Construção e avaliação de um modelo murino de osteólise raspagem pela exposição a partículas de CoCrMo no afrouxamento asséptico

Resumo

Este manuscrito descreve um modelo murino de osteólise raspagem por exposição a partículas CoCrMo, que constitui um modelo animal ideal para avaliar as interações entre as partículas de desgaste e várias células no afrouxamento asséptico.

Resumo

A osteólise induzida por partículas de desgaste é a principal causa de afrouxamento asséptico em artroplastia falha, mas o mecanismo subjacente permanece obscuro. Devido ao tempo de follow-ups necessário para a detecção e a ocorrência esporádica, é difícil avaliar a osteólise induzida por ofparticle de patogênese em casos clínicos. Daí, modelos animais ideais são necessários para estudos adicionais. O modelo murino de raspagem osteólise estabelecido pela exposição a partículas CoCrMo é uma ferramenta eficaz e válida para avaliar as interacções entre partículas e várias células no afrouxamento asséptico. Neste modelo, partículas CoCrMo primeiro foram obtidas por alto vácuo três-elétrodo corrente e resuspended em tampão fosfato salina em uma concentração de 50 mg/mL. Em seguida, 50 µ l da suspensão resultante foi aplicado para o meio do calvaria murino após o ponto de separação entre o periósteo craniana por dissecação. Depois de duas semanas, os ratos foram sacrificados e calvaria foram colhidas; avaliações qualitativas e quantitativas foram realizadas pela hematoxilina e eosina manchando e micro computadorizada. Os pontos fortes deste modelo incluem a simplicidade do procedimento, avaliação quantitativa da perda óssea, rapidez de desenvolvimento de osteólise, potencial uso de transgénico ou modelos de nocaute e um custo relativamente baixo. No entanto, este modelo não para ser usado para avaliar a força mecânica e efeitos crônicos de partículas no afrouxamento asséptico. Modelo murino osteólise raspagem gerado pela exposição a partículas CoCrMo é uma ferramenta ideal para avaliar as interações entre as partículas de desgaste e várias células, por exemplo, macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos, no afrouxamento asséptico.

Introdução

Afrouxamento asséptico é a causa mais comum de artroplastia total de quadril (THA) e falha de total de joelho (ATJ) de artroplastia, que requer cirurgia de revisão¹. No entanto, o mecanismo subjacente permanece incerto². Um seguimento longo é necessário para detectar a osteólise induzida por partículas, cuja ocorrência é rara; Portanto, é um desafio para explorar sua patogênese em casos clínicos. Daí, mais estudos focando mecanismos celulares e tecidos complexos requerem que ambos experimentos na vivo em usam modelos de osteólise induzida por partículas e ensaios em vitro em células relacionadas ao osso homeostase³. Um válido modelo animal é importante para revelar os efeitos de partículas de desgaste na perda óssea, fornecendo evidências para mais celulares ensaios.

Um modelo murino de osteólise raspagem construído pela exposição a partículas CoCrMo é um método eficaz e válido para avaliar as interacções entre partículas e várias células no afrouxamento asséptico. Neste modelo, CoCrMo partículas causam osteólise raspagem por indução de citocinas inflamatórias em macrófagos, ativação de osteoclastos, inibindo a proliferação de osteoblastos e promover apoptose de osteoblastos.

Apenas leva duas semanas para estabelecer esse modelo. Osteólise pode ser visualizada e quantificada por hematoxilina e eosina (H & E) coloração e micro computado tomografia computadorizada (micro-CT)². Além disso, este modelo tem um relativamente baixo custo e transgênico e nocaute mouse modelos podem ser usados para um grande número de compostos em várias doses³de tela.

O procedimento para estabelecer e avaliar este modelo é simples. Primeiro, CoCrMo partículas foram obtidas por alto vácuo três-elétrodo corrente e resuspended em tampão fosfato salino (PBS), em uma concentração de 50 mg/mL. Em seguida, 50 µ l da suspensão resultante foi aplicado para o meio do calvaria murino após o ponto de separação entre o periósteo craniana por dissecação. Os ratos foram sacrificados após duas semanas, e foram colhidas amostras de calvaria; análises qualitativas e quantitativas foram realizadas por H & E mancha de andmicro-CT.

