Microstructured устройства для оптимизированного микроинъекции и изображений личинок данио рерио

Резюме

Микроинъекции zebrafish эмбриона и личинки является важным, но сложным техника, используемая во многих моделях данио рерио. Здесь мы представляем широкий спектр микромасштабной инструментов для оказания помощи в стабилизации и ориентации данио рерио микроинъекции и изображений.

Аннотация

Данио рерио превратились в мощную модель различных заболеваний человека и полезным инструментом для увеличения диапазона экспериментальных исследований, охватывающих основные биологии развития через крупномасштабных генетических и химических экраны. Однако многие эксперименты, особенно тех, которые касаются инфекции и гранулы ксенотрансплантата модели, полагаются на микроинъекции и изображения эмбрионов и личинки, которые кропотливой методы, которые требуют навыка и опыта. Чтобы повысить точность и производительность современных методов микроинъекции, мы разработали ряд microstructured устройств для ориентации и стабилизации zebrafish эмбриона на 2 дня пост оплодотворение (dpf) в брюшной, спинной или поперечной ориентации до процедура. Для оказания помощи в визуализации эмбрионов, мы также разработали простое устройство с каналами, которые Ориент 4 данио рерио боково параллельно против скольжения обложки стекла. Вместе инструменты, которые мы представляем здесь продемонстрировать эффективность фотолитографический подходов для создания полезных устройств для оптимизации данио рерио методов.

Введение

Данио рерио превратились в мощную модель для многих областях, начиная от исследования фундаментальных биологии развития для крупномасштабных генетических и химических экранов^1,2. Рутинной генетических манипуляций, например гиперэкспрессия генов, сногсшибательно, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мутагенеза и трансгенез полагаются на микроинъекции генетического материала в одной ячейки зиготы, которая привела к разработке простых, легко в использовании, коммерчески доступные инструменты для ориентации и стабилизации яйца для инъекций³. Другие подходы, например трансплантации и инфекции, часто требуют микроинъекции в поздней стадии эмбриона и личинки, с использованием больших датчика капиллярного иглы⁴. Однако использование больших датчик иглы представляет значительные технические проблемы, как это более трудно проникнуть в ткани-мишени без нажатия или прокатки эмбриона. В этих условиях получения напряженности соответствующие воды, необходимых для стабилизации эмбриона, хотя трудно избежать высыхания во время процедуры и эмбрионы не может быть идеально ориентированы для инъекций в ткани-мишени.

После микроинъекции полезно часто вводят эмбрионов, выбрать те, которые были успешно введены и для захвата изображений в начальный момент времени точки на экране. Для решения этих проблем, мы разработали широкий спектр microstructured устройств, которые помогают стабилизировать 2 dpf эмбрионов в различных ориентациях микроинъекции⁵и для быстрого скрининга на основе образа впрыск.

Чтобы получить достаточных структурных резолюции в этих устройств, мы использовали фотолитографический методы. Широко используется в микроэлектронной промышленности и более недавно экстраполированы microfluidic изготовление, эти подходы можно добиться вертикальной структуры, начиная от 1-1000 мкм, масштаба, хорошо подходит для манипуляции zebrafish эмбриона и личинки. Все устройства были изготовлены с использованием полидиметилсилоксан (PDMS), который дешево, физически надежные, биологически инертным и прозрачным.

Microstructured поверхности массивы (СУУ) были отформатированы как блоки PDMS с узорными верхней поверхности, аналогичен простой каналы в блоках агарозы широко используется для микроинъекции яйцо. Для скрининга впрыск, 6 изображений устройства можно одеть в стандартной пластине 6-ну прозрачным дном. Эти устройства предназначены для легкой загрузки эмбрионов, в то время как процедуре выгрузки удобно позволяет спасения конкретных эмбрионов, содействия на основе образа скрининг подходов в более удобной для пользователя форме, чем те устройства, разработанной ранее Биб Лаборатория⁶.

протокол

Микроинъекции личинок был одобрен Подкомитетом общие больницы Массачусетс на исследования животных уход под протокол 2011N000127.

1. устройство изготовление

Примечание: Все компьютерные рисования (CAD) файлы используются для разработки фотолитографии маски описано здесь (рис. 1) доступны для скачивания. Смотрите таблицу материалов.

