Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra

Resumen

Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

Resumen

Pez cebra han emergido como un poderoso modelo de varias enfermedades humanas y una herramienta útil para una gama cada vez mayor de estudios experimentales, que abarca la biología del desarrollo fundamental a través de las pantallas genéticas y químicas a gran escala. Sin embargo, muchos experimentos, especialmente los relacionados con infección y modelos de xenoinjerto, dependen de la microinyección y la proyección de imagen de los embriones y larvas, que son técnicas laboriosas que requieren habilidades y conocimientos. Para mejorar la precisión y el rendimiento de las técnicas de microinyección actuales, hemos desarrollado una serie de dispositivos microestructuradas para orientar y estabilizar embriones de pez cebra en 2 días post fertilización (dpf) en posición ventral, dorsal o lateral antes del procedimiento. Para ayudar en la proyección de imagen de los embriones, también hemos diseñado un dispositivo simple con los canales que Oriente 4 pez cebra lateralmente en paralelo contra un cubreobjetos de vidrio. Juntos, las herramientas que presentamos aquí demuestran la efectividad de enfoques photolithographic generar dispositivos útiles para la optimización de las técnicas de pez cebra.

Introducción

Pez cebra se han convertido en un poderoso modelo para muchos campos, de los estudios de desarrollo biología fundamental a escala genética y química pantallas^1,2. Rutina manipulaciones genéticas, como la sobreexpresión del gen, caída, CRISPR/Cas9 mutagénesis y transgénesis dependen de microinyección de material genético en el zigoto unicelular, que ha llevado al desarrollo de simple, fácil de usar, comercialmente herramientas disponibles para orientar y estabilizar huevos para inyección³. Otros enfoques, como el trasplante y la infección, a menudo requieren microinyección en la posterior etapa embriones y larvas con mayor calibre capilar agujas⁴. Sin embargo, el uso de agujas de calibre más grandes presenta importantes retos técnicos, ya que es más difícil penetrar el tejido sin empujar o rodando el embrión. En estas condiciones, obteniendo la tensión de agua apropiada requerida para estabilizar el embrión mientras que evitar durante el procedimiento de secado es difícil y embriones no sean idealmente orientado para la inyección en el tejido diana.

Tras la microinyección, es a menudo útil embriones inyectados para seleccionar aquellos que han sido inyectados con éxito y para capturar imágenes del momento inicial de la pantalla. Para enfrentar estos desafíos, hemos desarrollado una gama de dispositivos microestructuradas que ayudan a estabilizar 2 embriones de dpf en varias orientaciones para microinyección⁵y para después de la inyección rápida proyección basada en imágenes.

Para obtener suficiente resolución estructural en estos dispositivos, utilizamos técnicas photolithographic. Se utilizan en las industrias microelectrónicas y más recientemente extrapolarse para la fabricación de microfluidos, estos enfoques pueden alcanzar estructuras verticales que van desde 1-1.000 μm, con una escala adecuada para manipulación de larvas y embriones de pez cebra. Todos los dispositivos fueron fabricados con polidimetilsiloxano (PDMS), que es barato, robusto físicamente, biológicamente inerte y transparente.

Arreglos de superficie microestructuradas (MSAs) fueron el formato de bloques de PDMS con una superficie modelada, análogo a los canales simple en bloques de agarosa utilizadas para microinyección de huevos. Para la investigación después de la inyección, 6 dispositivos de imágenes puede ser vestida en una placa de 6 pozos con fondo de cristal estándar. Estos dispositivos están diseñados para facilitar la carga de los embriones, mientras que el procedimiento de descarga convenientemente permite rescate de embriones específicos, facilitando imágenes evaluación enfoques de una manera más fácil de utilizar que los dispositivos desarrollado previamente por el Beebe laboratorio⁶.

Protocolo

Microinyección de larvas fue aprobado por la Subcomisión de Hospital General de Massachusetts en investigación Animal cuidado bajo protocolo 2011N000127.

1. fabricación de dispositivo

Nota: Todos asistida por ordenador (CAD) archivos para diseñar máscaras de fotolitografía aquí descritos (figura 1) están disponibles para su descarga. Véase tabla de materiales para los enlaces.

1. Fabricación de la oblea del molde principal en una sala limpia de clase 1.000 utilizando técnicas photolithographic estándar⁷. De los canales y arreglos de discos de microestructura, patrón el photoresist negativo epoxy-basado secuencialmente en 3 capas con 3 máscaras separadas, según las instrucciones del fabricante: 100 μm para las características superficiales, 200 μm para las características de medio y 400 μm para las características profundas. Para el dispositivo de proyección de imagen, patrón de dos capas con 400 μm para las características superficiales y 600 μm para las características de profundidad.
2. La oblea completa a la base de una placa de Petri para el bastidor (figura 2) de 15 cm de cinta.

2. preparación de matrices superficie microestructuradas - PDMS

1. Para hacer que los dispositivos utilizables, la fundición de polidimetilsiloxano (PDMS), mediante la oblea del maestro como un molde. 50 g de monómero PDMS se combinan con 5 g de iniciador y homogeneizar en un plato de pesaje con un tenedor de plástico de plástico.
2. Vierte cuidadosamente la mezcla sobre el molde.
3. Degas en un desecador de vacío en 16-25 inHg (54-85 kPa) durante 1 hora.
4. Para curar el PDMS, cuece al horno a 65 ° C durante al menos 3 horas. El PDMS debe curar a un sólido firme pero flexible.
5. Corte con cuidado alrededor del dispositivo en la oblea del maestro con un bisturí, asegurándose de mantener contacto entre la punta del bisturí y la superficie de la oblea. Con unas pinzas, quite la réplica PDMS de la oblea y la transferencia a un limpio 10 cm plato de Petri, lado de la característica (figura 3).
6. Tratar el dispositivo con plasma de oxígeno usando un horno de plasma de 35 s para reducir la hidrofobicidad.
7. Cubrir con medio de embrión de pez cebra (E3) que contiene 168 mg/L de metanosulfonato de etilo 3-aminobenoate (MS-222, pH 7.5). Quite las burbujas de las características más por las corrientes de agua sobre la superficie del dispositivo usando una pipeta de transferencia.

3. preparación de matrices superficie microestructuradas - agarosa

1. Para hacer un molde negativo de PDMS, tratar en primer lugar un dispositivo PDMS con plasma de oxígeno.
2. Tratar el dispositivo PDMS con 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) vapor de silano para crear una superficie inerte⁸. Brevemente:
   1. Lugar el PDMS ser tratada característica hacia arriba en una cámara de vacío en una campana de humos.
   2. Al lado de los PDMS, coloque un pequeño recipiente de vidrio o aluminio abierto y cuidadosamente pipetee 200 μL de PFDTS (silano 98%) en el plato.
      PRECAUCIÓN: PFDTS silano es altamente volátil, reacciona violentamente con el agua, es inflamable y causa daño severo de la piel y los ojos al contacto. Leer MSDS en detalle antes de su uso.
   3. Cierre la cámara de vacío y aplique vacío durante 15-30 minutos, o hasta que el silano PFDTS se evapora completamente.
3. Coloque el dispositivo en una caja Petri y utilizar como molde para PDMS fresco, preparado como se describe en el paso 2.1-2.3.
4. Cueza al horno a 65 ° C durante al menos 3 h, luego pelar toda la capa de PDMS fresca desde el dispositivo de tratamiento y en un fresco plato de Petri. Esto puede entonces usarse como molde negativo a agarosa.
5. Para preparar la agarosa, hervir una solución de 2% de baja agarosa temperatura gelificación en E3 en el microondas hasta que la agarosa se disuelva completamente.
6. Verter la agarosa caliente sobre el molde negativo de PDMS y eliminar las posibles burbujas en la agarosa cubriendo el dispositivo por agarosa caliente que fluye sobre las características con una pipeta de transferencia.
7. Una vez que las burbujas se quitan, refrigerar a 4 ° C para establecer la agarosa.
8. Desmoldar el bloque de agarosa negativo PDMS deformando el PDMS de debajo con la mano, transferir el bloque de agarosa a una nueva placa de Petri y mojado con E3 con MS-222.

4. elaboración de PDMS dispositivos de imágenes

1. Para hacer que los dispositivos utilizables, la fundición de PDMS, uso de la oblea del maestro como un molde. 50 g de monómero PDMS se combinan con 5 g de iniciador (el mismo que utilizan en el paso 2.1) y mezclar cuidadosamente en un plástico plato de pesaje con un tenedor de plástico.
2. Vierte cuidadosamente la mezcla sobre el molde.
3. Degas en un desecador de vacío en 16-25 inHg (54-85 kPa) durante 1 hora.
4. Para curar el PDMS, cuece al horno a 65 ° C durante al menos 3 horas. El PDMS debe curar a un sólido firme pero flexible.
5. Cortar los dispositivos de la oblea del maestro y perfore puertos mediante un golpe de 1,5 mm.
6. Tratar los dispositivos y un fondo de cristal 6-bien bien la placa con plasma de oxígeno para 35 s, como se describe en el paso 2.6.
7. Enlazar un dispositivo característica hacia abajo a cada cubreobjetos de cristal de la placa de la pozo 6 colocando sobre una placa de 85 ° C durante 10 minutos.
   Nota: Para confirmar la vinculación exitosa, aplique una presión firme al lado del servidumbre dispositivo usando fórceps. El dispositivo debe permanecer pegado al vidrio cubreobjetos.

5. pez cebra cultura

1. Embriones de pez cebra de cultura para 2 PD utilizando técnicas estándar³.
2. Dechorionate embriones utilizando fórceps o 1 mg/mL de proteasa la mezcla (ver la tabla de materiales)³ por lo menos 30-60 minutos antes de cargar en el dispositivo, para que puedan enderezar.
3. Anestesie embriones con solución stock (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5), añadir 1 mL de 25 X a la E3 en su placa de Petri.

6. orientación del pez cebra en superficie microestructurada - arreglos de discos de hierba

1. Preparar el bloque PDMS de paso 2.7 (Figura 3A) en su placa de Petri que está cubierto por una capa delgada (1-2 mm) de E3, que permite la fácil manipulación de los embriones.
2. Transferencia número de embriones (generalmente 10-20 por condición) sobre la superficie del bloque PDMS con una pipeta de transferencia.
3. Utilizando una herramienta de micromanipulación (lazo del pelo o similar), introduzca los embriones de los divots microestructuradas (Figura 3A). Uso de chuletas es particularmente adecuada a las orientaciones de la dorsales y ventrales.
   Nota: Para las chuletas con un mayor ajuste (dorsal y ventral), trate de colocar los embriones en la superficie del bloque en paralelo a la hierba y luego los balanceo en posición usando un lazo del pelo. Empujándolos más profundos en la hierba ayudará a mantenerlos estables.

7. orientación del pez cebra en superficie microestructurada - canales microestructurados

1. Extraer el bloque PDMS estampado con microestructurada canales (figura 3B) utilizando una pipeta de transferencia hasta el nivel de E3 cae por debajo del borde del bloque, pero aún está presente en el embalse y canales y en una capa delgada en el PDMS a E3.
2. Transferencia 10 embriones de paso 5.3 en el depósito usando una pipeta de transferencia, teniendo cuidado de no desbordar los bordes.
3. Usando un lazo del pelo, manipular cada embrión en el embudo a la entrada de la canal y orientar de tal manera que la cabeza del embrión es hacia el canal y el embrión tiene la orientación adecuada al entrar en el canal.
4. Deslice cada embrión por el canal usando un lazo del pelo hasta llegar a la orientación microfeatures en las paredes del canal que ayudan a mantener en su lugar. Particularmente se recomienda el uso de canales microestructurados para la orientación lateral.
   Nota: Para reducir el deslizamiento durante la microinyección de embriones, trate de ajustar la cantidad de tensión superficial dibujando E3 del depósito.

8. microinyección del pez cebra

1. Preparar la aguja de la microinyección.
   1. Hacer el vidrio de borosilicate microcapillary agujas usando un extractor de micropipeta como se describió anteriormente⁴. Las agujas resultantes deben ser afiladas a un punto en un extremo, con una forma cónica longitud de aproximadamente 10 mm.
   2. Preparar la solución que se inyecta, en este caso 100 nM chemoattractant (N-formilmetionina-leucina-fenilalanina (fMLP) o leucotrieno B4 (LTB4)) y 100 nM de 70 kDa trazador de dextrano de rodamina en PBS.
   3. 5 μl de solución de carga dentro de la aguja con una pipeta fina afilada punta (véase tabla de materiales).
   4. Monte la aguja en un micromanipulador montados en un soporte magnético y conectado a una microinyectora picopump.
2. Romper la punta de la aguja a un ángulo de 45 ° por pellizcar la punta cónica con fórceps.
3. Ajustar tamaño de bolo de inyección 1 nL ajustando el tiempo de inyección en el controlador picopump.
4. Ajuste el ángulo de la aguja de la microinyección. Un ángulo de la aguja de 45 ° en el controlador de micromanipulación es generalmente un buen punto de partida, con la aguja paralela a la longitud del embrión. Un ángulo más escarpado puede utilizarse para minimizar el movimiento lateral del embrión durante la microinyección.
5. Control de la placa de Petri con la mano izquierda y el micromanipulador de aguja con la derecha, llevar la aguja lo más cerca posible al sitio previsto de la microinyección, en este caso la vesícula ótica.
   Nota: La vesícula ótica puede ser identificada como el órgano oblongo posterior a la vista que contiene dos más pequeñas oscuras oblongas estructuras distintas (otolitos).
6. Utilizar el controlador de micromanipulación, penetrar en el tejido objetivo (en este caso la vesícula ótica) tal que la punta de la aguja está dentro de la vesícula e inyectar el volumen preestablecido mediante el pedal de picopump.
   Nota: Si el tejido resiste la penetración, prueba golpeando suavemente la perilla del regulador de micromanipulación.
7. Para liberar los embriones, flujo E3 sobre la superficie de arriba hacia abajo utilizando una pipeta de transferencia, o agitando el plato que los embriones se liberan en el E3 circundante.
8. Transfiera los embriones a un plato de recuperación del E3 sin MS-222 con una pipeta de transferencia.