Um modelo murino de osteólise raspagem construído pela exposição a partículas CoCrMo é uma ferramenta ideal para avaliar as interações entre partículas CoCrMo e várias células, como macrófagos, fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos, no afrouxamento asséptico.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Nanjing e institucional Cuidado Animal.

1. CoCrMo partícula preparação

1. Obter partículas CoCrMo usando um alto vácuo fabricadas três-elétrodo corrente⁴. Liga CoCrMo lugar no instrumento sob vácuo de Pa 10^-3 , 0,04 MPa argônio e hidrogênio 3:2 (v/v) e 650 cátodo A atual.
2. Medir os diâmetros das partículas CoCrMo.
   1. Adicione 1 mg de CoCrMo partículas em 1,5 mL de etanol anidro.
   2. Resuspenda CoCrMo partículas em etanol anidro por agitação ultra-sônica em 28 kHz e 600 W por 5 min.
   3. Aplique uma gota (cerca de 20 µ l) da suspensão resultante na tabela objetiva de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Capture a série de fotos TEM 200 kV tensão de aceleração e 0,24 resolução nm.
   4. Use o software fornecido para calcular a distribuição de tamanho de diâmetro e partícula média em micrografias TEM.
3. Descontaminar endotoxinas
   1. 50 g de partículas por 15 min a 121 ° C e 15 libras por polegada quadrada de autoclave.
   2. Detecção de endotoxinas por um ensaio quantitativo de Limulus métodos Lysate (LAL) (< 0,25% EU/mL foi considerado para indicar a ausência de endotoxinas)⁵.
4. Resuspenda as partículas em tampão fosfato salino (PBS), em uma concentração de 50 mg/mL como solução⁶.

2. construção do modelo de osteólise raspagem

1. Anestesia a 6 semana de idade withpentobarbital de (seis ratos por grupo) de camundongos C57BL/J6 (50 mg/kg). Use o teste do beliscão para avaliar o nível de anestesia. Evitar a secagem dos olhos com soro fisiológico normal.
2. Coloque os ratos de bruços. Retire a pele sobre o crânio com uma máquina de barbear e desinfectar a pele usando bolas de algodão médico contendo 75% de etanol.
3. Para a localização do ponto, identifica dois pontos, incluindo os pontos médios entre os dois olhos e ouvidos, respectivamente. Em seguida, determinar a linha entre as duas acima pontos e faça uma incisão na pele ao longo da linha acima com uma tesoura (figura 1A).
4. Remova o periósteo craniano a calvaria com um bisturi (figura 1B)⁶.
5. Sutura de pele em ambas as extremidades com sutura interrompida simples.
6. Faça uma linha de sutura no meio da incisão sem atar. Segure as duas extremidades da linha de sutura.
7. Incorpore 50 µ l de suspensão de partículas de CoCrMo (50 mg/mL, em PBS) no meio do calvarias (Figura 1)².
8. Nó o último ponto dentro simples sutura interrompida (Figura 1).
9. Manter os ratos por mais 2 semanas.

3. avaliação do modelo de osteólise raspagem por Microtomografia

1. Sacrifica os ratos com dióxido de carbono. Decapitar os ratos no plano horizontal. Remova o tecido de cérebro no interior e a pele e pelo do lado de fora. Colha o calvarias para novas experiências.
2. Limpe suavemente todo o tecido mole sobre o calvaria com uma pinça. Corrigi o calvarias apuradas em paraformaldeído 4% a 4 ° C por 24 h. mergulhar o calvarias em PBS 24 h antes de micro-CT varredura.
3. Analisar o calvarias de ratos por micro-CT de alta resolução com uma resolução isométrica de 18 µm e as configurações de energia de raios-x de 45 kV e 550 mA.
4. Realizar a reconstrução tridimensional de dados micro-CT com o software.
5. Qualitativa e análise quantitativa.
   1. Primeiro, selecione a região quadrada ao redor da sutura mediana como a região de interesse.
   2. Em segundo lugar, medir a densidade mineral óssea (DMO), volume/total de osso volume (BV/TV), número trabecular (Tb.N), espessura trabecular (Tb.Th), separação/espaçamento trabecular (Tb.Sp) e percentual de porosidade total com o software fornecido para micro-CT.
   3. Em terceiro lugar, compare os três grupos para várias medições por One-Way ANOVA. Para post-hoc de análise de variância, aplica o método de Bonferroni².

4. avaliação do modelo de osteólise raspagem pela coloração H & E

1. Descalcificar amostras de calvaria em 15% ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-PBS a 4 ° C. Modificar a solução de descalcificação a cada dia por 3 semanas.
2. Incorporar as amostras descalcificadas em parafina para um 2 x 1 cm x 1 cubo de cm e corte-os em 2 seções de µm na área de deposição de partículas.
3. Manchar as seções com hematoxilina e eosina conforme descrito anteriormente⁷.
4. Capture o micrografias do pathomorphism global por microscopia de luz.

Resultados

As partículas de CoCrMo in-house nanoescala produzidos foram em torno de 50 nm (erro padrão de 3,56) de diâmetro, conforme quantificada pela TEM (Figura 2). Após a exposição do rato calvarias a CoCrMo partículas, os animais (n = 6 por grupo) foram mantidas por mais duas semanas. Dentro de duas semanas, a incisão raspagem foi completamente curada, e a sutura pode cair. Qualquer infecção local ou pseudartrose maio afetam a avaliação de perda óssea....

Discussão

Há dois métodos principais para a osteólise induzida por partículas de desgaste em ratos: o modelo de ar-bolsa e o modelo de osteólise raspagem. No modelo de bolsa de ar, uma bolsa de ar gerada por via subcutânea é estabelecida, seguido pela introdução de partículas de desgaste e implantação para o osso tecido⁸. A parede da bolsa imita o periósteo no afrouxamento asséptico. No entanto, a implantação de osso é nonvascular sem nenhuma atividade biológica, o que torna difícil avali...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CoCrMo alloy from prosthesis	Waldemar Link GmbH & Co	GEMINI MK II	Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current	College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology		Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice	Model animal research center of Nanjing University	N000013
100% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691514023	Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W603
Microanalytical balance	Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD	EX125DZH
Ultrasonic shaker	Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD	YH-200DH	To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G20
SimplePCI software	Compix Inc.	6.6 version	To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan	QIULONGYIQI	KYQL-100DS	To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay	Charles River	R13025	To detect endotoxin
15 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Suyi Medical	B122
Phosphate-buffered saline	Boster Biological Technology	AR0030	Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium	Sigma	P3761	To anesthetize mice
Normal saline	SACKLER	SR8572EP-15	To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691560275	Disinfection
Medical cotton ball	Shuitao	1278298933	Disinfection
Shaver	Kemei	KM-3018	To shave the fur
Scissor	RWD LIFE SCIENCE	S12005-10	To incise skin
Suture	RWD LIFE SCIENCE	F34001-01	To suture skin
Needle holder	RWD LIFE SCIENCE	F33001-01	To suture skin
Needle	RWD LIFE SCIENCE	R14003-12	To suture skin
Vessel forceps	RWD LIFE SCIENCE	F22003-09	To suture skin
Scalpel	RWD LIFE SCIENCE	S31010-01	To harvest calvaria
Tweezers	RWD LIFE SCIENCE	F12006-10	To harvest calvaria
100 µL pipettes	Eppendorf	3120000240	To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips	AXYGEN	T-200-Y	To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W621
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Fixation
Micro Computed Tomography	SkyScan	SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid	Servicebio	G1105	Decalcification
Paraffin	Servicebio	#0001
Paraffin slicing machine	Leica	RM2125RTS
Glass slide	Servicebio	G6004
Cover glass	Servicebio	200
HE staining kit	Servicebio	#1-5	HE staining
Light microscope	Nikon	E200