1. Изготовить мастер формы пластин в чистую комнату класса 1000 с использованием стандартных методов фотолитографический⁷. Для массивов микроструктуры и каналы, модель на основе эпоксидных негативного фоторезиста последовательно в 3 слоя, используя 3 отдельные маски, согласно инструкции производителя: 100 мкм для мелких функций, 200 мкм для средних функций и 400 мкм глубокие возможности. Для изображений устройства шаблон, два слои с помощью 400 мкм для мелких функций и 600 мкм для глубоких функций.
2. Лента завершенных пластин на базе 15 см Петри для литья (рис. 2).

2. Подготовка Microstructured поверхности массивов - PDMS

1. Чтобы использовать устройства, литые полидиметилсилоксан (PDMS), используя мастер пластины как плесень. Объединить 50 g PDMS мономера с 5 g инициатора и тщательно перемешать в пластиковом весом блюдо с пластиковой вилкой.
2. Залейте смесь тщательно плесень.
3. Дега в вакуумный сушильный шкаф в 16-25 дюйм рт.ст (54-85 кПа) за 1 ч.
4. Чтобы вылечить PDMS, выпекать при температуре 65 ° C для по крайней мере 3 h. PDMS следует лечить в солидной фирмы, но гибкие.
5. Аккуратно вырежьте вокруг устройства на главной пластины с помощью скальпеля, убедившись в том поддерживать контакты между кончиком скальпель и поверхности пластин. С помощью щипцов, пил PDMS реплики от пластин и передачи чистых 10 см Петри, функция стороной вверх (рис. 3).
6. Лечить устройство с кислородной плазмы с помощью плазменной печи для 35 s сократить гидрофобность.
7. Крышка с zebrafish эмбриона среднего (E3) содержащих 168 мг/Л этиловый метансульфонат 3-aminobenoate (MS-222, pH 7.5). Удалите любые пузыри от более глубокие возможности проточной воды на поверхности устройства с помощью пипетки передачи.

3. Подготовка поверхности Microstructured массивов - агарозы

1. Чтобы отрицательные PDMS плесень, сначала лечить PDMS устройство с кислородной плазмы.
2. Лечить PDMS устройство с 1H, 1H, 2Ч, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) силана пара для создания инертной поверхности⁸. Кратко:
   1. Место PDMS быть очищенной особенность стороной вверх в вакуумной камере внутри зонта.
   2. Рядом с PDMS, место небольшое блюдо открытые стекла или алюминия, и тщательно Пипетка 200 мкл PFDTS (98% силана) в блюдо.
      Предупреждение: PFDTS силана является крайне неустойчивым, бурно реагирует с водой, легковоспламеняющиеся и вызывает серьезные повреждения кожи и глаз на контакт. ИКБМ читать подробно перед использованием.
   3. Закройте вакуумной камеры и применить вакуум для 15-30 мин, или до тех пор, пока PFDTS силана полностью испарилась.
3. Поместите устройство в чашку Петри и использовать в качестве формы для свежих PDMS, подготовленный, как описано в шаге 2.1-2.3.
4. Выпекать при температуре 65 ° C для по крайней мере 3 h, затем очистить весь слой свежего PDMS из обработанных устройства и место в свежие чашку Петри. Это может затем использоваться как отрицательные формы бросить агарозы.
5. Подготовить агарозы, кипятите 2% раствор низкой гелеобразующего температуры агарозы в E3 в микроволновой, пока полностью не растворится агарозы.
6. Залить горячей агарозы PDMS негативные формы и удалите любые пузыри в агарозы, охватывающих устройство проточной горячей агарозы над функции с передачей пипетки.
7. После удаления пузырьков, поставить в холодильник на 4 ° C для задания агарозы.
8. Удалите блок агарозы от негативных PDMS плесени, деформируя PDMS из под рукой, агарозы блок передачи новой Петри блюдо, и мокрый с E3 содержащих MS-222.