9. cribado de embriones utilizando el dispositivo de la proyección de imagen de PDMS

1. Preparar el dispositivo de paso 4.7 flujo E3 (+ MS-222) a través del puerto. Esto puede hacerse utilizando una pipeta de 1000 μl o una pipeta de punta estrecha.
2. Llenar el pozo con E3 + MS-222 hasta el aparato.
3. Entregar 4 embriones inyectados de paso 8.7 en cada pocillo con una pipeta de transferencia. Embriones se puede previamente anestesiados si desean incubar en E3 + MS-222 1-2 min antes de la carga (paso 5.3).
4. Utilizando una herramienta de micromanipulación (lazo del pelo o similar), acomode los embriones en las entradas de los canales de proyección de imagen en la orientación deseada (primero de cola o cefálico, dependiendo del dispositivo utilizado) y empujar parcialmente en el dispositivo (Figura 4A). Esto le ayudará a dibujar en el dispositivo de manera uniforme.
5. Dibujar E3 a través del dispositivo desde el puerto con una pipeta o pipeta μL 1.000 hasta que los embriones son introducidos a los canales en la orientación correcta para la proyección de imagen (Figura 4B).
   Nota: Tenga cuidado de no aspirar los embriones más allá del punto de captura, esto dañará los embriones y cambiar su orientación.
6. Transferir la placa de la pozo al microscopio para la proyección de imagen (figura 4).
7. Imagen con un microscopio fluorescente invertido.
   1. Ajustar magnificación seleccionando la lente adecuada. 10 X es generalmente un aumento útil para migración neutrófilo pez cebra la proyección de imagen.
   2. Ajuste intensidad fuente de luz y tiempo de exposición para cada canal de modo que cada señal es clara, pero no saturado.
   3. Captura de imágenes para cada canal. Aquí, se utilizaron proteína verde fluorescente (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), rojo de Texas (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) y canales de transmisión. Imágenes multicanales pueden combinarse durante el procesamiento posterior (Figura 4B-I).

Resultados

El enfoque descrito aquí muestra el diseño (figura 1) y la fabricación de dispositivos para el uso con 2 pez cebra de la PD, utilizando técnicas de (figura 3) litografía suave y photolithographic (figura 2). Este método permite la prueba rápida de muchas iteraciones de diseño y las modificaciones y alteraciones y optimización de dimensiones microestructura para uso con el pez cebra en otras ...

Discusión

Aquí, describimos el uso de los dispositivos recientemente desarrollado para facilitar 2 PD pez cebra microinyección⁵e introducir un dispositivo de montaje libre de agarosa simple imagen conveniente de embriones. Estas herramientas destacan la utilidad de técnicas photolithographic para la fabricación de dispositivos útiles para técnicas de pez cebra.

Hemos encontrado dispositivos MSA particularmente útil para la inyección de células o partículas tienden a la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184  Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose	Sigma Aldrich	A9414-10G	For casting agarose devices
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	To anesthetize  zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish	Fisher scientific	08-757-148	For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates	MatTek	P06G-0-20-F	For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries	World Scientific Instruments	TW-100-4	For microinjection needles
Transfer pipettes	Sigma Aldrich	Z350796	For transferring zebrafish embryos
Microloader tips	Fisher scientific	E5242956003	For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	For manipulating microinjection needle
Magnetic stand	MSC	SPI - 87242624	For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope	ThermoFisher	EVOS FL	To image injected embryos
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745	For visualizing microinjecion
AutoCAD software	Autodesk		Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki