Costruzione e valutazione di un modello murino Osteolysis Calvarial tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo in allentamento asettico

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un modello murino calvarial osteolisi da esposizione a particelle di CoCrMo, che costituisce un modello animale ideale per valutare le interazioni tra le particelle di usura e varie cellule nella mobilizzazione asettica.

Abstract

Osteolisi indotta da particelle di usura sono delle principali cause di allentamento asettico in un arthroplasty fallimento, ma il meccanismo di fondo rimane poco chiaro. A causa del lungo follow-up necessari al rilevamento ed avvenimento sporadico, è difficile per valutare l'osteolisi indotta da ofparticle patogenesi nei casi clinici. Quindi, modelli animali ottimale sono richiesti per ulteriori studi. Il modello murino di osteolysis calvarial stabilito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento efficace e valido per valutare le interazioni tra particelle e varie cellule nella mobilizzazione asettica. In questo modello, CoCrMo particelle sono state ottenute da tre elettrodi ad alto vuoto corrente e risospesi in tampone fosfato salino ad una concentrazione di 50 mg/mL. Quindi, 50 µ l della sospensione risultante è stato applicato alla metà del calvaria murino dopo separazione del periostio cranico di dissezione. Dopo due settimane, i topi sono stati sacrificati, e sono stati raccolti campioni di calvaria; valutazioni qualitative e quantitative sono state eseguite da ematossilina ed eosina e micro tomografia computata. I punti di forza di questo modello includono procedura semplicità, la valutazione quantitativa di perdita dell'osso, la rapidità di sviluppo di osteolisi, uso potenziale transgenico o Knock e un costo relativamente basso. Tuttavia, questo modello non può essere utilizzato per valutare la forza meccanica ed effetti cronici delle particelle in allentamento asettico. Modello murino osteolisi calvarial generato tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento ideale per valutare le interazioni tra le particelle di usura e varie cellule, ad es., macrofagi, fibroblasti, osteoblasti e osteoclasti, in allentamento asettico.

Introduzione

Mobilizzazione asettica è la causa più comune di arthroplasty totale dell'anca (THA) e guasto (TKA) arthroplasty totale del ginocchio, che richiede la chirurgia di revisione¹. Tuttavia, il meccanismo di fondo rimane poco chiaro². Un lungo follow-up è necessario per rilevare il osteolysis particella-indotto, cui il caso è raro; di conseguenza, è difficile per esplorare la relativa patogenesi nei casi clinici. Quindi, ulteriori studi concentrandosi sui complessi meccanismi cellulari e tessutali richiedono che entrambi gli esperimenti in vivo a indossano modelli osteolysis particella-indotto e saggi in vitro in cellule legate alle ossa omeostasi³. Un valido modello animale è importante nel rivelare gli effetti particelle di usura su perdita dell'osso, fornendo la prova per ulteriori test cellulari.

Un modello murino osteolisi calvarial costruito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è un metodo efficace e valido per valutare le interazioni tra particelle e varie cellule nella mobilizzazione asettica. In questo modello, le particelle CoCrMo provocare osteolisi calvarial d'induzione di citochine infiammatorie in macrofagi, attivando gli osteoclasti, inibendo la proliferazione degli osteoblasti, e promuovendo l'apoptosi degli osteoblasti.

Ci vogliono solo due settimane per stabilire questo modello. Osteolisi possono essere visualizzato e quantificata con ematossilina ed eosina (H & E) e micro computato tomografia (micro-CT)². Inoltre, questo modello ha un relativamente basso costo e transgenico e knockout mouse modelli possono essere utilizzati per lo screening di un gran numero di composti alle varie dosi³.

La procedura per stabilire e valutare questo modello è semplice. In primo luogo, CoCrMo particelle sono state ottenute da tre elettrodi ad alto vuoto corrente e risospesi in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 50 mg/mL. Quindi, 50 µ l della sospensione risultante è stato applicato alla metà del calvaria murino dopo separazione del periostio cranico di dissezione. I topi sono stati sacrificati dopo due settimane, e sono stati raccolti campioni di calvaria; analisi qualitative e quantitative sono state effettuate da H & E che macchia andmicro-CT.

Un modello murino osteolisi calvarial costruito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento ideale per valutare le interazioni tra particelle CoCrMo e varie cellule, quali i macrofagi, fibroblasti, osteoblasti e osteoclasti, in allentamento asettico.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Nanchino.

1. preparazione delle particelle CoCrMo

1. Ottenere particelle CoCrMo utilizzando una corrente continua di fabbricato ad alto vuoto tre elettrodi⁴. Lega CoCrMo posto nello strumento sotto 10^-3 Pa vuoto, 0,04 MPa argon e idrogeno 3:2 (v/v) e 650 A catodo attuale.
2. Misurare i diametri delle particelle CoCrMo.
   1. Aggiungere 1 mg di CoCrMo particelle in 1,5 mL di etanolo anidro.
   2. Risospendere CoCrMo particelle in etanolo anidro agitando ad ultrasuoni a 28 kHz e 600 W per 5 min.
   3. Applicare una goccia (circa 20 µ l) della sospensione risultante sul tavolo oggettiva di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Serie di foto TEM a 200 kV tensione di accelerazione e 0,24 nm risoluzione di cattura.
   4. Utilizzare il software fornito per calcolare la distribuzione delle dimensioni della particella e di diametro media in micrografie TEM.
3. Decontaminare le endotossine
   1. Autoclave 50g di particelle per 15 min a 121 ° C e 15 psi.
   2. Rilevare le endotossine da un'analisi quantitativa di Limulus metodo Lysate (LAL) (< 0,25% EU/mL è stato considerato per indicare assenza di endotossina)⁵.
4. Risospendere le particelle in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 50 mg/mL come soluzione di riserva⁶.

2. costruzione del modello Calvarial osteolisi

1. Anestetizzare 6 settimane di età C57BL/J6 topi (sei topi per gruppo) withpentobarbital (50 mg/kg). Utilizzare il pinch test per valutare il livello di anestesia. Prevenire la secchezza degli occhi con normale soluzione salina.
2. Posto topi in posizione prona. Rimuovere la pelliccia sul cranio con un rasoio e disinfetti la pelle usando batuffoli di cotone medico contenente etanolo di 75%.
3. Per la localizzazione del punto, identificare due punti, inclusi i punti medi tra i due occhi e orecchie, rispettivamente. Quindi, determinare la linea tra i due punti e incise la pelle lungo la linea di cui sopra con le forbici (Figura 1A).
4. Rimuovere il periostio cranico dalla calvaria con un bisturi (Figura 1B)⁶.
5. Pelle di sutura a entrambe le estremità con semplice sutura interrotto.
6. Fare una linea di sutura nel mezzo dell'incisione senza annodatura. Tenere le due estremità della linea di sutura.
7. Incorporare 50 µ l di sospensione di particelle di CoCrMo (50 mg/mL, in PBS) nel mezzo del calvarias (Figura 1)².
8. Annodare l'ultimo punto all'interno di semplice sutura interrotto (Figura 1).
9. Mantenere topi per altre 2 settimane.

3. valutazione del modello di Osteolysis Calvarial scansionando Micro-CT

1. Sacrificare i topi con anidride carbonica. Decapitare i topi nel piano orizzontale. Rimuovere il tessuto cerebrale all'interno e la pelle e pelliccia all'esterno. Raccogliere il calvarias per ulteriori esperimenti.
2. Tutti i tessuti molli il calvaria delicatamente chiaro con le pinzette. Difficoltà il calvarias liquidati in paraformaldeide al 4% a 4 ° C per 24 h. Immergere il calvarias in PBS 24 h prima di micro-TAC.
3. Analizzare il calvarias di topi di micro-CT ad alta definizione a una risoluzione isometrica di 18 µm e le impostazioni di energia dei raggi x di 45 kV e 550 mA.
4. Condurre la ricostruzione tridimensionale di dati micro-CT con il software.
5. Analisi quantitativa e qualitativa.
   1. In primo luogo, selezionare l'area quadrata intorno la sutura mediana come la regione di interesse.
   2. In secondo luogo, misurare la densità minerale ossea (BMD), osso volume/totale volume (BV/TV), trabecular numero (Tb.N), spessore trabecolare (Tb.Th), trabecular separazione/spaziatura (Tb.Sp) e percentuale di porosità totale con il software fornito per micro-CT.
   3. In terzo luogo, confrontare i tre gruppi per varie misure di One-way ANOVA. Per post-hoc analisi della varianza, applicare il metodo di Bonferroni².

4. valutazione del modello di Osteolysis Calvarial macchiando di H & E

1. Decalcificare campioni di calvaria in 15% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)-PBS a 4 ° C. Cambiare la soluzione di decalcificazione ogni giorno per 3 settimane.
2. Incorporare i campioni decalcificati in paraffina per 2 cm x 1 cm x 1 cubo di cm e tagliateli a fettine in 2 sezioni di µm nella zona di deposizione delle particelle.
3. Macchia le sezioni con ematossilina ed eosina come precedentemente descritto⁷.
4. Catturare micrografie della pathomorphism complessiva da microscopia chiara.

Risultati

Le particelle di CoCrMo in-house prodotta su scala nanometrica erano circa 50 nm (errore standard di 3,56) di diametro, come quantificato dal TEM (Figura 2). Dopo l'esposizione del mouse calvarias a particelle di CoCrMo, gli animali (n = 6 per ogni gruppo) sono stati mantenuti per un altro due settimane. Entro le due settimane, l'incisione calvarial era completamente guarito e la sutura può cadere. Qualsiasi infezione locale o non sindacale può influire sul...

Discussione

Ci sono due metodi principali per usura osteolysis particella-indotto in topi: il modello aria-sacchetto e il modello di calvarial osteolisi. Nel modello aria-sacchetto, un sacchetto di aria generato per via sottocutanea è stabilito in primo luogo, seguito da introduzione delle particelle di usura e l'impianto nel tessuto osseo⁸. Il muro di sacchetto imita il periostio in allentamento asettico. Tuttavia, l'impianto osseo è non vascolare con nessuna attività biologica, che lo rende difficile val...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CoCrMo alloy from prosthesis	Waldemar Link GmbH & Co	GEMINI MK II	Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current	College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology		Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice	Model animal research center of Nanjing University	N000013
100% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691514023	Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W603
Microanalytical balance	Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD	EX125DZH
Ultrasonic shaker	Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD	YH-200DH	To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G20
SimplePCI software	Compix Inc.	6.6 version	To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan	QIULONGYIQI	KYQL-100DS	To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay	Charles River	R13025	To detect endotoxin
15 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Suyi Medical	B122
Phosphate-buffered saline	Boster Biological Technology	AR0030	Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium	Sigma	P3761	To anesthetize mice
Normal saline	SACKLER	SR8572EP-15	To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691560275	Disinfection
Medical cotton ball	Shuitao	1278298933	Disinfection
Shaver	Kemei	KM-3018	To shave the fur
Scissor	RWD LIFE SCIENCE	S12005-10	To incise skin
Suture	RWD LIFE SCIENCE	F34001-01	To suture skin
Needle holder	RWD LIFE SCIENCE	F33001-01	To suture skin
Needle	RWD LIFE SCIENCE	R14003-12	To suture skin
Vessel forceps	RWD LIFE SCIENCE	F22003-09	To suture skin
Scalpel	RWD LIFE SCIENCE	S31010-01	To harvest calvaria
Tweezers	RWD LIFE SCIENCE	F12006-10	To harvest calvaria
100 µL pipettes	Eppendorf	3120000240	To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips	AXYGEN	T-200-Y	To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W621
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Fixation
Micro Computed Tomography	SkyScan	SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid	Servicebio	G1105	Decalcification
Paraffin	Servicebio	#0001
Paraffin slicing machine	Leica	RM2125RTS
Glass slide	Servicebio	G6004
Cover glass	Servicebio	200
HE staining kit	Servicebio	#1-5	HE staining
Light microscope	Nikon	E200