건설 및 무 균 완화에 CoCrMo 입자에 노출에 의해 Calvarial Osteolysis Murine 모델의 평가

요약

이 원고는 마모 입자 및 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 동물 모델을 구성 하는 CoCrMo 입자에 노출에 의해 calvarial osteolysis murine 모델을 설명 합니다.

초록

마모 입자 유도 osteolysis 관절 교체 실패, 무 균 완화의 주요 원인 이지만 기본 메커니즘 불분명 남아. 검색 및 산발적 발생에 필요한 긴 후속 인 그것 병 인 ofparticle 유도 osteolysis 임상의 경우에서 평가 하기 위해 도전적 이다. 따라서, 최적의 동물 모델은 추가 연구 필요. CoCrMo 입자에 노출에 의해 설립 calvarial osteolysis murine 모델은 입자와 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 효과적이 고 유효한 도구. 이 모델에서 CoCrMo 입자 처음 높은 진공 3 전극 직류 여 되었고 50 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 분에 resuspended. 다음, 후 분리 하 여 두개골과 날카로운 해 부 결과 서 스 펜 션의 50 µ L murine calvaria의 중간에 적용 되었습니다. 2 주 후, 생쥐 희생 했다, 및 calvaria 표본 수확 했다; 질적 및 양적 평가 되며 고 오신 얼룩 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 수행 되었습니다. 이 모델의 장점 절차 단순, 뼈 손실의 양적 평가, osteolysis 개발, 잠재적인 사용 유전자 변형 또는 녹아웃 모델, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용의 속도 포함 한다. 그러나,이 모델은 기계적인 힘 및 입자 무 균 완화의 만성 효과 평가 하는 데 사용할 수 없습니다. Calvarial osteolysis murine 모델 CoCrMo 입자에 노출에 의해 생성 된 마모 입자 및 다양 한 셀, 예를 들면, 대 식 세포, 섬유 아 세포, osteoblasts 및 osteoclasts, 무 균 완화에 사이 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 도구입니다.

서문

가장 일반적인 원인은 이다 무 균을 풀면 총 엉덩이 관절 (THA) 교체 및 총 무릎 관절 (TKA) 교체 실패의 개정 수술¹필요. 그러나, 기본 메커니즘 불분명²남아 있습니다. 긴 후속 입자 유도 osteolysis, 그 발생은 드문; 검색 하는 데 필요한 따라서, 그것은 임상의 경우에서 자사의 pathogenesis 탐험 도전 이다. 따라서, 복잡 한 세포와 조직 메커니즘에 초점을 맞추고 더 연구에 실험 비보에 모두 착용 입자 유도 osteolysis 모델 및 분석 실험 체 외에 세포 항상성³뼈에 관련 된 필요 합니다. 유효한 동물 모델 더 세포질 분석 실험에 대 한 증거를 제공 하는 뼈 손실에 마모 입자의 효과 드러내는에서 중요 하다.

CoCrMo 입자에 노출에 의해 건설 murine calvarial osteolysis 모델 입자와 무 균 완화에 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 효과적이 고 유효한 방법입니다. 이 모델에서 CoCrMo 입자 발생할 calvarial osteolysis 유도 하는 대 식 세포에서 염증 성 cytokines, osteoclasts 활성화, osteoblast 확산 억제 및 osteoblast apoptosis를 홍보.

그것은이 모델을 설정 하려면 2 주 걸립니다. Osteolysis 수 수 시각 hematoxylin와 오신 (H & E) 얼룩 계량 및 마이크로 계산 된 단층 촬영 (마이크로 CT)². 또한,이 모델은 상대적으로 저렴 한 비용, 그리고 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 모델 다양 한 복용량³화합물의 많은 화면을 사용할 수 있습니다.

설정 하 고이 모델을 평가 절차는 간단 합니다. 첫째, CoCrMo 입자 높은 진공 3 전극 직류 여 되었고 50 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에서 resuspended. 다음, 후 분리 하 여 두개골과 날카로운 해 부 결과 서 스 펜 션의 50 µ L murine calvaria의 중간에 적용 되었습니다. 쥐 2 주 후, 희생 했다 및 calvaria 샘플 수확 했다; 질적 및 양적 분석 H & E andmicro-코네티컷 얼룩에 의해 수행 되었다

CoCrMo 입자에 노출에 의해 건설 murine calvarial osteolysis 모델 CoCrMo 입자와 대 식 세포, 섬유 아 세포, osteoblasts, osteoclasts에 무 균 완화 등 다양 한 세포 간의 상호 작용을 평가 하기 위한 이상적인 도구입니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 난징 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. CoCrMo 입자 준비

1. 조작된 높은 진공 3 전극 직류⁴를 사용 하 여 CoCrMo 입자를 얻을. 10^-3 Pa 진공, 0.04 MPa 아르곤 및 수소 3:2 (v/v), 악기에서 장소 CoCrMo 합금 그리고 현재 650 A 음극 선.
2. CoCrMo 입자의 직경을 측정 합니다.
   1. 무수 에탄올의 1.5 mL에 CoCrMo 입자의 1 밀리 그램을 추가 합니다.
   2. 무수 에탄올에 초음파 진동 28 kHz, 600 W 5 분에 의해 CoCrMo 입자를 resuspend.
   3. 전송 전자 현미경 (TEM)의 객관적인 테이블에 결과 현 탁 액의 한 방울 (약 20 µ L)를 적용 합니다. 200 kV 가속 전압 및 0.24 nm 해상도에 가장 사진 시리즈를 캡처하십시오.
   4. TEM 현미경 사진에서 평균 직경 및 입자 크기 분포를 계산 하기 위해 제공 된 소프트웨어를 사용 합니다.
3. 오염을 부유
   1. 고압 121 ° C와 15 psi에서 15 분 동안 입자의 50 g.
   2. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 분석 결과 양적으로 독 검색 (< 0.25 %EU / mL 내 부재를 나타내기 위해 여겨졌다)⁵.
4. 재고 솔루션⁶50 mg/mL의 농도에서 인산 염 버퍼 염 (PBS)에 입자를 resuspend.

2입니다. Calvarial Osteolysis 모델의 건설

1. 6 주 된 C57BL/J6 쥐 (그룹 당 6 쥐) withpentobarbital (50 mg/kg) anesthetize 핀치 테스트를 사용 하 여 마 취의 수준을 평가 하기 위해. 일반적인 염 분으로 눈의 건조를 방지 합니다.
2. 경향이 위치에서 마우스를 놓습니다. 두개골에 모피는 면도기로 제거 하 고 75%의 에탄올을 포함 하는 의료 면봉을 사용 하 여 피부를 소독.
3. 포인트 지역화, 각각 두 눈과 귀 사이의 중간점을 포함 하 여 2 포인트를 식별 합니다. 다음, 포인트, 위의 두 사이의 라인을 확인 하 고가 위 (그림 1A)와 위의 라인을 따라 피부를 incise.
4. 메스 (그림 1B)⁶calvaria에서 두개골과 제거 합니다.
5. 간단한 중단된 봉합으로 양쪽 끝에 봉합 피부.
6. 노팅 없이 절 개의 중간을 통해 봉합 라인을 확인 합니다. 봉합 선의 두 끝을 잡으십시오.
7. Calvarias (그림 1C)²의 한가운데에 CoCrMo 입자 현 탁 액 (PBS에 50 mg/mL)의 50 µ L를 포함 합니다.
8. 간단한 중단된 봉합 (그림 1D) 내 마지막 스티치 매듭
9. 또 다른 2 주 동안 마우스를 유지.

3. 마이크로-CT 스캔 하 여 Calvarial Osteolysis 모델의 평가

1. 이산화탄소와 쥐를 희생. 수평 평면에 쥐 목을 벨. 뇌 조직 내부, 그리고 피부를 제거 하 고 밖에 서 모피. 추가 실험을 위한 calvarias을 수확.
2. 부드럽게 핀셋으로는 calvaria에 모든 연 조직 정리. 마이크로-CT 검사 전에 PBS 24 h calvarias 24 h. 담가 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 지운된 calvarias을 수정.
3. 마우스 calvarias 18 µ m의 아이소메트릭 해상도 및 45의 x 선 에너지 설정에서 고해상도 마이크로-CT 분석 kV 및 550 mA.
4. 소프트웨어와 마이크로-CT 데이터의 3 차원 재구성을 수행 합니다.
5. 정성 및 정량 분석입니다.
   1. 먼저, 관심의 영역으로 중간 봉합 사 주위의 사각형 영역을 선택 합니다.
   2. 둘째, 뼈 미네랄 밀도 (BMD)를 측정, 볼륨/총 뼈 볼륨 (BV/TV), 배수 수 (Tb.N), 배수 두께 (Tb.Th), 배수 분리/간격 (Tb.Sp), 그리고 마이크로-코네티컷에 대 한 제공 된 소프트웨어와 함께 총 다공성의 비율
   3. 셋째, 일방통행 ANOVA에 의해 다양 한 측정을 위한 3 개 그룹을 비교할 수 있습니다. 포스트 hoc 분산 분석 적용 Bonferroni 방법².

4. Calvarial Osteolysis 모델 H & E 염색 법의 평가

1. 15% 에틸렌 diamine tetraacetic 산 (EDTA) calvaria 샘플을 알려줍니다-4 ° c.에서 PBS 3 주 동안 매일 decalcification 솔루션을 변경 합니다.
2. 2 cm x 1 cm x 1 cm 큐브, 파라핀에 석된 샘플을 포함 하 고 입자 증 착의 영역에서 2 µ m 섹션으로 그들을 슬라이스.
3. 되며 섹션 얼룩 하 고 오신 앞⁷에서 설명한.
4. 가벼운 현미경 검사 법에 의해 전체 pathomorphism의 현미경을 캡처하십시오.

결과

사내 생산된 nanoscale CoCrMo 입자 했다 약 50 nm (3.56의 표준 오차) 직경, 가장 (그림 2)에 의해 정량으로. 마우스 calvarias의 CoCrMo 입자, 동물에 노출 된 후 (n = 그룹 당 6) 또 다른 2 주 동안 유지 되었다. 2 주 이내에 calvarial 절 개는 완전 하 게 치유 하 고 봉합 떨어질 수 있습니다. 모든 로컬 감염 또는 뼈 손실 평가 영향을 없앤 5 월. 마우스 희생 후 calvaria 샘?...

토론

마모 입자 유도 osteolysis 쥐에 대 한 두 가지 주요 방법이 있다: 공기 주머니 모델과 calvarial osteolysis 모델. 공기 주머니 모델에서 피하 생성 된 공기 주머니는 처음 설립, 마모 입자 소개 및 이식 뼈 조직⁸에 이어서. 주머니 벽 무 균 완화에 모방합니다. 그러나, 뼈 이식이 이다 nonvascular 생물 학적 활동 없이, 입자와 뼈 조직 간의 직접적인 상호 작용을 평가 하기 어렵습니다. Calvarial o...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CoCrMo alloy from prosthesis	Waldemar Link GmbH & Co	GEMINI MK II	Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current	College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology		Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice	Model animal research center of Nanjing University	N000013
100% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691514023	Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W603
Microanalytical balance	Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD	EX125DZH
Ultrasonic shaker	Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD	YH-200DH	To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G20
SimplePCI software	Compix Inc.	6.6 version	To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan	QIULONGYIQI	KYQL-100DS	To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay	Charles River	R13025	To detect endotoxin
15 ml Microcentrifuge tubes	Taizhou Suyi Medical	B122
Phosphate-buffered saline	Boster Biological Technology	AR0030	Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium	Sigma	P3761	To anesthetize mice
Normal saline	SACKLER	SR8572EP-15	To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol	Nanjing Reagent	C0691560275	Disinfection
Medical cotton ball	Shuitao	1278298933	Disinfection
Shaver	Kemei	KM-3018	To shave the fur
Scissor	RWD LIFE SCIENCE	S12005-10	To incise skin
Suture	RWD LIFE SCIENCE	F34001-01	To suture skin
Needle holder	RWD LIFE SCIENCE	F33001-01	To suture skin
Needle	RWD LIFE SCIENCE	R14003-12	To suture skin
Vessel forceps	RWD LIFE SCIENCE	F22003-09	To suture skin
Scalpel	RWD LIFE SCIENCE	S31010-01	To harvest calvaria
Tweezers	RWD LIFE SCIENCE	F12006-10	To harvest calvaria
100 µL pipettes	Eppendorf	3120000240	To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips	AXYGEN	T-200-Y	To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes	Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD	W621
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101	Fixation
Micro Computed Tomography	SkyScan	SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid	Servicebio	G1105	Decalcification
Paraffin	Servicebio	#0001
Paraffin slicing machine	Leica	RM2125RTS
Glass slide	Servicebio	G6004
Cover glass	Servicebio	200
HE staining kit	Servicebio	#1-5	HE staining
Light microscope	Nikon	E200