Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Zusammenfassung

Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell der verschiedenen menschlichen Krankheiten und ein nützliches Werkzeug für eine zunehmende Anzahl von experimentellen Studien über grundlegende Entwicklungsbiologie durch zu großen genetischen und chemischen Bildschirme. Allerdings setzen viele Experimente, insbesondere im Zusammenhang mit Infektionen und Xenograft Modelle auf Mikroinjektion und Bildgebung von Embryonen und Larven, die aufwändige Techniken sind, die Fähigkeit und Kompetenz erfordern. Um die Präzision und den Durchsatz des aktuellen Mikroinjektion Techniken zu verbessern, entwickelten wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate zu orientieren und zu stabilisieren Zebrafisch-Embryonen im 2 Tage Post Düngung (Dpf) ventral, dorsal oder seitliche Ausrichtung vor der Verfahren. Um die Darstellung der Embryonen zu erleichtern, haben wir auch ein einfaches Gerät mit Kanälen, die 4 Zebrafisch seitlich parallel gegen ein Glas Deckglas orient entwickelt. Zusammen, belegen die Werkzeuge, die wir hier präsentieren die Wirksamkeit photolithographische Ansätze um nützliche Geräte für die Optimierung von Zebrafisch-Techniken zu generieren.

Einleitung

Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell für viele Bereiche, von der grundlegenden Entwicklungsbiologie, umfangreiche genetische Studien und chemische Bildschirme^1,2. Routinemäßige genetische Manipulationen, wie gen-Überexpression, Zuschlag, CRISPR/Cas9 Mutagenese und Transgenese verlassen sich auf Mikroinjektion von genetischem Material in der einzelligen Zygote, die zur Entwicklung von einfachen, leicht zu bedienende, kommerziell geführt hat verfügbare Tools zur Ausrichtung und Stabilisierung von Eiern für Injektion³. Andere Ansätze, wie z.B. Transplantation und Infektion, erfordern oft Mikroinjektion in späteren Embryonen und Larven mit größeren Spurweite Kapillare Nadeln⁴. Verwendung von größeren g-Nadeln stellt jedoch erhebliche technische Herausforderungen, da es immer schwieriger, das Zielgewebe zu durchdringen, ohne Drücken oder Rollen des Embryos ist. Unter diesen Bedingungen kann Einholung der entsprechenden Wasser Spannung erforderlich, um den Embryo zu stabilisieren, während Trocknung während des Verfahrens zu vermeiden schwierig ist und die Embryonen nicht ideal für die Injektion in das Zielgewebe orientieren.

Nach Mikroinjektion ist es oft sinnvoll, Bildschirm injizierte Embryonen diejenigen auswählen, die erfolgreich injiziert wurde und Bilder von den ersten Zeitpunkt zu erfassen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate entwickelt, die helfen, um 2 Dpf Embryonen in verschiedenen Ausrichtungen Mikroinjektion⁵, sowohl für schnelle Image-basierten Screening nach der Injektion zu stabilisieren.

Um ausreichende strukturelle Auflösung in diesen Geräten zu erhalten, haben wir photolithographische Techniken verwendet. In mikroelektronischen Industrie und mehr vor kurzem hochgerechnet auf mikrofluidischen Fertigung allgemein verwendet, können diese Ansätze vertikale Strukturen von 1-1.000 µm, einer Skala gut geeignet zur Manipulation von Zebrafisch-Embryonen und Larven bis hin erreichen. Alle Geräte wurden hergestellt mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die billig, körperlich robust, biologisch inert und transparent ist.

Mikrostrukturierte Oberfläche Arrays (MSAs) wurden als Blöcke von PDMS mit einer gemusterten Oberfläche formatiert, analog zu der einfache Kanäle in Agarose Blöcken gebräuchlich für Ei Mikroinjektion. Nach der Injektion Screening können 6 imaging-Geräte in ein standard Glasboden-6-Well-Platte angeordnet. Diese Geräte eignen sich für einfache Befüllung von Embryonen, während der Entlade Verfahren bequem Rettung von bestimmten Embryonen, Erleichterung ermöglicht Image-basierte screening Ansätze in benutzerfreundlicher Weise als diese Geräte zuvor erarbeiteten die Beebe-Labor-⁶.

