Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Riepilogo

Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.

Abstract

Zebrafish sono emerso come un potente modello di varie malattie umane e uno strumento utile per una gamma crescente di studi sperimentali, che abbracciano fondamentale biologia inerente allo sviluppo attraverso agli schermi di genetici e chimici su larga scala. Tuttavia, molti esperimenti, soprattutto quelli legati alla infezione e modelli dello xenotrapianto, si basano su microiniezione e l'imaging di embrioni e le larve, che sono laboriose tecniche che richiedono abilità e competenze. Per migliorare la precisione e la velocità di trasmissione di corrente microiniezione, abbiamo sviluppato una serie di dispositivi microstrutturati per orientare e stabilizzare gli embrioni di zebrafish 2 giorni post fertilizzazione (dpf) nell'orientamento ventrale, dorsale o laterale prima dei procedura. Per facilitare l'imaging di embrioni, abbiamo anche disegnato un semplice dispositivo con canali che orientano 4 zebrafish lateralmente in parallelo contro un vetro vetrino coprioggetti. Insieme, gli strumenti che vi presentiamo qui dimostrano l'efficacia di approcci fotolitografica per generare dispositivi utili per l'ottimizzazione delle tecniche di zebrafish.

Introduzione

Zebrafish sono emerse come un potente modello per molti campi, dagli studi di biologia dello sviluppo fondamentale a larga scala genetica e chimica schermi^1,2. Sistematiche manipolazioni genetiche, come la sovraespressione genica, atterramento, CRISPR/Cas9 mutagenesi e transgenesi si basano su microiniezione di materiale genetico in singola cellula zigote, che ha portato allo sviluppo di semplice, facile da usare, nel commercio strumenti disponibili per orientare e stabilizzare le uova per iniezione³. Altri approcci, come il trapianto e l'infezione, spesso richiedono microiniezione in embrioni in fase successivi e larve utilizzando più grande calibro capillare aghi⁴. Tuttavia, uso di aghi di calibro più grandi presenta significative sfide tecniche, come è più difficile penetrare il tessuto dell'obiettivo senza spingere o l'embrione di rotolamento. In queste condizioni, ottenendo la tensione adatta dell'acqua necessaria per stabilizzare l'embrione, mentre è difficile evitare essiccazione durante la procedura e gli embrioni non può non essere idealmente orientato per l'iniezione nel tessuto bersaglio.

A seguito di microiniezione, è spesso utile paravento embrioni iniettati per selezionare quelli che sono stati iniettati con successo e per catturare le immagini del punto di tempo iniziale. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato una gamma di dispositivi microstrutturati che aiutano a stabilizzare 2 dpf embrioni in vari orientamenti microiniezione⁵sia per post-iniezione screening rapido basato sulle immagini.

Per ottenere una risoluzione sufficiente strutturale in questi dispositivi, abbiamo utilizzato le tecniche fotolitografiche. Comunemente impiegati nell'industria microelettronica e più recentemente estrapolato a microfluidic fabrication, questi approcci possono realizzare strutture verticali che vanno da 1-1.000 µm, una scala adatta alla manipolazione di embrioni di zebrafish e larve. Tutti i dispositivi sono stati fabbricati con polidimetilsilossano (PDMS), che è a buon mercato, fisicamente robusto, biologicamente inerte e trasparente.

Matrici di superficie microstrutturate (MSAs) sono state formattate come blocchi di PDMS con una superficie superiore a motivi, analoga ai canali semplici in agarosio blocchi comunemente usati per il microinjection di uovo. Per post-iniezione screening, 6 dispositivi di imaging possono essere schierati in una piastra 6-pozzetti con fondo di vetro standard. Questi dispositivi sono progettati per un facile caricamento di embrioni, mentre la procedura di scarico permette comodamente di salvataggio degli embrioni specifici, facilitando basata su immagine approcci di screening in modo più user-friendly rispetto quei dispositivi precedentemente sviluppato dalla Beebe laboratorio⁶.

Protocollo

Microinjection delle larve è stato approvato dalla Massachusetts General Hospital sottocommissione per ricerca Animal Care sotto protocollo 2011N000127.

1. fabbricazione di dispositivi

Nota: Tutti i assistita da computer (CAD) file di disegno utilizzati per la progettazione di maschere di fotolitografia descritte qui (Figura 1) sono disponibili per il download. Vedi tabella materiali per i collegamenti.

1. Fabbricare il wafer di stampo master in camera bianca classe 1.000 utilizzando tecniche fotolitografiche standard⁷. Per le matrici di microstruttura e canali, modello il photoresist negativo a base epossidica in sequenza a 3 strati usando 3 maschere separate, secondo le istruzioni del produttore: 100 µm per le caratteristiche superficiali, 200 µm per le caratteristiche medie e 400 µm per le caratteristiche profonde. Per il dispositivo di imaging, modello due strati utilizzando 400 µm per le caratteristiche superficiali e 600 µm per le caratteristiche profonde.
2. Nastro la cialda completata alla base di un 15 cm di Petri per colata (Figura 2).

2. preparazione di matrici superficie microstrutturate - PDMS

1. Per rendere utilizzabile dispositivi, eseguire il cast polidimetilsilossano (PDMS), utilizzando il master wafer come uno stampo. 50 g di monomero PDMS si combinano con 5 g di iniziatore e mescolare accuratamente in un piatto di pesatura con una forchetta di plastica di plastica.
2. Versare il composto con attenzione sopra lo stampo.
3. Degas in un essiccatore sotto vuoto a 16-25 inHg (54-85 kPa) per 1 h.
4. Per curare il PDMS, cuocere in forno a 65 ° C per almeno 3 ore. Il PDMS dovrebbe curare un solido duro ma flessibile.
5. Accuratamente tagliato intorno al dispositivo sul wafer master utilizzando un bisturi, assicurandosi di mantenere il contatto tra la punta del bisturi e la superficie del wafer. Usando il forcipe, sbucciare la replica PDMS lontano la cialda e il trasferimento a un pulito 10 cm di Petri, lato di funzionalità (Figura 3).
6. Trattare il dispositivo con il plasma di ossigeno utilizzando un forno al plasma per 35 s per ridurre idrofobicità.
7. Coprire con il supporto di embrione di zebrafish (E3) che contiene 168 mg/L di etile 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5). Rimuovi qualsiasi bolle da più profonde caratteristiche di flusso d'acqua sopra la superficie del dispositivo utilizzando una pipetta di trasferimento.

3. preparazione di matrici superficie microstrutturate - agarosio

1. Per fare uno stampo negativo di PDMS, in primo luogo trattare un dispositivo PDMS con plasma ad ossigeno.
2. Trattare il dispositivo PDMS con 1H, 1H, 2H, 2Hvapor di silano - Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) per creare una superficie inerte⁸. Brevemente:
   1. Posto il PDMS essere trattata caratteristica-side-up in una camera a vuoto all'interno di una cappa aspirante.
   2. Accanto il PDMS, posizionare un piccolo piatto di vetro o alluminio aperto e attentamente Pipettare 200 µ l di PFDTS (98% Silano) nel piatto.
      Attenzione: Silano PFDTS è altamente volatile, reagisce violentemente con l'acqua, è infiammabile e causa gravi danni della pelle e degli occhi sul contatto. Leggi MSDS in dettaglio prima dell'uso.
   3. Chiudere la camera a vuoto e applicare il vuoto per 15-30 minuti, o fino a quando il silano PFDTS è completamente evaporato.
3. Collocare il dispositivo in una capsula di Petri e utilizzare come uno stampo per PDMS fresco, preparato come descritto al punto 2.1-2.3.
4. Cuocere in forno a 65 ° C per almeno 3 ore, poi sbucciare l'intero livello di PDMS fresco dal dispositivo trattato e posto in una capsula Petri fresco. Quindi utilizzabile come uno stampo negativo per eseguire il cast dell'agarosi.
5. Per preparare dell'agarosi, far bollire una soluzione di 2% di basso gelificante temperatura agarosio in E3 in un forno a microonde finchè l'agarosio sia completamente dissolto.
6. Versare l'agarosio caldo sopra lo stampo negativo di PDMS e rimuovere tutte le bolle in agarosio che copre il dispositivo di agarosio caldo che scorre oltre le caratteristiche con una pipetta di trasferimento.
7. Una volta che bolle vengono rimossi, conservare in frigorifero a 4 ° C per impostare l'agarosio.
8. Rimuovere il blocco di agarosio dallo stampo negativo PDMS deformando il PDMS da sotto a mano, trasferimento del blocco di agarosio per una nuova piastra di Petri e bagnarlo con E3 contenente MS-222.

4. preparazione di PDMS periferiche di Imaging

1. Per rendere utilizzabile dispositivi, eseguire il cast PDMS, utilizzando il master wafer come uno stampo. 50 g di monomero PDMS si combinano con 5 g di iniziatore (uguale a quello usato nel passaggio 2.1) e mescolare accuratamente in un piatto di pesatura con una forchetta di plastica di plastica.
2. Versare il composto con attenzione sopra lo stampo.
3. Degas in un essiccatore sotto vuoto a 16-25 inHg (54-85 kPa) per 1 h.
4. Per curare il PDMS, cuocere in forno a 65 ° C per almeno 3 ore. Il PDMS dovrebbe curare un solido duro ma flessibile.
5. Tagliare i dispositivi da Master Wafer e punch out porte usando un punzone di 1,5 mm.
6. Trattare i dispositivi e un 6-pozzetti con fondo di vetro ben piatto con plasma ad ossigeno per 35 s, come descritto al punto 2.6.
7. Legame uno dispositivo funzionalità-lato-giù per ogni vetrino coprioggetti della piastra 6 pozzetti inserendolo in una piastra di 85 ° C per 10 min.
   Nota: Per confermare il successo incollaggio, applicare la pressione costante su un lato del dispositivo incollato usando il forcipe. Il dispositivo dovrebbe rimanere il vetrino coprioggetti.

5. Zebrafish cultura

1. Embrioni di zebrafish di cultura a 2 dpf utilizzando tecniche standard³.
2. Dechorionate embrioni usando proteasi forcipe o 1 mg/mL mix (Vedi materiali tavolo)³ almeno 30-60 minuti prima di caricarli sul dispositivo, per consentire loro di raddrizzare.
3. Anestetizzare embrioni usando la soluzione di riserva (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5) aggiungendo 1 mL di 25x per l'E3 in loro di Petri.

6. orientamento di Zebrafish sulla superficie microstrutturata - Divot matrici

1. Preparare il blocco PDMS da passo 2.7 (Figura 3A) nella sua scatola di Petri tale che è coperto da uno strato sottile (1-2 mm) di E3, che permette una più facile manipolazione degli embrioni.
2. Trasferire il numero necessario di embrioni (in genere 10-20 a condizione) sulla superficie del blocco PDMS utilizzando una pipetta di trasferimento.
3. Utilizzando uno strumento di micromanipolazione (ciclo dei capelli o simili), spingere gli embrioni il divots microstrutturata (Figura 3A). Utilizzo di divots è particolarmente indicato per gli orientamenti dorsali e ventrali.
   Nota: Per le punte con un più stretto misura (dorsale e ventrale), provare gli embrioni di posizionamento sulla superficie del blocco in parallelo con il divot e poi rotolare nella posizione usando un ciclo dei capelli. Spingendoli più profondo nel divot aiuterà a tenerli stabili.

7. orientamento di Zebrafish sulla superficie microstrutturata - microstrutturate canali

1. Disegnare E3 il blocco di PDMS modellato con canali microstrutturate (Figura 3B) usando una pipetta di trasferimento fino a quando il livello di E3 scende di sotto del bordo del blocco, ma è ancora presente nel serbatoio e canali e in uno strato sottile sul PDMS.
2. Trasferire 10 embrioni dal punto 5.3 nel serbatoio utilizzando una pipetta di trasferimento, facendo attenzione a non i bordi sfioratori.
3. Utilizzando un ciclo di capelli, manipolare ogni embrione nell'imbuto all'ingresso del canale appropriato e orientare tale che la testa dell'embrione è verso il canale e l'embrione ha l'orientamento appropriato come entra nel canale.
4. Far scorrere ogni embrione giù il canale utilizzando un ciclo di capelli fino a raggiungere la microfeatures orientante nelle pareti del canale che aiutano a tenerlo in posizione. Uso dei canali microstrutturate è particolarmente indicato per l'orientamento laterale.
   Nota: Per ridurre l'embrione scorrevole durante la microiniezione, provare a regolare la quantità di tensione superficiale disegnando E3 dal serbatoio.

8. microiniezione di Zebrafish

1. Preparare l'ago per microiniezione.
   1. Fare vetro borosilicato microcapillary aghi utilizzando un estrattore micropipetta come descritto in precedenza⁴. Gli aghi risultanti devono essere diminuito gradualmente in un punto ad un'estremità, con una lunghezza conica di circa 10 mm.
   2. Preparare la soluzione da iniettare, in questo caso 100 nM chemoattractant (N-Formylmethionine-leucyl-fenilalanina (fMLP) o il leucotriene B4 (LTB4)) e 100 nM di 70 kDa tracciante di destrano rodamina in PBS.
   3. Caricare l'ago usando una pipetta finemente affusolata 5 µ l di soluzione di punta (vedere tabella materiali).
   4. Montare l'ago in un micromanipolatore montato su un supporto magnetico e collegato ad un microinjector picopump.
2. Rompere la punta dell'ago a un angolo di 45 ° pizzicando la punta conica con il forcipe.
3. Regolare la dimensione del bolo iniezione a 1 nL regolando il tempo di iniezione sul controller picopump.
4. Regolare l'angolo dell'ago microiniezione. Un angolo di ago di 45 ° sul controller di micromanipolazione è generalmente un buon punto di partenza, con l'ago parallelo alla lunghezza dell'embrione. Un angolo più ripido può essere utilizzato per minimizzare il movimento laterale dell'embrione durante la microiniezione.
5. Controllo di Petri con la mano sinistra e il micromanipolatore di ago con la destra, portare l'ago più vicino possibile al sito desiderato di microiniezione, in questo caso la vescicola otica.
   Nota: La vescicola otica può essere identificata come l'organo oblunga posteriore dell'occhio che contiene due più piccolo scure oblunghe strutture distinte (otoliti).
6. Utilizzando il controller di micromanipolazione, penetrare il tessuto bersaglio (in questo caso la vescicola otica) tale che la punta dell'ago è all'interno della vescicola e iniettare il volume preimpostato utilizzando l'interruttore a pedale picopump.
   Nota: Se il tessuto resiste alla penetrazione, provare picchiettando delicatamente la manopola del regolatore di micromanipolazione.
7. Per rilasciare gli embrioni, flusso E3 sopra la superficie da cima a fondo utilizzando una pipetta di trasferimento, o agitando il piatto, tale che gli embrioni vengono rilasciati in E3 circostanti.
8. Trasferire gli embrioni per un piatto di recupero di E3 senza MS-222 utilizzando una pipetta di trasferimento.

9. selezione degli embrioni usando il dispositivo di Imaging di PDMS

1. Primo il dispositivo da passo 4.7 per fluire E3 (+ MS-222) attraverso la porta. Questo può essere fatto utilizzando una pipetta di 1.000 µ l o una stretta-punta delle pipette.
2. Riempire il pozzetto con E3 + MS-222, fino a quando il dispositivo è coperto.
3. Consegnare 4 embrioni iniettati dal passaggio 8,7 in ogni pozzetto usando una pipetta di trasferimento. Gli embrioni possono essere pre-anestetizzati se desiderato incubando in E3 + MS-222 per 1-2 min prima del caricamento (punto 5.3).
4. Utilizzando uno strumento di micromanipolazione (ciclo dei capelli o simili), orientare gli embrioni presso gli ingressi dei canali imaging l'orientamento desiderato (coda-primo o testa prima, a seconda del dispositivo utilizzato) e spingerli parzialmente nel dispositivo (Figura 4A). Questo vi aiuterà a disegnarli in modo uniforme nel dispositivo.
5. Disegnare E3 attraverso il dispositivo dalla porta utilizzando una pipetta di 1.000 µ l o pipetta fino a quando gli embrioni sono disegnati nei canali con l'orientamento corretto per l'imaging (Figura 4B).
   Nota: Fare attenzione a non succhiare gli embrioni oltre il punto di cattura, questo danneggerà gli embrioni e alterare il loro orientamento.
6. Trasferimento piastra al microscopio per imaging (Figura 4).
7. Immagine utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza.
   1. Regolare ingrandimento selezionando la lente appropriata. 10 X è di solito un ingrandimento utile per l'imaging di migrazione del neutrofilo zebrafish.
   2. Regolare la sorgente luminosa intensità e tempo di esposizione per ogni canale affinché ogni segnale è chiaro, ma non saturo.
   3. Catturare immagini per ogni canale. Qui, abbiamo usato la proteina fluorescente verde (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) e canali di trasmissione. Immagini multicanale possono essere combinati in fase di elaborazione (Figura 4B-io).

Risultati

L'approccio descritto qui di seguito viene illustrato il disegno (Figura 1) e la fabbricazione di dispositivi per l'utilizzo con 2 dpf zebrafish, utilizzando fotolitografica (Figura 2) e tecniche di soft-litografiche (Figura 3). Questo metodo consente di testare rapidamente molte iterazioni di progetto e modifiche, e le alterazioni e l'ottimizzazione delle dimensioni di microstruttura per l'uso con i...

Discussione

Qui, descriviamo l'uso di dispositivi abbiamo recentemente sviluppato per facilitare 2 dpf zebrafish microiniezione⁵e introdurre un dispositivo semplice montaggio privo di agarosio per imaging conveniente degli embrioni. Questi strumenti evidenziano l'utilità delle tecniche fotolitografiche per la fabbricazione di dispositivi utili per le tecniche di zebrafish.

Abbiamo trovato questo dispositivi MSA particolarmente utile per l'iniezione di cellule o particelle incline ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose	Sigma Aldrich	A9414-10G	For casting agarose devices
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	To anesthetize zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish	Fisher scientific	08-757-148	For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates	MatTek	P06G-0-20-F	For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries	World Scientific Instruments	TW-100-4	For microinjection needles
Transfer pipettes	Sigma Aldrich	Z350796	For transferring zebrafish embryos
Microloader tips	Fisher scientific	E5242956003	For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	For manipulating microinjection needle
Magnetic stand	MSC	SPI - 87242624	For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope	ThermoFisher	EVOS FL	To image injected embryos
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745	For visualizing microinjecion
AutoCAD software	Autodesk		Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki