyi hayvan modelleri daha fazla çalışmalar için gereklidir. Grefti Osteoliz CoCrMo parçacıklar maruz tarafından kurulan fare modeli parçacıklar ve aseptik gevşeme çeşitli hücreler arasındaki etkileşimler değerlendirmek için etkili ve geçerli bir araçtır. Bu modelde, CoCrMo parçacıklar ilk yüksek vakum üç elektrot doğru akım tarafından elde ve fosfat tamponlu tuz konsantrasyonu 50 mg/mL, resuspended. Sonra sonra kafatası kapaklarini tarafından ayrılması keskin diseksiyon elde edilen süspansiyon 50 µL fare calvaria ortasına kadar uygulandı. İki hafta sonra fareler kurban edildi ve calvaria numuneler hasat edildi; nitel ve nicel Değerlendirmeler Hematoksilen ve Eozin boyama ve mikro bilgisayarlı tomografi tarafından yapıldı. Bu modelin güçlü yordamı basitlik, kemik kaybı kantitatif değerlendirilmesi, hız Osteoliz geliştirme, potansiyel kullanım transgenik veya nakavt modelleri ve nispeten düşük maliyetli içerir. Ancak, bu model mekanik kuvvet ve aseptik gevşeme içinde parçacıklar kronik etkilerini değerlendirmek için kullanılacak uygulanamıyor. CoCrMo parçacıklar maruz tarafından oluşturulan fare grefti Osteoliz modeli aşınma partikülleri ve çeşitli hücreler, örneğin, makrofajlar, fibroblastlar, dokusunu ve aseptik gevşeme içinde Osteoklastlar, arasındaki etkileşimler değerlendirmek için ideal bir araçtır.

Giriş

Aseptik gevşeme en yaygın nedeni olan toplam kalça protezi (THA) ve total Diz protezi (TKA) hata, hangi düzeltme ameliyatı¹gerektirir. Ancak, altta yatan mekanizma belirsiz²kalır. Uzun bir takip olan bir durum nadirdir, parçacık kaynaklı Osteoliz algılamak için gereklidir; Bu nedenle, klinik durumlarda onun patogenezinde keşfetmeye davet ediyor. Bu nedenle, daha fazla çalışmaları karmaşık cep ve doku mekanizmaları üzerinde odaklanarak hem in vivo deneyler parçacık kaynaklı Osteoliz modelleri ve vitro deneyleri homeostazı³kemik ile ilgili hücrelerde giymek gerektirir. Geçerli bir hayvan modeli daha da hücresel deneyleri için kanıt sağlayan kemik kaybı, aşınma partikülleri etkilerini ortaya önemlidir.

Bir fare grefti Osteoliz model CoCrMo parçacıklar maruz inşa parçacıklar ve aseptik gevşeme çeşitli hücreler arasındaki etkileşimler değerlendirmek için etkili ve geçerli bir yöntemdir. Bu modelde, CoCrMo parçacıklar grefti Osteoliz makrofajlar içinde inflamatuar sitokinlerin inducing, Osteoklastlar etkinleştirme, osteoblast yayılması inhibe ve osteoblast apoptosis teşvik neden.

Sadece bu modeli kurmak için iki hafta sürer. Osteoliz görüntülenir ve Hematoksilen Eozin (H & E) boyama ile sayısal ve mikro Bilgisayarlı Tomografi (mikro-CT)². Buna ek olarak, bu modeli nispeten düşük maliyetli ve transgenik ve nakavt fare modelleri çeşitli dozlarda³bileşikler çok sayıda ekran için kullanılabilir vardır.

Kurmak ve bu model değerlendirmek için basit bir yöntemdir. İlk olarak, CoCrMo parçacıklar yüksek vakum üç elektrot doğru akım tarafından elde edilen ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 50 mg/mL bir konsantrasyon, resuspended. Sonra sonra kafatası kapaklarini tarafından ayrılması keskin diseksiyon elde edilen süspansiyon 50 µL fare calvaria ortasına kadar uygulandı. Fareler iki hafta sonra kurban edildi ve calvaria örnekleri hasat edildi; nitel ve nicel analizler H & E andmicro-CT boyama tarafından gerçekleştirilmiştir

Bir fare grefti Osteoliz model CoCrMo parçacıklar maruz inşa CoCrMo parçacıklar ve makrofajlar, fibroblastlar, dokusunu ve aseptik gevşeme içinde Osteoklastlar, gibi çeşitli hücreler arasındaki etkileşimler değerlendirmek için ideal bir araçtır.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Nanjing Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. CoCrMo parçacık hazırlık

1. CoCrMo parçacıklar bir fabrikasyon yüksek vakum üç elektrot doğru akım⁴kullanarak elde. 10^-3 Pa vakum, 0,04 MPa argon ve hidrojen 3:2 (v/v) altında alet CoCrMo alaşım ve 650 A katot geçerli yerleştirin.
2. CoCrMo parçacıklar çapı ölçmek.
   1. 1 mg CoCrMo parçacıkların susuz etanol 1,5 mL ekleyin.
   2. CoCrMo parçacıklar susuz etanol ultrasonik 28 kHz ve 5 min için 600 W sallayarak resuspend.
   3. Bir damla (yaklaşık 20 µL) elde edilen süspansiyon transmisyon elektron mikroskobu (TEM) objektif masaya uygulanır. 200 kV ivme gerilim ve 0,24 nm çözünürlük TEM fotoğraf serisi yakalamak.
   4. TEM Filmler ortalama çap ve parçacık boyutu dağıtım hesaplamak için sağlanan yazılımı kullanın.
3. Endotoxins dezenfekte etmek
   1. Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 15 psi için parçacıkların 50 gr.
   2. Endotoxins bir nicel Limulus Amebocyte Lysate (LAL) tahlil tarafından tespit (< % 0.25 EU/mL endotoksin devamsızlık belirtmek için olarak kabul)⁵.
4. Parçacıklar fosfat tamponlu tuz (PBS) 50 mg/mL konsantrasyonu hisse senedi çözüm⁶olarak, resuspend.

2. inşaat grefti Osteoliz modeli

1. 6 haftalık C57BL/J6 fareler (grup başına altı fareler) withpentobarbital (50 mg/kg) anestezi. Çimdik testi anestezi düzeyini değerlendirmek için kullanın. Gözleri normal salin ile kurutma önlemek.
2. Fareler yüzükoyun sígara yerleştirin. Kafatası üzerinde kürk bir tıraş makinesi ile kaldırın ve % 75 etanol içeren tıbbi pamuk topları kullanarak cilt dezenfekte.
3. Noktası yerelleştirme için de dahil olmak üzere iki gözüm kulağım arasında orta sırasıyla iki nokta tanımlayın. Sonra iki puan yukarıda arasındaki çizgi belirlemek ve yukarıdaki hattı boyunca cilt (şekil 1A) makasla deşmek.
4. Kafatası kapaklarini bir neşter (şekil 1B)⁶calvaria kaldırın.
5. Her iki ucunda deri ile basit kesintiye uğramış Dikiş dikiş.
6. Belgili tanımlık kesme ortasına dikiş hattından knotting olmadan olun. Dikiş hattı iki ucu tut.
7. CoCrMo parçacık süspansiyon (50 mg/mL, PBS), 50 µL ortasında calvarias (şekil 1 c)²gömün.
8. Basit kesintiye uğramış dikiş (şekil 1 d) içinde son dikiş düğüm.
9. Fareler için başka bir 2 hafta korumak.

3. mikro-CT tarama grefti Osteoliz modeli değerlendirilmesi

1. Karbon dioksit ile fareler kurban. Yatay düzlemde farelerde başını kesmek. Beyin dokusu içinde ve cilt kaldırın ve dışarı kürk. Calvarias daha fazla deneyler için hasat.
2. Yavaşça yukarı calvaria üzerinde tüm yumuşak doku cımbız ile temizleyin. %4 paraformaldehyde temizlenen calvarias calvarias mikro-CT tarama önce PBS 24 h 24 h bırakın için 4 ° C'de tamir et.
3. Yüksek çözünürlüklü mikro-CT 18 µm izometrik bir çözünürlükte ve x-ışını enerji ayarları 45 tarafından fareler calvarias analiz kV ve 550 anne.
4. Mikro-CT veri yazılımı ile üç boyutlu yeniden yapılandırma kuralları.
5. Kalitatif ve kantitatif analiz.
   1. İlk olarak, kare bölgenin orta hat dikiş çevresinde faiz bölgesi olarak seçin.
   2. İkinci olarak, ölçmek kemik mineral yoğunluğu (KMY), birim/toplam kemik birim (BV/TV), Trabeküler numarası (Tb.N), Trabeküler kalınlığı (Tb.Th), Trabeküler ayırma/aralığı (Tb.Sp) ve mikro-CT için sağlanan yazılımı ile toplam gözeneklilik yüzdesi
   3. Üçüncü olarak, tek yönlü ANOVA tarafından çeşitli ölçümler için üç grup karşılaştırın. Öğleden hoc Varyans analizi için Bonferroni yöntem²uygulayın.

4. grefti Osteoliz Model H & E boyama tarafından değerlendirilmesi

1. Calvaria örneklerinde % 15 etilen diamin tetraacetic asit (EDTA) decalcify-4 ° C'de PBS Kalsiyumun çözüm 3 hafta boyunca her gün değiştirin.
2. Parafin bir 2 cm x 1 cm x 1 cm küp için decalcified örnekleri katıştır ve onları 2 µm bölümlere partikül yükünün alanında dilim.
3. Hematoksilen bölümlerle leke ve Eozin daha önce⁷açıklandığı gibi.
4. Genel pathomorphism Filmler tarafından ışık mikroskobu yakalamak.

Sonuçlar

Kurum içi üretilen Nano CoCrMo parçacıklar 50 civarında olduğunu TEM (Şekil 2) tarafından sayısal olarak çapı, nm (3,56 standart hatası). Fare calvarias maruz CoCrMo parçacıklar, hayvanlar için kaldıktan sonra (n = 6 grup başına) için başka bir iki hafta muhafaza. İki hafta içinde grefti kesi tamamen iyileşmiş olarak ve dikişi düşebilir. Herhangi bir yerel enfeksiyon veya sendikasız Mayıs kemik kaybı değerlendirme etkiler. Fare ...

Tartışmalar

Aşınma parçacık kaynaklı Osteoliz farelerde için iki ana yöntem vardır: hava kesesi modeli ve grefti Osteoliz modeli. Hava kesesi modelinde, subkutan oluşturulan bir hava kesesi ilk, aşınma parçacık giriş ve implantasyon kemik doku⁸ardından kuruldu. Kese duvar aseptik gevşeme içinde kapaklarini taklit eder. Ancak, kemik implantasyon parçacıklar ve kemik doku arasındaki doğrudan etkileşim değerlendirmek zordur hiçbir biyolojik etkinlik ile nonvascular. Grefti Osteoliz model ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CoCrMo alloy from prosthesis	Waldemar Link GmbH & Co	GEMINI MK II	Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current	College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology		Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice	Model animal research center of Nanjing University	N000013
100% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691514023	Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W603
Microanalytical balance	Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD	EX125DZH
Ultrasonic shaker	Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD	YH-200DH	To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G20
SimplePCI software	Compix Inc.	6.6 version	To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan	QIULONGYIQI	KYQL-100DS	To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay	Charles River	R13025	To detect endotoxin
15 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Suyi Medical	B122
Phosphate-buffered saline	Boster Biological Technology	AR0030	Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium	Sigma	P3761	To anesthetize mice
Normal saline	SACKLER	SR8572EP-15	To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691560275	Disinfection
Medical cotton ball	Shuitao	1278298933	Disinfection
Shaver	Kemei	KM-3018	To shave the fur
Scissor	RWD LIFE SCIENCE	S12005-10	To incise skin
Suture	RWD LIFE SCIENCE	F34001-01	To suture skin
Needle holder	RWD LIFE SCIENCE	F33001-01	To suture skin
Needle	RWD LIFE SCIENCE	R14003-12	To suture skin
Vessel forceps	RWD LIFE SCIENCE	F22003-09	To suture skin
Scalpel	RWD LIFE SCIENCE	S31010-01	To harvest calvaria
Tweezers	RWD LIFE SCIENCE	F12006-10	To harvest calvaria
100 µL pipettes	Eppendorf	3120000240	To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips	AXYGEN	T-200-Y	To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W621
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Fixation
Micro Computed Tomography	SkyScan	SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid	Servicebio	G1105	Decalcification
Paraffin	Servicebio	#0001
Paraffin slicing machine	Leica	RM2125RTS
Glass slide	Servicebio	G6004
Cover glass	Servicebio	200
HE staining kit	Servicebio	#1-5	HE staining
Light microscope	Nikon	E200