Protokoll

Mikroinjektion der Larven wurde von der Massachusetts General Hospital Unterausschuss für Forschung Animal Care unter Protokoll 2011N000127 genehmigt.

1. Gerät Fertigung

Hinweis: Alle Computer-gestützte (CAD) Zeichnungsdateien verwendet Photolithographie-Masken, die hier beschriebenen entwerfen (Abbildung 1) sind zum Download zur Verfügung. Siehe Tabelle der Materialien für Links.

1. Den master-Form-Wafer im Reinraum Klasse 1.000 mit Standardtechniken photolithographische⁷zu fabrizieren. Für die Mikrostruktur Arrays und Kanäle Muster der Epoxy-basierte negativer Photoresist nacheinander in 3 Schichten mit 3 separaten Masken, gemäß den Anweisungen des Herstellers: 100 µm für die flachen Features, 200 µm für die mittlere Features und 400 µm für die Tiefe verfügt. Für das Bildverarbeitungsgerät Schichten Muster zwei mit 400 µm für die flachen Features und 600 µm für die tiefen-Features.
2. Kleben Sie den fertige Wafer auf der Basis eines 15 cm Petrischale für das Gießen (Abbildung 2).

2. Vorbereitung von mikrostrukturierten Oberflächen Arrays - PDMS

1. Um nutzbare Geräte zu machen, werfen Sie Polydimethylsiloxan (PDMS), mit dem Meister Wafer als Form. 50 g PDMS Monomer mit 5 g des Initiators zu kombinieren und mischen in einem Kunststoff mit einem Gewicht von Schüssel mit einer Gabel aus Kunststoff.
2. Gießen Sie die Mischung vorsichtig über die Form.
3. In einem Vakuum Exsikkator bei 16-25 InHg (54-85 kPa) für 1 h entgasen.
4. Um die PDMS zu heilen, Backen Sie bei 65 ° C für mindestens 3 h. Die PDMS sollte auf eine feste, aber flexible solide heilen.
5. Schneiden Sie vorsichtig um das Gerät auf dem master Wafer mit einem Skalpell, sicherstellen, dass den Kontakt zwischen der Spitze des Skalpells und der Wafer-Oberfläche zu behalten. Mit Pinzette, Schälen der PDMS-Replikat vom Wafer und Übertragung auf eine saubere 10 cm Petrischale, Funktion Seite nach oben (Abbildung 3).
6. Behandeln Sie das Gerät mit Sauerstoffplasma mit einem Plasma-Ofen für 35 s, Hydrophobie zu reduzieren.
7. Deckel mit Zebrafish Embryos (E3)-haltigem Medium 168 mg/L von Ethyl-3-Aminobenoate-Methanesulfonate (MS-222, pH 7,5). Entfernen Sie alle Bläschen aus tieferen Funktionen von fließenden Wasser über die Oberfläche des Gerätes mit einer Transferpipette.

3. Vorbereitung der mikrostrukturierte Oberfläche Arrays - Agarose

1. Um eine Negativform PDMS zu machen, zuerst behandeln Sie eine PDMS-Gerät mit Sauerstoffplasma.
2. Behandeln Sie das PDMS-Gerät mit 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) Silan Dampf eine inerte Oberfläche⁸erstellen. Kurz:
   1. Ort der PDMS behandelten Feature-Seite nach oben in einer Vakuumkammer in einer Dampfhaube sein.
   2. Neben dem PDMS legen eine kleine offene Glas oder Aluminium-Schale und sorgfältig pipette 200 µL des PFDTS (98 % Silan) in die Schüssel.
      Achtung: PFDTS Silan ist sehr volatil, reagiert heftig mit Wasser, ist brennbar und verursacht schwere Haut- und Schäden auf Kontakt. Lesen Sie Muskel-und Skeletterkrankungen im Detail vor Gebrauch.
   3. Schließen Sie die Vakuumkammer und gelten Sie Vakuum für 15-30 Minuten, oder bis die PFDTS Silan vollständig verdunstet ist.
3. Stellen Sie das Gerät in einer Petrischale und als eine Form für frische PDMS, wie in Schritt 2.1-2.3 beschrieben.
4. Backen bei 65 ° C für mindestens 3 h, dann schälen die gesamte Schicht frischen PDMS vom behandelten Gerät und in einer frischen Petrischale. Dies dann als eine Negativform einsetzbar, um Agarose zu werfen.
5. Um die Agarose vorzubereiten, Kochen Sie eine 2 % ige Lösung von niedrigen gelierende Temperatur Agarose in E3 in der Mikrowelle bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.
6. Die Negativform PDMS übergießen Sie heißen Agarose und entfernen Sie alle Luftblasen in der Agarose für das Gerät durch fließende heißen Agarose über die Features mit einer Transferpipette.
7. Sobald Bläschen entfernt werden, im Kühlschrank bei 4 ° C die Agarose festlegen.
8. Entfernen Sie die Agarose-Block aus der Negativform PDMS durch Verformung der PDMS aus unterhalb von hand, übertragen Sie die Agarose-Block auf eine neue Petrischale und nass mit E3 mit MS-222.

4. Vorbereitung der PDMS Imaging-Geräte

1. Um nutzbare Geräte zu machen, werfen Sie PDMS, mit dem Meister Wafer als Form. Kombinieren Sie 50 g PDMS Monomer mit 5 g der Initiator (gleiche wie in Schritt 2.1 verwendet) und Mischung gründlich in einem Kunststoff mit einem Gewicht von Schüssel mit einer Gabel aus Kunststoff.
2. Gießen Sie die Mischung vorsichtig über die Form.
3. In einem Vakuum Exsikkator bei 16-25 InHg (54-85 kPa) für 1 h entgasen.
4. Um die PDMS zu heilen, Backen Sie bei 65 ° C für mindestens 3 h. Die PDMS sollte auf eine feste, aber flexible solide heilen.
5. Schneiden Sie die Geräte aus dem Master-Wafer und Häfen mit einem 1,5 mm Schlag ausstanzen.
6. Behandeln die Geräte und einem Glasboden 6-Well gut mit Sauerstoffplasma für 35 Platte s, wie unter Punkt 2.6 beschrieben.
7. Verbinden Sie ein Gerät Feature-Side-Down zu jedem Glas Deckglas des 6-Well-Platte, indem es auf eine Herdplatte 85 ° C für 10 min.
   Hinweis: Zur Bestätigung der erfolgreichen Verklebung Druck fest auf der einen Seite des verbundenen Geräts mit Pinzette. Das Gerät sollte an den Glas-Deckglas bleiben.

5. Zebrafisch-Kultur

1. Kultur-Zebrafisch-Embryonen bis 2 Dpf mit Standardtechniken³.
2. Dechorionate Embryonen mit Zange oder 1 mg/mL Protease mischen (siehe Materialtabelle)³ mindestens 30-60 Minuten vor der Verladung auf Gerät, damit sie sich zu begradigen.
3. Betäuben Sie Embryonen mit (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5) durch Zugabe von 25 X 1 mL Stammlösung auf der E3 in der Petrischale.

6. Ausrichtung der Zebrafisch auf mikrostrukturierte Oberfläche - Divot-Arrays

1. Vorbereiten des PDMS-Blocks aus Schritt 2.7 (Abbildung 3A) in der Petrischale, derart, dass sie durch eine dünne (1-2 mm) Schicht von E3, fällt die einfachere Handhabung der Embryonen erlaubt.
2. Übertragen Sie erforderliche Anzahl von Embryonen (in der Regel 10-20 pro Zustand) auf die Oberfläche des PDMS-Blocks mit einer Transferpipette.
3. Mit einem Tool Mikromanipulation (Haar Schleife o.ä.), schieben Sie die Embryonen in mikrostrukturierten Divots (Abb. 3A). Verwendung von Divots eignet sich besonders für dorsalen und ventralen Orientierungen.
   Hinweis: Für die Divots mit einer strengeren passen (dorsale und ventrale), versuchen die Embryonen auf der Oberfläche des Blocks parallel zu den Divot zu positionieren und dann Rollen sie mit einer Haar-Schleife in Position. Schob sie tiefer in das Divot hilft um sie stabil zu halten.

7. Orientierung der Zebrafisch auf mikrostrukturierte Oberfläche - mikrostrukturierten Kanäle

1. Gemustert mit mikrostrukturierten Kanäle (Abb. 3 b) mit einer Transferpipette, bis das Niveau der E3 unter den Rand des Blocks fällt, aber noch vorhanden, in das Reservoir und Kanäle und in einer dünnen Schicht auf die PDMS ist PDMS-Block ziehen Sie E3 ab.
2. Übertragen Sie 10 Embryonen aus Schritt 5.3 in das Reservoir mit einer Transferpipette, ohne dabei die Kanten zu überlaufen.
3. Mit einer Haar-Schleife, manipulieren Sie jeder Embryo in den Trichter am Eingang des entsprechenden Kanals zu und orientieren Sie, so dass der Kopf des Embryos in Richtung des Kanals ist und der Embryo die entsprechende Ausrichtung beim Eintritt in den Kanal hat.
4. Schieben Sie jedes Embryo ab der Kanal mit einer Haar-Schleife, bis es die orientierende Microfeatures in die Kanalwände, die helfen erreicht, um es in Position zu halten. Nutzung von mikrostrukturierten Kanälen empfiehlt sich besonders für die seitliche Ausrichtung.
   Hinweis: Um Embryo während Mikroinjektion zu reduzieren, versuchen Sie Anpassung der Höhe der Oberflächenspannung durch E3 aus dem Behälter ziehen.

8. die Mikroinjektion Zebrafisch

1. Mikroinjektion Nadel vorbereiten.
   1. Borosilikatglas Microcapillary Nadeln mit einer Mikropipette Puller als zuvor beschriebenen⁴zu machen. Die daraus resultierende Nadeln sollten bis zu einem Punkt an einem Ende mit einer konischen Länge von ca. 10 mm abgeschrägt werden.
   2. Bereiten Sie Lösung injiziert werden, in diesem Fall 100 nM Lockstoffgradient (N-Formylmethionine-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) oder Leukotrien B4 (LTB4)) und 100 nM 70 kDa Rhodamine Dextran Tracer mit PBS-Puffer.
   3. Laden Sie 5 µL der Lösung in die Nadel mit einer fein konische Pipette Tipp (siehe Materialtabelle).
   4. Montieren Sie die Nadel in einem Mikromanipulator auf magnetische Stativ montiert und angeschlossen an eine Picopump Microinjector.
2. Brechen Sie die Spitze der Nadel in einem 45 °-Winkel durch Kneifen die kegelförmige Spitze mit der Pinzette.
3. Passen Sie Injektion Bolus Größe 1 nL durch die Einspritzzeit auf dem Picopump Controller einstellen.
4. Stellen Sie den Winkel der Mikroinjektion Nadel. Ein Nadel-Winkel von 45° auf die Mikromanipulation Controller ist im Allgemeinen ein guter Ausgangspunkt, mit der Nadel parallel zu der Länge des Embryos. Ein steilerer Winkel kann verwendet werden, um die seitliche Bewegung des Embryos während der Mikroinjektion zu minimieren.
5. Steuerung der Petrischale mit der linken Hand und die Nadel Mikromanipulator mit dem Recht, bringen Sie die Nadel so nah wie möglich an den vorgesehenen Ort der Mikroinjektion, in diesem Fall die Gleichheitspartei Vesikel.
   Hinweis: Die Gleichheitspartei Vesikel kann als längliche Organ posterior für das Auge mit zwei kleineren ausgeprägte dunkle längliche Strukturen (Otolithen) identifiziert werden.
6. Mit dem Mikromanipulation Controller durchdringen Sie das Zielgewebe (in diesem Fall die Gleichheitspartei Vesikel) zu, so dass die Spitze der Nadel in die Blase und injizieren Sie die voreingestellte Lautstärke mit der Picopump-Fuß-Schalter.
   Hinweis: Wenn das Gewebe eindringen widersteht, möglichst leichtes Klopfen des Mikromanipulation Controller Knopfes.
7. Um die Embryonen zu lösen, fließen Sie E3 über die Oberfläche von oben nach unten mit einer Transferpipette oder durch Schütteln das Gericht, dass die Embryonen in die umliegenden E3 freigesetzt werden.
8. Übertragen Sie die Embryonen ohne MS-222 mit einer Transferpipette auf eine Erholung Schüssel mit E3.

9. screening von Embryonen mit dem PDMS Imaging-Gerät

1. Erstklassige Gerät aus Schritt 4.7 durch fließende E3 (+ MS-222) durch den Hafen. Dies kann mit einer 1.000 µL Pipette oder eine schmale Spitze Transferpipette.
2. Füllen Sie den Brunnen mit E3 + MS-222, bis das Gerät bedeckt ist.
3. Liefern Sie 4 injizierte Embryonen von 8.7 Schritt in jeder gut mit einer Transferpipette. Embryonen können vorher betäubt werden bei Bedarf durch Inkubation in E3 + MS-222 für 1 – 2 min. vor dem Laden (Schritt 5.3).
4. Mit einem Tool Mikromanipulation (Haar Schleife o.ä.), richten Sie die Embryonen an den Eingängen der bildgebenden Kanäle in der gewünschten Richtung (Tail-erste oder kopfüber, abhängig vom verwendeten Gerät), und schieben Sie sie teilweise in das Gerät (Abb. 4A). Damit sie gleichmäßig in das Gerät zu ziehen.
5. Zeichnen Sie E3 durch das Gerät aus dem Hafen mit 1.000 µL Pipette oder Transferpipette, bis die Embryonen in die Kanäle in der richtigen Ausrichtung für imaging (Abbildung 4 b) gezeichnet werden.
   Hinweis: Achten Sie darauf, die Embryonen über den Fang Punkt zu saugen, wird die Embryonen schädigen und ihre Ausrichtung ändern.
6. Übertragen Sie Well-Platte auf Mikroskop für imaging (Abbildung 4).
7. Bild mit einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop.
   1. Einstellen Sie Vergrößerung durch Auswahl der entsprechenden Objektiv. 10 X ist in der Regel eine nützliche Vergrößerung für imaging Zebrafisch Neutrophilenzahl Migration.
   2. Einstellen Sie Intensität der Lichtquelle und Belichtungszeit für jeden Kanal so, dass jedes Signal klar, aber nicht gesättigt ist.
   3. Die Aufnahmen Sie für jeden Kanal. Hier verwendeten wir grünes fluoreszierendes Protein (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) und Kanäle übertragen. Mehrkanal-Bilder können während der Post-Processing kombiniert werden (Abbildung 4 b-Ich).

Ergebnisse

Der hier beschriebene Ansatz zeigt die Konstruktion (Abbildung 1) und Herstellung von Geräten für den Einsatz mit 2 Dpf Zebrafisch, photolithographische (Abbildung 2) und weichen lithografischen (Abbildung 3) Techniken. Mit dieser Methode können Schnelltests vieler Design-Iterationen und Änderungen und Umbauten und Optimierung der Mikrostruktur Dimensionen für die Verwendung mit Zebrafisch auf a...

Diskussion

Hier beschreiben wir die Verwendung von Geräten wir vor kurzem entwickelt, um 2 Dpf Zebrafisch Mikroinjektion⁵erleichtern und stellen eine einfache Agarose-freie Halterung für die komfortable Darstellung von Embryonen. Diese Werkzeuge markieren Sie das Dienstprogramm photolithographische Techniken für die Herstellung von Geräten nützlich für Zebrafisch-Techniken.

Wir haben gefunden MSA Geräte besonders nützlich für die Injektion von Zellen oder Partikel anfäll...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184  Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose	Sigma Aldrich	A9414-10G	For casting agarose devices
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	To anesthetize  zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish	Fisher scientific	08-757-148	For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates	MatTek	P06G-0-20-F	For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries	World Scientific Instruments	TW-100-4	For microinjection needles
Transfer pipettes	Sigma Aldrich	Z350796	For transferring zebrafish embryos
Microloader tips	Fisher scientific	E5242956003	For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	For manipulating microinjection needle
Magnetic stand	MSC	SPI - 87242624	For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope	ThermoFisher	EVOS FL	To image injected embryos
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745	For visualizing microinjecion
AutoCAD software	Autodesk		Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki