Строительство и оценке модели мышиных подвздошную остеолиза под воздействием CoCrMo частиц в асептических рыхления

Резюме

Эта рукопись описывает модель мышиных подвздошную остеолиза под воздействием CoCrMo частицы, которая является идеальной животной модели для оценки взаимодействия частиц износа и различные клетки в асептических рыхления.

Аннотация

Износ частиц индуцированной остеолиза является основной причиной асептического рыхления артропластика провалом, но основной механизм остается неясным. Из-за давно прослеживаний необходимую для обнаружения и спорадических случаев это сложно оценить ofparticle индуцированной остеолиза патогенеза в клинических случаях. Таким образом оптимальная Животные модели необходимы для дальнейших исследований. Мышиных модель черепа остеолиза, создана под воздействием частиц CoCrMo является эффективным и действительным инструментом для оценки взаимодействия между частицами и различные клетки в асептических рыхления. В этой модели CoCrMo частицы были впервые получены высокого вакуума тремя электродами постоянного тока и высокомобильна в фосфат амортизированное saline в концентрации 50 мг/мл. Затем 50 мкл в результате приостановления был применен к середине мышиных Кальвария после разделения черепной надкостницы, острый рассечение. После двух недель мышей были принесены в жертву, и Кальвария образцы были собраны; качественные и количественные оценки были исполнены гематоксилином и эозином и Микро Компьютерная томография. Преимущества этой модели включают в себя простоту процедуры, количественная оценка потери костной массы, быстрота развития остеолиза, потенциального использования трансгенных или нокаут моделей, и относительно низкой стоимости. Однако эта модель не может использоваться для оценки механических сил и хронические эффекты частиц в асептических рыхления. Мышиных подвздошную остеолиза модель, созданная под воздействием частиц CoCrMo является идеальным инструментом для оценки взаимодействия между износ частиц и различные клетки, например, макрофаги, фибробласты, остеобластов и остеокласты, в асептических рыхления.

Введение

Разрыхление асептическое является наиболее распространенной причиной всего тазобедренного сустава (THA) и всего коленного сустава (ТКА) провал, который требует пересмотра хирургии¹. Однако основной механизм остается неясным². Длинные последующей деятельности требуется для обнаружения частиц индуцированной остеолиза, чье появление редко; Таким образом это сложно для изучения патогенеза в клинических случаях. Таким образом дальнейшие исследования, посвященные сложные механизмы клеточной и тканевой требуют как в естественных условиях экспериментов в носить модели частиц индуцированной остеолиза и в пробирке анализов в клетках, относящиеся к кости гомеостаза³. Действительный животных модель имеет важное значение в раскрытии эффекты частиц износа на потери костной массы, предоставления доказательств для дальнейшего сотовой анализов.

Мышиных подвздошную остеолиза модель построена под воздействием частиц CoCrMo это эффективный и действительный метод для оценки взаимодействия между частицами и различные клетки в асептических рыхления. В этой модели CoCrMo частицы вызывают подвздошную остеолиза, вызывая воспалительные cytokines в макрофагах, активация остеокластов, остеобластов распространения и поощрения остеобластов апоптоз.

Это займет всего две недели для создания этой модели. Остеолиза могут быть визуализированы и количественно гематоксилином и эозином (H & E) и Микро Компьютерная томография (микро CT)². Кроме того эта модель имеет сравнительно низкой стоимости и трансгенных и нокаут мыши, что модели могут использоваться для экран большое количество соединений в различных дозах³.

Процедура создания и оценивать эту модель очень проста. Во-первых CoCrMo частицы были получены высокого вакуума тремя электродами постоянного тока и высокомобильна в фосфат амортизированное saline (PBS) в концентрации 50 мг/мл. Затем 50 мкл в результате приостановления был применен к середине мышиных Кальвария после разделения черепной надкостницы, острый рассечение. Мышей были принесены в жертву после двух недель, и Кальвария образцы были собраны; качественный и количественный анализы на H & E пятнать andmicro-CT.

Мышиных подвздошную остеолиза модель построена под воздействием частиц CoCrMo является идеальным инструментом для оценки взаимодействия между CoCrMo частиц и различные клетки, макрофаги, фибробласты, остеобластов и остеокласты, в асептических ослабление.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Нанкин.

1. CoCrMo частиц подготовка

1. Получите CoCrMo частицы, используя сфабрикованные высокого вакуума тремя электродами постоянного тока⁴. Место CoCrMo сплава в обсуждаемый документ 10^-3 ПА вакуум, 0,04 МПа аргона и водорода 3:2 (v/v) и 650 A катод текущей.
2. Измерьте диаметры CoCrMo частиц.
   1. Добавьте 1 мг CoCrMo частиц в 1,5 мл безводного этилового спирта.
   2. Ресуспензируйте CoCrMo частиц в безводном этаноле ультразвуковой встряхивания на 28 кГц и 600 Вт на 5 мин.
   3. Нанесите одну каплю (около 20 мкл) результирующий подвески на объективную таблицу просвечивающий электронный микроскоп (ТЕА). Захват серии фотографий ТЕА на 200 кв ускорение напряжения и 0.24 резолюции Нм.
   4. Используйте предоставленное программное обеспечение для расчета среднего диаметра и размер распределение частиц в ТЕА микроскопии.
3. Обеззараживанию эндотоксины
   1. Автоклав 50 g частиц для 15 мин при температуре 121 ° C и 15 psi.
   2. Обнаружения эндотоксинов, количественного анализа Limulus Lysate амебоцит (Лал) (< 0,25%, чтобы указать отсутствие эндотоксинов считался ЕС/мл)⁵.
4. Ресуспензируйте частицы в фосфат амортизированное saline (PBS) в концентрации 50 мг/мл как Стоковый раствор⁶.

2. Построение модели подвздошную остеолиза

1. Анестезировать 6 неделя старый C57BL/J6 мышей (шесть мышей на группу) withpentobarbital (50 мг/кг). Используйте Пинч тест для оценки уровня анестезии. Предотвращения высыхания глаз с нормальное saline.
2. Место мыши в лежачем положении. Удаление мех на череп с бритвы и дезинфекции кожи с помощью медицинских ватные шарики, содержащего 75% этанола.
3. Для локализации точки определите две точки, включая среднее положение между двумя глазами и ушами, соответственно. Затем определите линии между двумя выше пунктов и надрезать кожу вдоль линии выше с ножницами (рис. 1A).
4. Удалите головы надкостницы из Кальвария с скальпель (рис. 1B)⁶.
5. Шовный материал кожи на обоих концах с простой Прерванный швом.
6. Сделать линию шва через середины разреза без завязывать. Держите два концы линии швов.
7. Внедрить 50 мкл CoCrMo частиц суспензии (50 мг/мл, в PBS) в середине глядя (рис. 1 c)².
8. Узел последний стежок в простой Прерванный шов (рис. 1 d).
9. Сохранить мыши еще 2 недели.

3. Оценка модели подвздошную остеолиза микро КТ сканирование

1. Пожертвуйте мышей с двуокиси углерода. Обезглавить мышей в горизонтальной плоскости. Удаление ткани мозга внутри и кожу и мех снаружи. Урожай глядя для дальнейших экспериментов.
2. Аккуратно очистите всех мягких тканей на Кальвария с помощью пинцета. Исправьте очищается глядя в параформальдегида 4% при температуре 4 ° C для 24 h. погрузиться глядя в PBS 24 h до микро КТ.
3. Анализировать глядя мышей с высоким разрешением микро CT в изометрии резолюции 18 мкм и параметры энергии рентгеновского 45 кв и 550 мА.
4. Проведения трехмерной реконструкции микро КТ данных с программным обеспечением.
5. Качественный и количественный анализ.
   1. Во-первых выберите квадратный регион вокруг средней линии шва как области интереса.
   2. Во-вторых, измерить минеральной плотности костной ткани (BMD), кость объем/общий объем (BV/TV), Трабекулярная номер (Tb.N), Трабекулярная толщина (Tb.Th), Трабекулярная разделения в интервал (Tb.Sp) и процент общей пористости с помощью предоставленного программного обеспечения для микро CT.
   3. В-третьих Сравните три группы для различных измерений, односторонний дисперсионный анализ. Для post hoc дисперсионный анализ применять метод Бонферрони².

4. Оценка подвздошную остеолиза модели на H & E пятнать

1. Известь Кальвария образцов в 15% этилена диамин tetraacetic кислоты (ЭДТА)-PBS при 4 ° C. Измените решение декальцинации каждый день в течение 3 недель.
2. Внедрить decalcified образцы в парафин для 2 см x 1 см x 1 см куб и нарезать их на 2 мкм секции в области осаждения частиц.
3. Пятно секции с гематоксилином и эозином как описано⁷.
4. Захватить микроскопии общего pathomorphism, световой микроскопии.

Результаты

Собственного производства наноразмерных частиц CoCrMo были около 50 Нм (стандартная ошибка 3.56) в диаметре, как количественно ТЕА (рис. 2). После заражения мыши глядя CoCrMo частиц, животных (n = 6 для каждой группы) были сохранены еще две недели. В течение двух неде...

Обсуждение

Существует два основных метода для износа частиц индуцированной остеолиза у мышей: воздух мешочек модель и модель черепа остеолиза. В модели воздуха мешочек сначала устанавливается подкожно сгенерированный воздуха мешочек, следуют введение частиц износа и имплантации в костной ткан?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CoCrMo alloy from prosthesis	Waldemar Link GmbH & Co	GEMINI MK II	Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current	College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology		Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice	Model animal research center of Nanjing University	N000013
100% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691514023	Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W603
Microanalytical balance	Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD	EX125DZH
Ultrasonic shaker	Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD	YH-200DH	To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G20
SimplePCI software	Compix Inc.	6.6 version	To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan	QIULONGYIQI	KYQL-100DS	To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay	Charles River	R13025	To detect endotoxin
15 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Suyi Medical	B122
Phosphate-buffered saline	Boster Biological Technology	AR0030	Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium	Sigma	P3761	To anesthetize mice
Normal saline	SACKLER	SR8572EP-15	To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691560275	Disinfection
Medical cotton ball	Shuitao	1278298933	Disinfection
Shaver	Kemei	KM-3018	To shave the fur
Scissor	RWD LIFE SCIENCE	S12005-10	To incise skin
Suture	RWD LIFE SCIENCE	F34001-01	To suture skin
Needle holder	RWD LIFE SCIENCE	F33001-01	To suture skin
Needle	RWD LIFE SCIENCE	R14003-12	To suture skin
Vessel forceps	RWD LIFE SCIENCE	F22003-09	To suture skin
Scalpel	RWD LIFE SCIENCE	S31010-01	To harvest calvaria
Tweezers	RWD LIFE SCIENCE	F12006-10	To harvest calvaria
100 µL pipettes	Eppendorf	3120000240	To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips	AXYGEN	T-200-Y	To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W621
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Fixation
Micro Computed Tomography	SkyScan	SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid	Servicebio	G1105	Decalcification
Paraffin	Servicebio	#0001
Paraffin slicing machine	Leica	RM2125RTS
Glass slide	Servicebio	G6004
Cover glass	Servicebio	200
HE staining kit	Servicebio	#1-5	HE staining
Light microscope	Nikon	E200