4. Подготовка PDMS изображений устройства

1. Чтобы использовать устройства, литые PDMS, используя мастер пластины как плесень. Объединить 50 g PDMS мономера с 5 g инициатор (так же, как на шаге 2.1) и перемешать тщательно в пластиковом весом блюдо с пластиковой вилкой.
2. Залейте смесь тщательно плесень.
3. Дега в вакуумный сушильный шкаф в 16-25 дюйм рт.ст (54-85 кПа) за 1 ч.
4. Чтобы вылечить PDMS, выпекать при температуре 65 ° C для по крайней мере 3 h. PDMS следует лечить в солидной фирмы, но гибкие.
5. Вырезать устройства от мастер пластин и выбивать портов с использованием удар 1,5 мм.
6. Лечить, устройства и 6-ну стекло дно хорошо пластины с кислородной плазмы для 35 s, как описано в пункте 2.6.
7. Бонд устройства функция сторона вниз для каждого стекла coverslip 6-ну пластины, поместив его на 85 ° C плитой для 10 мин.
   Примечание: Для подтверждения успешного связывания, давление фирмы к одной стороне кабального устройства, с помощью щипцов. Устройство должно оставаться прикрепленной к coverslip стекла.

5. данио рерио культура

1. Культура данио рерио эмбрионов до 2 dpf с использованием стандартных методов³.
2. Dechorionate эмбрионов, с помощью щипцов или 1 мг/мл протеазы смесь (см. таблицу материалов)³ по крайней мере 30-60 минут до загрузки на устройство, чтобы позволить им выпрямить.
3. Обезболивают эмбрионов, с помощью (168 мг/Л) MS-222 (рН 7,5), добавив 1 мл 25 X Стоковый раствор для E3 в их Петри.

6. ориентация данио рерио на Microstructured поверхности - Дивот массивы

1. Подготовьте PDMS блок из шага 2.7 (Рисунок 3А) в его чашку Петри, таким образом, что она покрыта тонкой (1-2 мм) слоем E3, которая позволяет легче манипуляции эмбрионов.
2. Перевести необходимое количество эмбрионов (обычно 10-20 за состояние) на поверхности PDMS блока с помощью пипетки передачи.
3. С помощью инструмента микроманипуляции (цикл волос или аналогичные), вставьте эмбрионы в microstructured дерна (рис. 3A). Использование дерна особенно подходит для дорсальной и вентральной ориентации.
   Примечание: Для дерна с ужесточение подходят (спинной и брюшной), попробуйте позиционирования эмбрионы на поверхности блока параллельно Дивот и затем подвижного их в положение, с помощью цикла волос. Толкая их глубже в Дивот поможет держать их стабильными.

7. ориентация данио рерио на Microstructured поверхности - Microstructured каналы

1. Снимать E3 PDMS блок с microstructured каналов (рис. 3B) с помощью пипетки передачи до тех пор, пока уровень E3 падает ниже края блока, но по-прежнему присутствует в водохранилища и каналы и тонким слоем на PDMS узором.
2. Передача 10 эмбрионов от шага 5.3 в водохранилище, с помощью передачи пипетки, стараясь не переполнение края.
3. С помощью цикла волос, манипулировать каждого эмбриона в воронку на входе соответствующего канала и ориентировать таким образом, чтобы голова эмбриона сторону канала и эмбрион имеет соответствующую ориентацию вводе канала.
4. Переместите каждый эмбрион вниз канал, с помощью цикла волос, пока достигнет ориентации microfeatures в стенках канала, которые помогают держать его на месте. Особенно рекомендуется использовать microstructured каналов для поперечной ориентации.
   Примечание: Для уменьшения зародыша, скольжения во время микроинъекции, попробуйте отрегулировать количество поверхностного натяжения, нарисовав E3 из водохранилища.

8. микроинъекции данио рерио

1. Подготовьте микроинъекции иглы.
   1. Сделайте боросиликатного стекла микрокапиллярной иглы с помощью съемника микропипеткой как описано⁴. Результате иглы должны конической до точки на одном конце, с коническим длиной примерно 10 мм.
   2. Приготовляют раствор для инъекций, в данном случае 100 Нм хемотаксического (N-формилметионин лейцил фенилаланин (fMLP) или B4 лейкотриенов (LTB4)) и 100 Нм 70 кДа родамин декстрана трассировщика в PBS.
   3. Загрузить 5 мкл раствора в иглу с помощью мелко конические пипетки Совет (см. таблицу материалов).
   4. Установите иглу в микроманипулятор монтируется на магнитную подставку и подключен к picopump microinjector.
2. Разорвать кончик иглы под углом в 45 °, щипать конический наконечник с щипцами.
3. Отрегулируйте размер болюс инъекций 1 nL, регулируя время впрыска на контроллере picopump.
4. Отрегулируйте угол микроинъекции иглы. Иглу под углом 45 ° на контроллере микроманипуляции обычно является хорошей отправной точкой, с иглой, параллельно длине эмбриона. Чем круче угол может использоваться для сведения к минимуму боковое движение эмбриона во время микроинъекции.
5. Управление Петри с левой рукой и микроманипулятор иглы с правом, Принесите иглы ближе как можно с нужным сайтом микроинъекции, в данном случае слуховой пузырек.
   Примечание: Слуховой пузырек можно определить как продолговатые органа кзади глаз, содержащий две небольших отдельных темные продолговатые структуры (отолиты).
6. С помощью контроллера микроманипуляции, проникают в ткани-мишени (в данном случае слуховой пузырек) таким образом, чтобы кончик иглы находится внутри везикул и придать заданного тома с помощью ножной переключатель picopump.
   Примечание: Если ткань сопротивляется проникновения, попробуйте осторожно нажав ручку микроманипуляции контроллера.
7. Чтобы освободить эмбрионы, поток E3 над поверхностью сверху вниз с помощью пипетки передачи, или закрученной блюдо, таким образом, что зародыши попадают в окружающих E3.
8. Трансфер эмбрионов восстановления блюдо E3 без MS-222 с помощью пипетки передачи.

9. Отбор эмбрионов с использованием PDMS изображений устройства

1. Простое устройство от шага 4.7 течет E3 (+ MS-222) через порт. Это может быть сделано с помощью пипетки 1000 мкл или передачи УЗК наконечник пипетки.
2. Заполните колодец с E3 + MS-222, пока устройство покрыто.
3. Доставить 4 эмбрионы вводят от шага 8.7 в каждый хорошо с помощью пипетки передачи. Эмбрионы могут быть предварительно наркотизированных желанию инкубации в E3 + MS-222 для 1-2 мин до загрузки (шаг 5.3).
4. С помощью инструмента микроманипуляции (цикл волос или аналогичные), Ориент эмбрионов на въездах визуализации каналов в желаемой ориентации (хвост первой или головой, в зависимости от используемого устройства) и частично подтолкнуть их в устройстве (рис. 4A). Это поможет привлечь их в устройство равномерно.
5. Нарисуйте E3 через устройство от порта, используя 1000 мкл пипетки или передачи пипеткой до тех пор, пока эмбрионы вовлекаются в каналы в правильную ориентацию для изображений (рис. 4B).
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы не сосать эмбрионов мимо точки треппинга, это будет ущерб эмбрионы и изменить их направленность.
6. Трансфер хорошо плита микроскоп для изображений (рис. 4 c).
7. Изображение с помощью инвертированного микроскопа флуоресцентные.
   1. Отрегулируйте масштаб, выбрав соответствующие объектива. 10 X обычно является полезным увеличение для визуализации данио рерио нейтрофилов миграции.
   2. Таким образом, чтобы каждый сигнал ясно, но не насыщенных Отрегулируйте интенсивность источника света и времени экспозиции для каждого канала.
   3. Захват изображения для каждого канала. Здесь, мы использовали Зеленый флуоресцентный белок (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Техас красный (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) и передаваемых каналов. Многоканальные изображения могут быть объединены во время пост-обработки (рис. 4В-я).

Результаты

Описанный здесь подход демонстрирует дизайн (рис. 1) и изготовление приборов для использования с 2 dpf данио рерио, используя фотолитографический (рис. 2) и мягкие литографические техники (рис. 3). Этот метод позволяет быстро?...

Обсуждение

Здесь, мы описывают использование устройств мы недавно разработали для облегчения 2 dpf данио рерио микроинъекции⁵и ввести устройство простой монтаж бесплатно агарозы для удобного отображения эмбрионов. Эти инструменты подчеркнуть полезность фотолитографический техники ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184  Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose	Sigma Aldrich	A9414-10G	For casting agarose devices
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	To anesthetize  zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish	Fisher scientific	08-757-148	For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates	MatTek	P06G-0-20-F	For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries	World Scientific Instruments	TW-100-4	For microinjection needles
Transfer pipettes	Sigma Aldrich	Z350796	For transferring zebrafish embryos
Microloader tips	Fisher scientific	E5242956003	For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	For manipulating microinjection needle
Magnetic stand	MSC	SPI - 87242624	For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope	ThermoFisher	EVOS FL	To image injected embryos
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745	For visualizing microinjecion
AutoCAD software	Autodesk		Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki