Construction et évaluation d’un modèle murin ostéolyse substance par l’exposition aux particules CoCrMo descellement aseptique

Résumé

Ce manuscrit décrit un modèle murin ostéolyse substance par l’exposition aux particules CoCrMo, qui constitue un modèle animal idéal pour évaluer les interactions entre particules d’usure et de diverses cellules de descellement aseptique.

Résumé

Ostéolyse de provoquées par les particules d’usure est une cause majeure de descellement aseptique dans l’échec de l’arthroplastie, mais le mécanisme sous-jacent reste incertaine. En raison de longs suivis nécessaires pour la détection et la présence sporadique, il est difficile d’évaluer l’ostéolyse induite par l’ofparticle pathogenèse en cas cliniques. Optimale des modèles animaux sont donc nécessaires pour poursuivre ses études. Le modèle murin d’ostéolyse substance établie par l’exposition aux particules CoCrMo est un outil efficace et valable pour évaluer les interactions entre les particules et les diverses cellules de descellement aseptique. Dans ce modèle, CoCrMo particules ont d’abord obtenus en courant continu de vide élevé trois électrodes et remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate à une concentration de 50 mg/mL. Puis, 50 µL de la suspension qui en résulte a été appliquée au milieu de la calvaria murine après séparation du périoste crânien par sharp dissection. Après deux semaines, les souris ont été sacrifiées, et des spécimens de calotte cranienne ont été récoltés ; les évaluations qualitatives et quantitatives ont été effectuées par l’hématoxyline et éosine coloration et micro tomographie. Les points forts de ce modèle comprennent la simplicité de la procédure, une évaluation quantitative de la perte osseuse, rapidité de développement d’ostéolyse, utilisation potentielle transgénique ou des modèles knock-out et un coût relativement faible. Toutefois, ce modèle ne peut pour servir à évaluer la force mécanique et les effets chroniques des particules dans un descellement aseptique. Modèle murin ostéolyse substance générée par l’exposition aux particules CoCrMo est un outil idéal pour évaluer les interactions entre les particules d’usure des cellules, par exemple, macrophages, fibroblastes, ostéoblastes et des ostéoclastes, au descellement aseptique.

Introduction

Le descellement aseptique est la cause la plus fréquente d’arthroplastie totale de hanche (THA) et l’échec d’arthroplastie (TKA) totale du genou, qui nécessite une chirurgie de révision¹. Toutefois, le mécanisme sous-jacent reste peu clair². Un suivi long est nécessaire pour la détection d’ostéolyse provoquées par les particules, dont la présence est rare ; par conséquent, il est difficile d’explorer sa pathogenèse en cas cliniques. Par conséquent, autres études mettant l’accent sur des mécanismes complexes de cellulaire et tissulaire nécessitent que les deux expériences in vivo en portent des modèles ostéolyse provoquées par les particules et des essais in vitro dans les cellules liées à l’os de l’homéostasie du³. Un modèle animal valide est important en révélant les effets des particules d’usure sur la perte osseuse, fournissant des preuves pour plus amples analyses cellulaires.

Un modèle murin ostéolyse substance construit par l’exposition aux particules CoCrMo est une méthode efficace et valable pour évaluer les interactions entre les particules et les diverses cellules de descellement aseptique. Dans ce modèle, particules CoCrMo causent ostéolyse substance en induisant des cytokines inflammatoires dans les macrophages, activation des ostéoclastes, inhibant la prolifération ostéoblastique et en encourageant l’apoptose ostéoblastique.

Il faut seulement deux semaines pour établir ce modèle. Ostéolyse peut être visualisé et quantifié par l’hématoxyline et éosine (H & E) souillant et micro computed tomography (micro-CT)². En outre, ce modèle a une relativement faible coût et transgénique et knock-out souris modèles peuvent être utilisés pour dépister un grand nombre de composés à différentes doses³.

La procédure pour établir et évaluer ce modèle est simple. Tout d’abord, CoCrMo particules ont été obtenues en courant continu de vide élevé trois électrodes et remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 50 mg/mL. Puis, 50 µL de la suspension qui en résulte a été appliquée au milieu de la calvaria murine après séparation du périoste crânien par sharp dissection. Les souris ont été sacrifiées après deux semaines, et les échantillons de calotte cranienne ont été récoltés ; analyses qualitatives et quantitatives ont été effectuées par H & E coloration andmicro-CT.

Un modèle murin ostéolyse substance construit par l’exposition aux particules CoCrMo est un outil idéal pour évaluer les interactions entre particules CoCrMo et diverses cellules, telles que les macrophages, fibroblastes, ostéoblastes et les ostéoclastes, au descellement aseptique.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Nanjing.

1. préparation de particules CoCrMo

1. Obtenir CoCrMo particules en utilisant un mécano vide élevé trois électrodes de courant continu⁴. Placez CoCrMo alliage dans l’instrument sous vide de Pa^-3 10, 0,04 MPa argon et hydrogène 3 / 2 (v/v) et 650 A cathode actuel.
2. Mesurer les diamètres de particules CoCrMo.
   1. Ajouter 1 mg de particules CoCrMo dans 1,5 mL d’éthanol anhydre.
   2. Remettre en suspension les particules CoCrMo dans l’éthanol anhydre par agitation ultrasonique à 28 kHz et 600 W pendant 5 min.
   3. Appliquer une goutte (environ 20 µL) de la suspension qui en résulte sur la table objective d’un microscope électronique à transmission (TEM). Série de photos TEM à 200 tension d’accélération kV et 0,24 nm résolution de capture.
   4. Le logiciel fourni permet de calculer la moyenne granulométrie de diamètre et de particules dans les micrographies TEM.
3. Décontaminer les endotoxines
   1. Autoclave 50 g de particules pendant 15 minutes à 121 ° C et 15 psi.
   2. Détecter les endotoxines par un test quantitatif de Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (< 0,25 % UE/mL était censée indiquer l’absence de l’endotoxine)⁵.
4. Remettre en suspension les particules dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 50 mg/mL en solution mère⁶.

2. construction du modèle substance ostéolyse

1. Anesthésier âgés de 6 semaine C57BL/J6 souris (six souris par groupe) withpentobarbital (50 mg/kg). Le test du pincement permet d’évaluer le niveau de l’anesthésie. Éviter le dessèchement des yeux avec une solution saline normale.
2. Placez la souris en position couchée. Enlever la fourrure sur le crâne avec un rasoir et désinfecter la peau à l’aide de boules de coton médical contenant 75 % d’éthanol.
3. Pour la localisation du point, identifier deux points, y compris les milieux entre les deux yeux et les oreilles, respectivement. Ensuite, déterminer la frontière entre ces deux points et inciser la peau le long de la ligne ci-dessus avec des ciseaux (Figure 1 a).
4. Retirez le périoste crânien de la calotte cranienne avec un scalpel (Figure 1 b)⁶.
5. Peau de suture aux deux extrémités par simple suture interrompu.
6. Faire une ligne de suture par le milieu de l’incision sans nouage. Tenir les deux extrémités de la ligne de suture.
7. Incorporer 50 µL de la suspension de particules CoCrMo (50 mg/mL dans du PBS) au milieu de la calvarias (Figure 1)².
8. Nouez la dernière maille au sein de la simple suture interrompu (Figure 1).
9. Maintenir la souris pour un autre 2 semaines.

3. évaluation du modèle de substance ostéolyse par Micro-TDM

1. Sacrifier les souris avec le dioxyde de carbone. Décapiter les souris dans le plan horizontal. Retirez le tissu cérébral à l’intérieur et la peau et la fourrure à l’extérieur. Récolter le calvarias pour d’autres expériences.
2. Éclaircir tous les tissus mous sur la calotte cranienne doucement avec des pincettes. Difficulté la calvarias déboisées dans 4 % paraformaldéhyde à 4 ° C pendant 24 h. immerger le calvarias en PBS 24h avant micro-tomodensitométrie.
3. Analyser la souris calvarias par micro-CT haute résolution à une résolution isométrique de 18 µm et paramètres d’énergie des rayons x de 45 kV et 550 mA.
4. Procéder à une reconstruction tridimensionnelle de données micro-CT avec le logiciel.
5. Analyse qualitative et quantitative.
   1. Tout d’abord, sélectionnez la région carrée autour de la suture médiane comme la région d’intérêt.
   2. Ensuite, mesurer la densité minérale osseuse (DMO), OS volume/total volume (BV/TV), nombre trabéculaire (Tb.N), l’épaisseur trabéculaire (Tb.Th), séparation/espacement trabéculaire (Tb.Sp) et pourcentage de porosité totale avec le logiciel pour micro-CT.
   3. Troisièmement, de comparer les trois groupes pour différentes mesures par ANOVA à. Pour l’analyse post-hoc de la variance, appliquer la méthode de Bonferroni².

4. evaluation de la substance ostéolyse modèle par une coloration H & E

1. Détartrage des échantillons de la calotte cranienne dans 15 % acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA)-PBS à 4 ° C. Changez la solution de détartrage tous les jours pendant 3 semaines.
2. Incorporer les échantillons décalcifiées à la paraffine pour un 2 x 1 cm x 1 cube de cm et les couper en 2 sections de µm dans la zone de dépôt de particules.
3. Tacher les sections à l’hématoxyline et éosine décrite précédemment⁷.
4. Capturer les micrographies de la pathomorphism globale au microscope photonique.

Résultats

Les produit nanoparticules CoCrMo internes étaient environ 50 nm (erreur standard de 3,56) de diamètre, tel que quantifié par TEM (Figure 2). Après l’exposition de souris calvarias CoCrMo particules, les animaux (n = 6 par groupe) ont été maintenus pendant encore deux semaines. Dans les deux semaines, l’incision de substance a été complètement guérie, et la suture peut tomber. Toute infection locale ou une pseudarthrose mai affecter l’évaluat...

Discussion

Il existe deux méthodes principales pour usure provoquées par les particules ostéolyse chez la souris : le modèle air-poche et le modèle de substance ostéolyse. Le modèle air-poche, une pochette-air générée par voie sous-cutanée est tout d’abord établie, suivi par introduction de particules usure et l’implantation dans le tissu d’OS⁸. Le mur de la pochette imite le périoste au descellement aseptique. Cependant, l’implantation de l’OS est non vasculaires sans activité biolo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CoCrMo alloy from prosthesis	Waldemar Link GmbH & Co	GEMINI MK II	Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current	College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology		Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice	Model animal research center of Nanjing University	N000013
100% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691514023	Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W603
Microanalytical balance	Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD	EX125DZH
Ultrasonic shaker	Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD	YH-200DH	To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G20
SimplePCI software	Compix Inc.	6.6 version	To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan	QIULONGYIQI	KYQL-100DS	To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay	Charles River	R13025	To detect endotoxin
15 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Suyi Medical	B122
Phosphate-buffered saline	Boster Biological Technology	AR0030	Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium	Sigma	P3761	To anesthetize mice
Normal saline	SACKLER	SR8572EP-15	To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691560275	Disinfection
Medical cotton ball	Shuitao	1278298933	Disinfection
Shaver	Kemei	KM-3018	To shave the fur
Scissor	RWD LIFE SCIENCE	S12005-10	To incise skin
Suture	RWD LIFE SCIENCE	F34001-01	To suture skin
Needle holder	RWD LIFE SCIENCE	F33001-01	To suture skin
Needle	RWD LIFE SCIENCE	R14003-12	To suture skin
Vessel forceps	RWD LIFE SCIENCE	F22003-09	To suture skin
Scalpel	RWD LIFE SCIENCE	S31010-01	To harvest calvaria
Tweezers	RWD LIFE SCIENCE	F12006-10	To harvest calvaria
100 µL pipettes	Eppendorf	3120000240	To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips	AXYGEN	T-200-Y	To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W621
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Fixation
Micro Computed Tomography	SkyScan	SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid	Servicebio	G1105	Decalcification
Paraffin	Servicebio	#0001
Paraffin slicing machine	Leica	RM2125RTS
Glass slide	Servicebio	G6004
Cover glass	Servicebio	200
HE staining kit	Servicebio	#1-5	HE staining
Light microscope	Nikon	E200